Multi-unidade Métodos de gravação para caracterizar a atividade neural no Locust ( Schistocerca Americana) Circuitos olfatórias

O objetivo geral deste procedimento é registrar a atividade neural de várias unidades revogada pelo odor dos três primeiros centros de processamento de sinal da via olfativa do inseto. Isso é feito primeiro restringindo um gafanhoto em uma câmara projetada sob medida e estabilizando uma de suas antenas para registros eletrofisiológicos. O segundo passo é fabricar um microeletrodo de vidro e inseri-lo na base de um sol para monitorar as respostas evocadas pelo odor.

Ao lado para registrar a atividade neural do cérebro do gafanhoto. Um procedimento de dissecção em várias etapas é seguido para expor o tecido neural, que processa a entrada dos neurônios sensoriais olfativos. A etapa final envolve a colocação apropriada dos feixes de múltiplos eletrodos para registrar a atividade neural do conjunto do lofanhoto e do lóbulo da antena e do corpo do cogumelo.

Em última análise, os métodos de registro extracelular demonstrados aqui são usados para caracterizar as respostas evocadas por odor nos três primeiros centros de processamento ao longo da via olfativa do inseto. Embora este método tenha sido usado para caracterizar a resposta neurológica evocada por odor em um sistema olfativo de invertebrados relativamente simples, ele também pode ser adaptado para examinar a atividade do conjunto em outros sistemas neurais. A demonstração visual desse método é crítica porque alguns aspectos-chave desse procedimento, como a colocação do eletrodo e algumas etapas de dissecção, são muito difíceis de aprender.

Além disso, os métodos são principalmente qualitativos e diferentes laboratórios os aperfeiçoaram de maneira diferente ao longo do tempo. Para iniciar este procedimento, selecione um gafanhoto adulto jovem de ambos os sexos com asas totalmente crescidas, mas antes do estágio de acasalamento de uma colônia lotada. Em seguida, contenha o gafanhoto amputando suas pernas.

Sele os locais de amputação com adesivo tecidual. Em seguida, prenda o gafanhoto na câmara projetada sob medida com um pequeno pedaço de fita isolante enrolado em torno de seu tórax. Sob um microscópio de dissecação, faça um sulco raso na plataforma de cera para colocação da antena.

Coloque a antena na ranhura e estabilize-a usando cera bati nas duas extremidades da antena. Depois disso, insira um eletrodo de aterramento no tórax. Use cera Batik para selar o local da incisão e manter o fio terra no lugar.

Em seguida, coloque a antena de gafanhoto estabilizada sob um microscópio estéreo em uma mesa de isolamento de vibração. Conecte as linhas de saída dos frascos de odor ao tubo de entrega de odor. Posicione o tubo de entrega de odor a poucos centímetros da antena, os vapores de odor fornecidos são removidos por um funil de vácuo, colocado aproximadamente 10 centímetros atrás da antena de gafanhoto.

Em seguida, fabrique eletrodos de vidro usando um capilar de vidro silícico com uma micropipeta polar, preencha o eletrodo de vidro com solução salina de gafanhoto. Em seguida, coloque o eletrodo de vidro em um suporte de micropipeta conectado a um micromanipulador motorizado. Certifique-se de que a base do syn de gravação esteja claramente visível ao microscópio.

Insira suavemente o eletrodo na base de um syn. Posteriormente, amplifique o sinal 10.000 vezes. Usando um amplificador CA.

Filtre o sinal entre 0,3 e 10,0 kilohertz e adquira-o a uma taxa de amostragem de 15 kilohertz. Usando um sistema de aquisição de dados, quando o eletrodo é posicionado adequadamente, a atividade neural espontânea pode ser detectada. As respostas evocadas por estímulos podem ser monitoradas fornecendo um pulso de odor através do tubo de entrega de odor.

Posicionado próximo à antena e rastreando a mudança na atividade extracelular, seguiu os procedimentos de contenção descritos anteriormente. Posicione o gafanhoto em uma câmara personalizada. Comece o processo de dissecação construindo um copo de cera ao redor da cabeça do gafanhoto.

Construa duas torres de cera em cada lado da cabeça do gafanhoto, alcançando até a altura das antenas. Em seguida, insira cada antena através de um pequeno pedaço de tubo de polietileno que está firmemente encaixado em uma junta de borracha. Em seguida, prenda as juntas às torres de cera de forma que o tubo de plástico possa deslizar livremente para perto ou para longe da base da antena, evitando que a antena se mova.

Em seguida, sob o microscópio, comece a construir um copo de cera ao redor da cabeça do gafanhoto para permitir a perfusão salina durante e após o procedimento de dissecção. O copo de cera deve começar logo acima das partes bucais, abranger as duas torres de cera e se estender além dos olhos compostos. Uma vez que o copo de cera esteja totalmente construído, prenda a base das antenas na extremidade inferior do tubo de plástico usando resina epóxi.

Isso garantirá que as antenas sejam mantidas no lugar mesmo após a remoção da cutícula ao redor. Mantenha o copo de cera cheio de solução salina a partir deste ponto. Agora, remova a região retangular central entre os dois.

Uma antena. Posteriormente, remova a cutícula nas regiões vizinhas sem perturbar os olhos compostos ou a cutícula na base das antenas. Usando uma pinça fina, remova suavemente os sacos de ar e os corpos gordurosos ao redor do cérebro.

O cérebro do gafanhoto agora deve estar claramente visível. As regiões cerebrais que processam a informação olfativa estão situadas entre as duas. Uma antena puxa suavemente o intestino e corta-o com uma tesoura fina.

Em seguida, remova as asas e faça uma pequena incisão no abdômen logo acima do reto. Remova o intestino puxando o intestino posterior com uma pinça grossa. Esta etapa garante que o movimento intestinal não desestabilize a preparação.

Para evitar vazamento de solução salina. Amarre o abdômen logo anterior ao local da incisão com fios de sutura. Em seguida, use uma pequena plataforma feita de um laço de arame fino revestido com uma fina camada de cera para elevar o cérebro e estabilizá-lo para eletrofisiológico.

A gravação do cérebro é protegida por uma bainha semitransparente, que deve ser removida antes das gravações. Para enfraquecer a bainha, drene parcialmente o copo de cera e espalhe cuidadosamente uma pequena quantidade de protease sobre a superfície do cérebro. Após aproximadamente cinco a 10 segundos de aplicação da enzima, enxágue bem o cérebro com solução salina.

Em seguida, aperte e puxe suavemente a bainha para cima com uma pinça super fina para rasgá-la e expor os locais de gravação. Neste procedimento, coloque a preparação de gafanhotos sob um microscópio estéreo em uma mesa de isolamento de vibração. Mantenha uma taxa de perfusão salina constante de cerca de 40 mililitros por hora.

Durante todo o experimento, use um fio de cloreto de prata imerso no copo de cera cheio de solução salina como eletrodo de aterramento. Prepare a configuração de entrega de odor semelhante ao experimento de gravação de sensor único. Antes do experimento, galvanize os eletrodos com ouro para atingir as impedâncias na faixa de 200 a 300 quilos.

Use uma sonda de silício de 16 canais para gravações dos neurônios principais. Sob o microscópio. Posicione o eletrodo próximo à superfície de um lóbulo de antena e inserido suavemente no tecido usando um manipulador micrométrico manual em um local de gravação ideal, os sinais extracelulares serão captados por vários canais de gravação e terão uma alta relação sinal-ruído.

Para gravações de células Kenyon, um tero de fio trançado feito sob medida é usado para galvanizar o tero seguindo os procedimentos de galvanoplastia. A sonda de silício então coloca o tero na superfície do corpo do cogumelo. Como o Samara das células quenianas está restrito à camada superficial dessa região, os registros de neurônios principais e células quenianas podem ser feitos simultaneamente a partir da mesma preparação de gafanhotos.

Depois de identificar o local de gravação, aguarde pelo menos 15 minutos para permitir a estabilização dos eletrodos. Em seguida, adquira o sinal extracelular a 15 kilohertz. Filtre-o entre 0,3 a seis kilohertz e amplifique-o usando um amplificador CA de 16 canais, tanto espontâneo quanto evocado por estímulo.

A atividade neural de várias unidades de neurônios de projeção no lobo de uma antena pode ser observada. Traços brutos de voltagem extracelular mostrando respostas de um neurônio receptor olfativo a dois odores diferentes. Dois etanol octal e um H são mostrados aqui.

Um traço extracelular representativo de uma gravação de lóbulo de antena de várias unidades é mostrado aqui. Os potenciais de ação ou picos de amplitudes variadas originados de diferentes neurônios principais podem ser observados neste traço de voltagem. Observe que um pulso de odor de quatro segundos foi aplicado durante o período de tempo indicado pela caixa cinza.

Um exemplo de registro extracelular do corpo do cogumelo é mostrado aqui. Ao contrário dos neurônios receptores olfativos e dos neurônios principais, as células Kenyon no corpo do cogumelo inseto têm menor atividade basal e respondem aos odores de maneira esparsa e seletiva. Para isolar as respostas de uma única unidade dessas gravações de várias unidades, realizamos um procedimento de classificação de pico usando software publicado de maneira offline.

Exemplos de classificação de neurônios principais e células quenianas são mostrados aqui Depois de assistir a este vídeo. Deve ter uma boa compreensão de como realizar gravações extracelulares de várias unidades para caracterizar a atividade neural do conjunto nos três primeiros centros olfativos ao longo da via olfatória de inserção.