Eletroporação do rombencéfalo rastrear Trajetórias axonal e Metas Synaptic no embrião de galinha

O objetivo geral deste procedimento é rotular subconjuntos específicos de neurônios no cérebro posterior de pintinhos e traçar suas trajetórias axonais e alvos. Isso é feito abrindo primeiro uma pequena janela oval no centro de um dia embrionário.2.75. Os plasmídeos de DNA do ovo são injetados no lúmen do cérebro posterior.

Em seguida, o cérebro posterior é eletroporado unilateralmente para permitir a expressão das construções no grupo neuronal desejado e os ovos incubados. Finalmente, o tronco encefálico é dissecado de todo o embrião para preparação de montagem plana ou seccionamento de tecido. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram projeções axonais e alvos sinápticos na parte posterior, cérebro e cerebelo em vários estágios de desenvolvimento por meio de coloração imunofluorescente e análise microscópica.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurobiologia do desenvolvimento, como como células neuronais específicas projetam seus axônios e formam conexões sinápticas durante o desenvolvimento embrionário. Para se preparar para a eletroporação, incube-os a 37 a 38 graus e meio Celsius por 65 a 70 horas até atingirem o estágio 16 a 17. Enquanto os ovos estão incubando, puxe os capilares de vidro que conectam eletrodos de ouro dobrados em forma de L com um suporte adaptador ao narrador de pulso.

Defina os parâmetros de eletroporação para 25 volts, cinco números de pulso, comprimento de pulso de 45 milissegundos e intervalos de pulso de 300. Prepare uma pipeta bucal, uma seringa de 10 mililitros, tiras de paraforme, uma escova macia, uma tesoura de dissecação afiada e 25 mililitros de PBS estéril. Prepare uma mistura adequada de plasmídeos de DNA e adicione corante verde rápido para visualizar o DNA injetado.

Quando os ovos atingirem o estágio de desenvolvimento adequado, remova-os da incubadora e mantenha-os na posição horizontal. Use 70% de etanol para limpar as cascas dos ovos. Manuseie um ovo de cada vez para minimizar a exposição embrionária.

Hora de arejar com as pontas da tesoura. Faça um furo no poste do ovo e, com a seringa, retire de três a quatro mililitros de albumina. Usando a tesoura de dissecação, abra uma pequena janela oval no pólo horizontal superior da casca do ovo.

Durante todo o processo, pingue algumas gotas de PBS em cima do embrião para evitar o ressecamento. Usando uma pipeta bucal, carregue uma pequena quantidade da mistura de DNA no capilar de vidro. Em seguida, coloque o embrião com sua visão indireta da extremidade posterior.

Em seguida, segurando o capilar em cerca de 45 graus, penetre no cérebro traseiro do bebê. Não remova nenhuma membrana ao redor do embrião sem formar bolhas de ar. Expire cuidadosamente para injetar a solução de DNA no lúmen do cérebro posterior.

A solução se espalhará anteriormente imediatamente após a injeção de DNA. Coloque os eletrodos paralelos nas posições cerebrais traseiras AP e DV direcionadas com precisão. Sem tocar o coração, empurre os eletrodos levemente ventralmente e pulse o eletro.

Os eletrodos devem ser cobertos com bolhas para indicar condutividade elétrica, remova cuidadosamente os eletrodos e pingue algumas gotas de PBS para resfriar o embrião e remover as bolhas. Use uma tira de perfil para selar a abertura do ovo adequadamente para evitar o ressecamento durante a incubação com uma escova macia e PBS lave os eletrodos, coloque o ovo na incubadora pelo tempo desejado. A sobrevivência dos embriões é de aproximadamente 90% dois a três dias após a eletroporação e reduz até 50% 12 dias após a eletroporação.

Para fazer preparações de montagem plana do cérebro posterior, disseque cuidadosamente o embrião, separando-o das membranas e vasos sanguíneos circundantes. Coloque o embrião em uma pequena placa de Petri revestida de silicone contendo PBS com o embrião voltado para dorsalmente. Use pinos de tungstênio para prendê-lo ao prato.

Em seguida, usando um capilar de vidro afiado. Faça uma fenda dorsal na placa do telhado traseiro com pinças afiadas e microtesouras. Segure a parte superior da cabeça e puxe o tecido cerebral posterior com muito cuidado do rostral ao toddle.

Após a separação do rombencéfalo, remova os tecidos ventrais restantes. Incube o cérebro posterior em solução de aldeído paraforme a 4% ou PFA por uma a duas horas em temperatura ambiente. Em seguida, lave-o com PBT para remover o PFA.

Depois de seguir a preparação de imunofluorescência descrita no protocolo de texto, coloque o rombencéfalo voltado dorsalmente em uma lâmina de vidro. Adicione meio de montagem fluorescente no cérebro posterior e use capilares de vidro ou agulhas de tungstênio para achatar o cérebro posterior na lâmina. Adicione uma pequena quantidade de graxa em cada canto para evitar que o tecido seja comprimido pela lamínula.

Coloque cuidadosamente uma lamínula no topo do cérebro posterior, evitando bolhas de ar para aderência. Adicione esmalte nas bordas da tampa do vidro. Seções criogênicas do tronco encefálico podem ser realizadas em qualquer estágio de desenvolvimento, mas após E 6.5.

Eles devem ser o método preferido devido à dificuldade de visualização de axônios no embrião de montagem plana, que se torna muito espesso. Além disso, a demonstração da sinapse requer a secção do tecido e a visão de alta ampliação ao microscópio. Para preparar uma amostra para a seção criogênica, disseque o embrião e remova todos os tecidos ao redor do cérebro.

Enxágüe com PBS. Em seguida, use microtesouras e pinças afiadas para cortar o embrião na região do mimo da medula. Faça uma incisão larga entre o cerebelo e o mesencéfalo e remova todo o tronco encefálico.

O tecido deve conter a medula da ponte e o cerebelo. No exemplo a seguir, um elemento intensificador que é expresso no subgrupo DA um subgrupo de neurônios inter no cérebro posterior de verificação foi clonado a montante de Cree recombinase e co-eletroporado com um plasmídeo repórter GFP citoplasmático dependente de Cree. Uma preparação de montagem plana no estágio E 4.5 revela dois padrões de projeção axonal ascendente contralateral para mapear as projeções axonais de DA um interneurônios em estágios posteriores de desenvolvimento.

Uma fita repórter GFP incondicional pré-con foi clonada entre dois braços piggyback, junto com o intensificador de uma creen A TOH e o vetor de transposição. Usando essa estratégia, o pré-paço C eletroporado condicional MG FP é integrado aos cromossomos de pintinhos e, consequentemente, o de parada é removido apenas nos neurônios D um, permitindo a expressão prolongada de GFP. Em DA uma célula.

A forma mesilada da GFP a amarra à membrana de tal forma que está localizada ao longo da membrana axonal, em vez de ser diluída no citoplasma. Em hastes cerebrais coletadas em E 13,5 e analisadas em cortes sagitais. Descobriu-se que os axônios DA um se acumulam no cerebelo e se estendem em direção à camada granular externa ou EGL, que é marcada por células positivas ZI one.

Alvos sinápticos de axônios D one no cerebelo também foram analisados. Os embriões E 2,75 foram eletroporados com o plasmídeo repórter da proteína da vesícula sináptica dois, juntamente com um intensificador H one Cree e as transposições piggyback. Este método permite a expressão do repórter GFP no DA pré-sináptico um terminal axonal.

O cerebelo foi seccionado em E 13,5 e corado com o marcador pré-sináptico geral taman sináptico, bem como com calbindina que rotula a camada do biquíni. Uma visão de alta ampliação da seção demonstra SV duas vesículas sinápticas positivas para GFP em várias regiões cerebelares, incluindo a camada do biquíni. Este resultado revela as conexões sinápticas de DA um cérebro posterior em neurônios inter no cerebelo.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como eletrooperar o DNA na Hein aviária no segundo dia embrionário ponto 75, a fim de rotular especificamente um subconjunto de células neuronais. Este procedimento permite acompanhar as projeções axonais e as conexões sinápticas das células neuronais marcadas em vários estágios de desenvolvimento.