Cryosectioning comunidades de leveduras para o exame de padrões de fluorescência

O objetivo geral do experimento a seguir é produzir seções transversais de comunidades de leveduras para examinar a distribuição espacial de diferentes populações de células fluorescentes dentro de uma comunidade. Isso é conseguido primeiro congelando a comunidade e depois fixando-a usando metanol para preservar a distribuição espacial das células na comunidade. Como segunda etapa, o metanol é evaporado para permitir a penetração do composto OCT incorporado.

A comunidade incorporada é então congelada em preparação para o crioseccionamento. Em seguida, um crio ome seções. A comunidade e as seções transversais podem ser visualizadas sob um microscópio de fluorescência Os resultados são obtidos que mostram a distribuição espacial das populações de células fluorescentes dentro de uma comunidade.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o corte óptico, é que ela revela a distribuição espacial das populações nas profundezas dessas comunidades. Para iniciar este procedimento, cultive comunidades de leveduras em um filtro de membrana. Este protocolo corresponde a uma comunidade típica de menos de duas vezes 10 elevado às oito células em um filtro de membrana de seis milímetros de diâmetro em um freezer de 20 graus Celsius negativos.

Para preservar um maior grau de fluorescência, use um pedaço de papel de filtro watman 5 4 1 para cobrir a parte inferior de um centímetro de diâmetro. Bem, este papel de filtro é usado como um transportador para transferir a comunidade Em estágios posteriores, adicione um mililitro de menos 20 graus Celsius, 100% de metanol ao poço e deixe o poço a menos 20 graus Celsius para que a temperatura se equilibre. Agora, congele a comunidade de leveduras usando uma pinça para mergulhar o filtro de membrana com a comunidade em nitrogênio líquido por pelo menos 15 segundos.

Em seguida, transfira a comunidade congelada para o poço com menos 20 graus Celsius. O metanol no freezer garante que a comunidade seja mantida na horizontal. Ao submergi-lo no metanol, aguarde 20 minutos, o filtro de membrana começará a se desintegrar no metanol.

Após 20 minutos, transfira a comunidade usando o papel de filtro watman transportador do poço de metanol para uma placa de Petri fria mantida a menos 20 graus Celsius. Ao transferir, mantenha a comunidade em cima do filtro Watman da transportadora. Retire as gotas extras de metanol usando outro pedaço de papel watman grosso antes de colocá-lo na placa de Petri fria.

Isso garantirá que o tempo de evaporação do metanol seja consistente de amostra para amostra. Espere de quatro a seis horas para que o metanol evapore. Acabar com a evaporação no momento certo é crucial para o sucesso deste procedimento.

Para evitar a secagem excessiva da amostra, verifique o estado da comunidade de leveduras periodicamente durante a evaporação, enquanto o metanol está evaporando. Faça um recipiente retangular cúbico de folha de alumínio que seja grande o suficiente para que a amostra tenha pelo menos cerca de dois milímetros de margens de cada lado. Adicione uma gota de OCT ao fundo deste recipiente para garantir que a amostra seja cercada por OCT de todos os lados.

Quando a evaporação estiver completa, retire a amostra do congelador de 20 graus Celsius negativos. Corte as partes do papel de filtro não cobertas pela comunidade de leveduras. É importante executar esta etapa rapidamente.

Para evitar a secagem excessiva da amostra. Coloque a comunidade na superfície inferior do recipiente de papel alumínio e cubra imediatamente a amostra com OCT a três a quatro milímetros acima da altura da comunidade. Aguarde 10 minutos.

Finalmente, coloque a amostra embebida em OCT em uma placa metálica sobre gelo seco para congelar as comunidades congeladas a menos 20 graus Celsius ou menos 80 graus Celsius. Em preparação para seccionar comunidades congeladas, defina a temperatura da câmara de seção criogênica para menos 25 graus Celsius. Deixe as amostras na câmara até que sua temperatura atinja a temperatura da câmara.

Em seguida, remova o papel alumínio da amostra e corte o excesso de OCT. Aplique uma gota de OCT em um suporte criogênico e monte o sample no suporte criogênico. Espalhar o OCT uniformemente no lado da amostra com papel de filtro watman exposto, de modo a que a espessura do OCT seja de dois a três milímetros.

Garantir uma margem OCT de dois a três milímetros em todos os lados da amostra ajuda a preservar a integridade das seções. Deixe o OCT congelar dentro da câmara do criostato antes de seccionar. Use os lados do bloco de amostra OCT para alinhar a amostra em relação à lâmina.

Se a amostra não estiver alinhada em relação à lâmina, o corte começará a partir de um canto ou lado da amostra. Ajuste o suporte para garantir que a lâmina corte uma face perfeitamente vertical do bloco de amostra. As seções típicas para comunidades de leveduras têm cerca de 14 micrômetros de espessura.

Depois de cortar uma seção, use uma lâmina de microscópio mantida em temperatura ambiente para coletar a seção. Ao mover lentamente a lâmina para a seção de corte, a seção derreterá e será transferida para o microscópio. Deslize até 18 seções podem ser transferidas para um slide.

Armazene as lâminas em temperaturas frias, de preferência 20 graus Celsius negativos antes de fazer a imagem. A perda de sinal é mínima quando mantida por uma semana a quatro graus Celsius para sinal fluorescente máximo. A imagem deve ser feita imediatamente após a secção.

Imagens de fluorescência representativas de seções transversais verticais de comunidades de leveduras cultivadas em condições idênticas são mostradas aqui. A comunidade consiste em duas cepas fototrópicas de visier marcadas com as proteínas fluorescentes. M cherry visualizado como vermelho e Y-E-G-F-P visualizado como competição verde por recursos compartilhados, incluindo espaço, leva a padrões colunares conforme exibido em suas seções transversais verticais.

As resoluções até uma única célula podem ser resolvidas em seções transversais. Esta figura compara as seções transversais obtidas com a fixação de metanol mostrada no painel inferior e sem a fixação de metanol mostrada no painel superior. O sinal fluorescente é preservado em seções da comunidade sem fixação, mas a integridade da comunidade é comprometida.

Como resultado, algumas células flutuam ao redor da borda da seção e o rendimento geral é menor em comparação com comunidades fixas. A fixação de metanol mantém as células da comunidade unidas, mas causa encolhimento, conforme observado na diminuição da altura da comunidade. Esta figura mostra seções transversais verticais representativas de campo claro e fluorescência de uma comunidade de leveduras consistindo de duas cepas Protopic de visier teed com proteínas fluorescentes DS RED e YFP.

As células no topo da comunidade formam uma coroa que parece distinta das células-mãe, caracterizada por uma dispersão mais forte em campo claro e fluorescência mais brilhante. Esses padrões são consistentes com os padrões relatados de diferenciação em colônias de leveduras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a criossecção para examinar a fluorescência su padrões espaciais dentro das comunidades de leveduras.