Name: Cryosectioning comunidades de leveduras para o exame de padrões de fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprenda a técnica de crioseccionamento de comunidades de leveduras para visualizar padrões de distribuição espacial de células fluorescentes. Este método utiliza fixação com metanol e microscopia de fluorescência.

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Gostaríamos de agradecer a Jonathan Cooper Lab no Fred Hutchinson Cancer Research Center for a permissão para usar seu criostato. Este trabalho foi financiado pelo NIH e do WM Keck Foundation. BM é um Gordon e Betty Moore companheiro de Vida Fundação de Pesquisa Científica. Somos gratos a Daniel Gottschling para compartilhar seu protocolo de fixação com a gente.

1. Fixação de comunidades de leveduras <ol><li> Crescer comunidades de leveduras em um filtro de membrana (por exemplo, Millipore MF filtro de membrana; Figura 2A). Este protocolo corresponde a uma comunidade típico inferior a 2x10 8 células sobre um filtro de membrana de 6 mm de diâmetro. </li><li> Utilizar um pedaço de papel Whatman 541 filtro para cobrir o fundo de um 1 cm de diâmetro bem (Figura 2B). Este papel Whatman será usado como um transportador para transferir a comunidade em fases posteriores. Adicionar 1 ml de metanol a 100% para o poço, e deixar o bem em -20 ° C para a temperatura equilibrar. </li><li> Coloque N2 líquido num dewar. Congelar comunidade em nitrogênio líquido por imersão a comunidade por pelo menos 15 segundos em N2 líquido usando uma pinça (Figura 2C). </li><li> Transferir comunidade congelado para o bem de -20 ° C de metanol (Figura 2D). Garantir que a comunidade seja mantido na horizontal quando submergindo-o no metanol.Espere 20 min. O filtro de membrana de MF começa a desintegrar-se em metanol. </li><li> Transferir comunidade usando o transportador 541 de papel de filtro Whatman partir do metanol bem para uma placa de Petri frio manteve a -20 ° C para a evaporação de metanol (Figura 2E). Ao transferir, manter a comunidade no topo da transportadora Whatman filtro e afastar gotas extras de metanol usando outro pedaço de papel Whatman grossa antes de colocar a placa de Petri frio. Isto irá assegurar que o tempo de evaporação é consistente de amostra para amostra. </li><li> Espere 4-6 horas para a evaporação até que o transportador de filtro Whatman parece seca. Evaporação insuficiente deixa metanol residual que interfere com o corte. Excesso de secagem causas rachaduras e deformações nas comunidades. </li><li> Tome o exemplo de -20 ° C congelador. Corte o papel Whatman 541 filtro não cobertos pela comunidade. </li><li> Fazer um contentor rectangular de folha de alumínio-cúbico que é suficientemente grande tal que a amostra possui pelo menos 2 mm ~ margem decada um dos lados (Figura 2F). Coloque a comunidade sobre a superfície do fundo do recipiente de folha de alumínio; cobrir imediatamente a amostra com OCT para 3 ~ 4 mm acima altura comunidade. Se importante, a orientação da amostra pode ser ajustada neste passo em relação aos lados do recipiente. Esperar 10 min. </li><li> Coloque a amostra outubro embutida em uma placa metálica em gelo seco para congelar. Armazenar as comunidades congelados a -20 ° C ou -80 ° C congelador. </li></ol> 2. Seccionamento Comunidades congelada por Fluorescência de imagem <ol><li> Ajuste a temperatura da câmara de criocorte para -25 ° C e deixar as amostras na câmara até que a sua temperatura atinge a temperatura da câmara. </li><li> Monte a amostra para um crio-montagem após a aplicação de uma gota de outubro no monte. Espalhe outubro uniformemente sobre o lado da amostra com papel de filtro Whatman exposto (fundo do recipiente), de modo que a espessura da OCT é de 2-3 mm. Vamos congelar outubro dentro da câmara antes de se criostatoctioning. Assegurar uma margem de outubro de 2-3 mm em todos os lados da amostra de ajuda a preservar a integridade das secções. </li><li> Os lados do bloco de amostras de outubro pode ser usada para alinhar a amostra. Se a amostra não está alinhada em relação à lâmina, seccionando vai começar a partir de um canto ou lado da amostra. Regular a montagem para assegurar que a lâmina corta um rosto perfeitamente vertical (ou horizontal) do bloco de amostra. </li><li> Seções típicas para comunidades de leveduras são ~ 14 um de espessura. Após o corte de uma secção, a utilizar uma lâmina de microscópio mantido à temperatura ambiente para recolher a secção, pelo que se aproximava lentamente a lâmina para o corte. A seção vai derreter e transferir para a lâmina de microscópio. Até 18 seções podem ser transferidos para um slide. </li><li> Armazenar as lâminas a baixas temperaturas, de preferência -20 ° C, antes da imagiologia. A perda de sinal é mínima quando mantidos durante uma semana a 4 ° C. Para sinal de fluorescência máxima, a imagem é de preferência feito imediatamente após o corte. </li></ol>

<ol><li>Tolker-Nielsen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+of+Microbial+Biofilm+Communities%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities.</a> Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).</li>
<li>Moller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+In+Situ+Gene+Expression+in+Mixed-Culture+Biofilms%3A+Evidence+of+Metabolic+Interactions+between+Community+Members%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)"> In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).</li>
<li>Lepp, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanogenic+Archaea+and+human+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Methanogenic Archaea and human periodontal disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).</li>
<li>Váchová, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony%3A+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).</li>
<li>Mináriková, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Gene+Expression+in+Cells+within+Yeast+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies.</a> Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).</li>
<li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+cooperation+in+engineered+yeast+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthetic cooperation in engineered yeast populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).</li>
<li>Momeni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+generates+a+unique+spatial+signature+in+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities.</a> , Submitted (2012).</li>
<li>Kiernan, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKiernan%2C+J+%22Histological+and+Histochemical+Methods%3A+Theory+and+Practice%22">Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice</a>. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4(2008).</li>
<li>Piccirillo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rim101p%2FPacC+Pathway+and+Alkaline+pH+Regulate+Pattern+Formation+in+Yeast+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies.</a> Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O procedimento aqui apresentado oferece um modo para inspeccionar a estrutura interna das comunidades de leveduras. O passo de fixação faz com que o metanol colónia de levedura rígida 8 e preserva a integridade da colónia, no entanto, também provoca 8 encolhimento que devem ser tidos em conta na interpretação dos resultados. Se costuma ver em torno de 30% de encolhimento da altura de colônias de leveduras, em comparação com as colônias diretamente embutidos em outubro sem fixar 9. <p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> O metanol 100% </td><td> JT Baker </td><td> 9070-01 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek Composto outubro </td><td> Andwin Científico </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Whatman Grau No. 541 Papel Filtro Quantitativo </td><td> Whatman </td><td> 1541-047 </td><td></td></tr><tr><td> Millipore-MF filtro de membrana </td><td> Millipore </td><td> HAWP04700 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Leica </td><td> CM 1510 S </td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning comunidades de leveduras para o exame de padrões de fluorescência

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Micróbios geralmente vivem em comunidades. A organização espacial das células dentro de uma comunidade é acreditado para impactar a sobrevivência e função da comunidade 1. Ópticos técnicas de seccionamento, incluindo microscopia confocal e de dois fótons, têm se mostrado útil para observar a organização espacial das comunidades de bactérias e archaea 2,3. Uma combinação de imagem confocal e seccionamento física de colónias de levedura revelou a organização interna de celas 4. No entanto, seccionamento óptico direto em microscópio confocal ou dois fótons foi apenas capaz de atingir algumas camadas de células profundas em colônias de leveduras. Esta limitação é provavelmente devido à dispersão de luz forte a partir de células de levedura 4. Aqui, apresentamos um método baseado na fixação e cryosectioning para obter uma distribuição espacial de células fluorescentes dentro de comunidades de Saccharomyces cerevisiae. Usamos metanol como agente fixadorpara preservar a distribuição espacial das células. Comunidades fixos são infiltradas com OCT composto, congelados, e cryosectioned num criostato. Imagens de fluorescência das seções revela que a organização interna das células fluorescentes dentro da comunidade. Exemplos de comunidades de leveduras consistindo em estirpes que expressam as proteínas de vermelho e verde fluorescente demonstrar as potencialidades do método cryosectioning para revelar a distribuição espacial de células fluorescentes, bem como a expressão de genes dentro de colónias de levedura 2,3. Mesmo que o foco tem sido sobre as comunidades de Saccharomyces cerevisiae, o mesmo método pode ser potencialmente aplicada a examinar outras comunidades microbianas.

Imagens de fluorescência de secções transversais verticais das comunidades de levedura contendo vermelho-verde e marcada com populações competitivos 6 são mostrados na Figura 3. Essas comunidades consistem em duas linhagens de levedura prototróficos e sua competição por recursos compartilhados, incluindo espaço, leva a colunar padrões 7, como mostrado em suas verticais transversais. As resoluções para baixo para uma única célula pode ser resolvido em secções transversais. F...

Nós apresentamos um protocolo para congelamento e cryosectioning comunidades de leveduras para observar padrões internos de células fluorescentes. O método baseia-se na fixação de metanol e OCT-incorporação de preservar a distribuição espacial das células sem inactivar proteínas fluorescentes dentro de uma comunidade.

Cryosectioning comunidades de leveduras para o exame de padrões de fluorescência

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

O objetivo geral do experimento a seguir é produzir seções transversais de comunidades de leveduras para examinar a distribuição espacial de diferentes populações de células fluorescentes dentro de uma comunidade. Isso é conseguido primeiro congelando a comunidade e depois fixando-a usando metanol para preservar a distribuição espacial das células na comunidade. Como segunda etapa, o metanol é evaporado para permitir a penetração do composto OCT incorporado.A comunidade incorporada é então congelada em preparação para o crioseccionamento. Em seguida, um crio ome seções. A comunidade e as seções transversais podem ser visualizadas sob um microscópio de fluorescência Os resultados são obtidos que mostram a distribuição espacial das populações de células fluorescentes dentro de uma comunidade.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o corte óptico, é que ela revela a distribuição espacial das populações nas profundezas dessas comunidades. Para iniciar este procedimento, cultive comunidades de leveduras em um filtro de membrana. Este protocolo corresponde a uma comunidade típica de menos de duas vezes 10 elevado às oito células em um filtro de membrana de se

cryosectioning-yeast-communities-for-examining-fluorescence-patterns

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Uma abordagem robusta para monitorar a entrega de organelas para a luz ácida do vacúolo levedura para a degradação e reciclagem é descrito. O método baseia-se na rotulagem específica de organelas-alvo com uma geneticamente codificado fluorescência dupla emissão de pH biosensor, e visualização de células individuais usando a microscopia de fluorescência.

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Este protocolo descreve o procedimento experimental para a realização de...

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Este manuscrito descreve um método fácil de usar e criofixação de baixo custo para a visualização de células em suspensão por meio de microscopia electrónica de transmissão.

Congelamento Plunge: Uma ferramenta para os estudos ultra-estruturais e de imunolocalização de células em suspensão em Microscopia Eletrônica de Transmissão

Aqui, nós apresentamos a imagem latente da viver-pilha que é um método não-tóxico da microscopia que permita investigadores de estudar o comportamento da proteína e a dinâmica nuclear em pilhas vivas do fermento da fissão durante o mitose e o meiosis.

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Apresentamos um protocolo para a preparação de lamella de espécimes biológicos congelados por micromaquingia de feixe de íons focado em crio-pia para estudos estruturais de alta resolução de macromoléculas in situ com tomografia crio-elétron. O protocolo apresentado fornece diretrizes para a preparação de lamellae de alta qualidade com alta reprodutibilidade para caracterização estrutural de macromoléculas dentro do Saccharomyces cerevisiae.

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Isolamento de Leveduras culturais e moldes de solos para investigar estrutura populacional fúngica

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Levedura de fissão como plataforma para triagens de drogas antibacterianas direcionadas a proteínas do citoesqueleto bacteriano

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Montagem e quantificação de coculturas combinando levedura heterotrófica com cianobactérias fototróficas secretoras de açúcar

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Manipulação e Análise de Processos Dependentes do Ciclo Celular em Leveduras de Brotamento

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