Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

Mudanças moleculares dependentes experimentadas nos neurônios são essenciais para a capacidade do cérebro de se adaptar em resposta a desafios comportamentais. Um método de imagem in vivo de dois fótons é descrito aqui que permite o rastreamento de tais mudanças moleculares em neurônios corticais individuais por meio de repórteres geneticamente codificados. Um dos genes dependentes experientes bem estabelecidos é a proteína ou arco associado ao citoesqueleto regulado pela atividade.

A transcrição do ARC é rápida e altamente induzida pela intensificação da atividade neuronal Para permitir o exame da expressão do arco em neurônios vivos por duas microscopias fotográficas, usamos uma linha de camundongo knockin na qual um repórter GFP é colocado sob o controle do promotor do arco endógeno. Este protocolo descreve as preparações cirúrgicas e procedimentos de imagem para rastrear padrões de expressão de GFP de arco dependente experientes em conjuntos neuronais no animal vivo. Primeiro, descreveremos a preparação animal necessária para esta técnica.

Um animal arc GFP será submetido a uma cirurgia na janela craniana e se recuperará da cirurgia por aproximadamente duas semanas. A qualidade da janela craniana é então verificada e, se os neurônios puderem ser visualizados através dela, o animal é colocado em um ambiente aquático até o início dos experimentos comportamentais e de dois fótons. Esses animais são então repetidamente fotografados por duas microscopias fotográficas.

Depois que os paradigmas comportamentais desejados forem concluídos ao longo de vários dias, limpe todas as ferramentas em um esterilizador de esferas quentes. Antes da cirurgia asséptica, limpe o local da cirurgia com etanol a 70% e coloque panos limpos. Anestesiar o animal com solução de Everton a 1,2% administrada a 0,02 mililitros por grama intraperitoneal.

Verifique o nível de anestesia usando pinças de cauda ou dedo do pé para garantir a sedação total. Cubra os olhos do animal com pomada oftálmica estéril e injete dexametasona 0,2 miligramas por quilograma e carprofeno cinco miligramas por quilograma por via subcutânea. Raspe o cabelo sobre o crânio entre as orelhas e esterilize a pele com esfoliante Betadine e três cotonetes alternados de 70% de etanol Monte o animal em um estágio de cirurgia estereotáxica com barras de ouvido com uma almofada de aquecimento de circulação de água abaixo do animal ajustada a 37 graus.

Verifique regularmente os níveis de anestesia do animal e complemente a dose original do anestésico conforme necessário. Injete 200 microlitros de 0,5% de marcaína sob a pele do couro cabeludo para anestesiar a área, incisar a pele e remover a aba da pele sobre o crânio. Remova o periósteo e seque a área com cotonetes limpos.

Use uma broca odontológica de alta velocidade com uma broca de 0,5 milímetro para delinear suavemente um círculo de três a cinco milímetros de diâmetro sobre a região do cérebro de interesse, dependendo de suas necessidades. Molhe periodicamente o local de perfuração com solução salina estéril a 0,9% e limpe a poeira óssea com cotonetes limpos. Se o osso sangrar, use espuma de gel pré-embebida em solução salina estéril para enxugar o sangramento e espere que ele pare.

Quando a última camada óssea for atingida, levante e remova a ilha óssea com uma pinça de ponta fina. Você pode encontrar anexos durais na prateleira inferior do osso. Se a sua janela cruzar a sutura óssea, elas devem ser removidas com cuidado.

À medida que o retalho ósseo é levantado, role a espuma úmida e gel suavemente sobre a dura-máter exposta para limpar sua superfície e aguarde o desaparecimento do sangramento dural. Se a sua região de interesse estiver em um local com dura-máter particularmente espessa, pode ser necessário remover a dura-máter acima. Se for esse o caso, separe suavemente a dura-máter da PIA abaixo com uma pinça muito fina.

Faça uma pequena incisão na dura-máter levantada com outro par de pinças finas. Em seguida, segure as bordas cortadas e divida suavemente a dura-máter. A dura-máter é fina, mas forte, portanto, tome cuidado para não cortar o cérebro com as bordas intactas da dura-máter.

Ao trabalhar para trás e para longe de sua região de interesse, lave a área generosamente com LCR A estéril ou solução salina estéril. Se o crânio ao redor se curvar significativamente ao redor da dura-máter ou pia exposta, use adesivo de célula rápida para preencher os espaços que não fariam contato próximo com a lamínula da tampa da janela em regiões que não serão fotografadas. Em seguida, coloque uma lamínula de vidro estéril suavemente sobre a dura-máter ou pia.

Use gel acrílico Sano para cobrir o adesivo de elastômero e as bordas do vidro. Lamínula. Cubra todo o crânio exposto com gel de cianoacrilato Sano ou uma mistura maluca de cola e cimento dental.

Incorpore uma barra de fixação de cabeça de metal feita sob medida na extremidade oposta do crânio. Devolva o animal a uma câmara de recuperação quente após uma injeção intraperitoneal de cetoprofeno cinco miligramas por quilograma para controle da dor. Continue o analgésico por dois dias após a cirurgia.

Após duas semanas de recuperação pós-operatória, anestesiar o animal com flúor ISO. 5% para indução, 1,5% para manutenção. Monte-o em um estágio de microscópio personalizado com uma estrutura de fixação da cabeça e verifique a clareza óptica da janela craniana.

Sob iluminação com luz azul, a clareza dos vasos sanguíneos da superfície do cérebro é altamente indicativa da qualidade da janela craniana. Se suas bordas estiverem bem definidas, é provável que a janela seja utilizável. Antes de iniciar um protocolo comportamental, o animal deve ser mantido em um ambiente de gaiola doméstica consistente para minimizar a variação do dia-a-dia.

No arco basal, os níveis de expressão de GFP iniciam o treinamento comportamental ou os paradigmas de estimulação ambiental, dependendo da região cerebral de interesse. Por exemplo, os animais podem ser expostos a diferentes ambientes visuais durante dias consecutivos para obter imagens de populações distintas de neurônios no arco do córtex visual, a fluorescência GFP nos neurônios normalmente atinge seu nível máximo duas horas após a estimulação. A linha do tempo experimental pode ser otimizada para facilitar a detecção da expressão de ARC GFP em neurônios em seus níveis máximos de fluorescência.

Após a conclusão de uma sessão de treinamento comportamental ou estimulação ambiental, anestesie o animal com flúor ISO 5% para indução, 1,5% para manutenção. Monte o animal no estágio de microscópio feito sob medida com estrutura de fixação da cabeça. Sob o microscópio de dois fótons, a posição da cabeça do animal é fixada à estrutura de fixação da cabeça que se conecta diretamente ao palco usando a barra de metal implantada no crânio.

O flúor ISO e o oxigênio são continuamente fornecidos ao camundongo por meio de um cone nasal. A temperatura corporal é mantida usando uma almofada de aquecimento. Certifique-se de que os detectores do microscópio estejam protegidos da luz ambiente.

Ao realizar a varredura a laser de dois fótons em uma sala escura, use uma lente de imersão em água de abertura numérica de 20 x ou 25 x 1,05 para obter imagens. Primeiro, sob iluminação de epifluorescência, adquira uma imagem dos padrões dos vasos sanguíneos superficiais sobre a região cerebral de interesse com uma câmera CCD. Para alinhamento futuro da imagem, inicie a varredura a laser de dois fótons para adquirir uma pilha de imagens 3D.

O comprimento de onda de excitação do laser de dois fótons é definido em 920 nanômetros e a potência é definida em aproximadamente 50. A fluorescência emitida por miliwatts é detectada simultaneamente em um arco de canal verde e vermelho. A fluorescência GFP aparece apenas no canal verde, enquanto a autofluorescência tecidual aparece em ambos os canais.

As pilhas de imagens típicas têm dimensões de aproximadamente 320 por 300, 20 por 100 micrômetros, uma resolução horizontal de 0,5 micrômetros por pixel e uma resolução vertical de três micrômetros por pixel. Depois de adquirir a pilha de imagens, devolva o animal à sua gaiola de origem. Não perturbe o animal até a próxima sessão comportamental e de imagem.

Repita o comportamento e o procedimento de imagem ao longo dos dias, conforme desejado. Use a imagem do vaso sanguíneo da superfície cerebral previamente adquirida para se orientar de volta ao mesmo local de imagem. A força dessa técnica é que ela permite o exame de alterações na expressão gênica do arco no mesmo conjunto de neurônios ao longo de vários dias.

No animal vivo. Os métodos HISTOQUÍMICOS padrão podem atingir a resolução de uma única célula, mas não podem rastrear alterações na expressão gênica nos mesmos neurônios ao longo de vários dias. Outras técnicas de imagem, como ressonância magnética ou métodos de imagem nuclear, não têm a resolução para obter imagens de neurônios individuais.

Como tal, nenhum outro método existente para medir as alterações na expressão gênica pode corresponder tanto à resolução espacial quanto à cobertura temporal do método de imagem descrito aqui. Uma etapa crítica neste procedimento é a cirurgia da janela craniana. Deve ser realizado com cuidado extra para evitar traumas no cérebro ou deixar sangue sob a lamínula de vidro.

A dura-máter pode ser removida, se necessário. Lembre-se de que a profundidade máxima de imagem no cérebro usando este procedimento dependerá da clareza da janela craniana, da configuração do microscópio e do brilho dos repórteres fluorescentes. Este protocolo de imagem in vivo é um método eficiente e versátil para obter informações sobre a dinâmica molecular relacionada à neuroplasticidade em neurônios individuais em resposta a várias experiências comportamentais, e provavelmente será geralmente aplicável a camundongos transgênicos portadores de repórteres fluorescentes para outros genes regulados experientes.