Name: Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprenda a rastrear mudanças moleculares dependentes de experiência em neurônios corticais usando imagem in vivo de dois fótons. Este método permite estudar plasticidade neural em tempo real.

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Os autores gostariam de agradecer a L. Belluscio para equipamentos de cirurgia filmagens, D. Kwon para filmar assistência, K. Liu para edição de vídeo, assistência e K. MacLeod para toda a música de fundo. KW reconhece o generoso apoio da Divisão de Programas de Pesquisa NIMH intramurais e os genes, Cognição e do Programa de Psicose. Este trabalho foi financiado pelo Programa de Pesquisa NIMH intramuros (VC, YY, SMKW) e da Divisão de Programa de Pesquisa NIAAA intramuros clínica e biológica (VC, RMC, DML).

Os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo Instituto Nacional de Atenção à Saúde Mental Animal e Comitê de Uso e estavam de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 1. Preparação pré-operatória <ol><li> Limpe todas as ferramentas em um esterilizador quente talão antes da cirurgia asséptica, limpar o local da cirurgia com etanol 70%, e colocou panos limpos. Usar luvas estéreis. Anestesiar os animais com uma solução preparada de fresco avertina a 1,2%, determinado a 0,02 ml / g, por via intraperitoneal. Alternativamente, anestesiar com gás isofluorano por meio de um cone de nariz, 5% para indução, 1,5% para a manutenção, com um circuito eliminador passiva. Verifique o nível de anestesia com pitadas cauda ou dedo do pé para garantir sedação plena. </li><li> Cobrir os olhos do animal com pomada oftálmica estéril, e injectar a dexametasona preparado de fresco (0,2 mg / kg) e carprofeno (5 mg / kg) subcutaneously para evitar inchaço e inflamação do cérebro 11. Raspar o cabelo sobre o crânio entre as orelhas, e esterilizar a pele com esfoliação betadine e três compressas alternadas de etanol 70%. </li><li> Montar o animal num estágio cirurgia estereotáxica com earbars, com uma almofada de aquecimento de água de circulação abaixo do conjunto de animais, a 37 ° C. Verifique regularmente os níveis do animal de anestesia, e complementar a dose do anestésico original conforme necessário. </li><li> Injectar 200 ul de Marcaine 0,5% sob a pele do couro cabeludo para anestesiar a área. Faça uma incisão na pele e remover a retalho de pele sobre o crânio. Retire o periósteo e secar a área com compressas de algodão limpo. </li></ol> 2. Cirurgia Janela crônica craniana <ol><li> Use uma broca de alta velocidade dental com 0,5 milímetros de rebarbas suavemente para delinear um círculo de diâmetro 3-5 mm sobre a região do cérebro de interesse. Periodicamente molhar o local de perfuração com pó de osso estéril 0,9% e limpar com cotonetes limpos. Se os sangramentos ósseas, use gelfoam previamente embebidos com solução salina estéril para apagar o sangramento e esperar por ele para parar. </li><li> Quando a camada último osso é atingido, levantar e remover a ilha osso com uma pinça de ponta fina. Dura anexos à prateleira inferior do osso pode ser encontrado se a janela atravessa uma sutura óssea. Estes devem ser cuidadosamente removidos como a aba de osso é levantado. </li><li> Rolo de espuma umedecido gel suavemente sobre a dura exposta para limpar a sua superfície e esperar por qualquer sangramento dural parar passo crítico:. Não prossiga até que todo sangramento dural parou. Sangue que fica preso dentro da janela craniano geralmente leva a uma janela opaca. </li><li> Se a região de interesse é em um local em que a dura-máter é particularmente espessa, a remoção da dura-máter acima, pode ser necessário. Se este for o caso, separar o suavemente dura a partir do pia abaixo com uma pinça muito finas, fazer uma pequena incisão na dura levantada com outro par de fórceps finos, então agarrar as extremidades cortadas e suavementedividir a dura-máter. A duração é fina, mas forte, por isso tome cuidado para não cortar o cérebro com as bordas intactas da dura. </li><li> Lavar a área com ACSF estéril ou soro fisiológico estéril. </li><li> Coloque uma lamela de vidro esterilizada (3-5 mm) sobre a dura-máter ou pia passo crítico:. Se as curvas em torno do crânio significativamente, usar Kwiksil adesivo 12 para encher os espaços em que a dura-máter ou pia não fazem contacto estreito com a lamela em regiões que não vai ser trabalhada. </li><li> Use gel de cianoacrilato para cobrir o adesivo elastómero e as bordas da lamela de vidro. Cobrir todo o crânio exposta com gel de cianoacrilato, ou uma mistura de cimento e krazyglue dental passo crítico:. Não permitir que qualquer gel de cianoacrilato de tocar a superfície do cérebro. </li><li> Incorporar uma custom-made barra de metal de fixação da cabeça do lado oposto do crânio. </li><li> Reexpedição para uma câmara de recuperação quente, depois de uma injecção intraperitoneal de cetoprofeno, 5 mg / kg, for gestão da dor. Continuar o analgésico por mais dois dias de pós-operatório. </li><li> Após duas semanas de recuperação pós-operatória, anestesiar o animal com isoflurano (5% para indução, de 1,5% para manutenção), montá-lo em um estágio do microscópio custom-made com um quadro de cabeça de fixação, e verificar a janela craniana para claridade óptica sob iluminação com luz azul. Cérebro superfície clareza vaso sanguíneo é altamente indicativo de qualidade janela craniano. Se as extremidades dos vasos sanguíneos são bem definidas, a janela é susceptível de ser utilizável. A duas semanas de tempo de recuperação pós-operatório é recomendado para permitir tempo suficiente para que o animal a recuperar da cirurgia. Janelas cranianas tipicamente limpar e melhorar durante este tempo, e permanecem opticamente transparentes por semanas adicionais para meses até rebrota de crânio ou espessamento da dura degrada a qualidade da janela. </li></ol> 3. Protocolo de comportamento e de varredura a laser de dois fótons Microscopia <ol><li> Animais com c clarajanelas ranial serão expostos a um estímulo ambiental ou submetidos a uma sessão de treino comportamental, e, em seguida, depois trabalhada no momento de expressão da GFP Arc-maximal. Antes de iniciar um protocolo de comportamento, o animal deve ser mantido num ambiente doméstico consistente gaiola para minimizar dia-a-dia da variação dos níveis de linha de base do arco GFP-expressão. </li><li> Começar a formação comportamental ou paradigmas de estimulação ambientais, dependendo da região do cérebro de interesse. Por exemplo, animais podem ser expostos a diferentes ambientes visuais em dias consecutivos, e visualizados por dia após a estimulação visual para identificar estímulo respostas específicas do córtex visual 10. </li><li> Arc-GFP em neurónios fluorescência tipicamente atinge o seu nível máximo de duas horas após a estimulação. A linha do tempo experimental pode ser otimizada para facilitar a detecção de Arco GFP-expressão em neurônios em seus níveis máximos de fluorescência. </li><li> Depois de uma sessão de formação comportamental ou environmental estimulação é completado, anestesiar os animais com isoflurano (5% para indução, de 1,5% para manutenção) e montar o animal na platina do microscópio sob medida com a cabeça de fixação do quadro sob o microscópio de dois fotões. </li><li> A posição da cabeça do animal é fixado à armação da cabeça de fixação, que liga directamente à fase, utilizando-se a barra de metal implantados no crânio. Isoflurano e oxigénio são continuamente fornecidos ao rato através de um cone de nariz. A temperatura do corpo é mantida através de uma almofada de aquecimento. </li><li> Certifique-se que os detectores de microscópio são protegidos da luz ambiente através da realização de dois fótons de varredura a laser em um quarto escuro. Use uma lente de imersão de 20x ou 25x (1,05 abertura numérica) de água para geração de imagens. Primeiro, sob epi-fluorescência iluminação, adquirir uma imagem da superfície padrões dos vasos sanguíneos mais a região do cérebro de interesse com uma câmera CCD para o alinhamento da imagem futuro. </li><li> Comece dois fótons de varredura a laser para adquirir uma pilha de imagens 3-D. Um FV1000 OlympusMPE microscópio multi-fotão é usado em nossa configuração. A excitação comprimento de onda do laser de dois fotões está fixado em 920 nm, e a potência do laser emitido da objectiva é de cerca de 50 mW. Fluorescência emitida é detectada simultaneamente nos canais de verde e vermelho espelho dicróico (a 570 nm, filtro de barreira de 495-540 nm e 570-625 nm), usando um externo de dois canais do sistema de detecção photomutiplier colocados próximo do espécime. Arco-GFP fluorescência só aparece no canal verde, enquanto que o tecido auto-fluorescência aparece em ambos os canais 13, 14. </li><li> Pilhas de imagens típicas têm dimensões de cerca de 320x320x100 ^ m (comprimento x largura x profundidade), uma resolução horizontal de 0,5 m / pixel e uma resolução vertical de 3 mm / pixel. </li><li> Depois de adquirir a pilha de imagens, o animal regressar à sua gaiola. Não perturbe o animal até a próxima comportamental e sessão de imagem. Repita o comportamento e procedimento de imagem em dia como desejáveled. Use o cérebro adquiridos anteriormente superfície da imagem vaso sanguíneo para orientar volta para o local de imagem mesmo. </li></ol>

<ol><li>Leslie, J. H., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-regulated+genes+as+mediators+of+neural+circuit+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity.</a> Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).</li>
<li>Flavell, S. W., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+linking+neuronal+activity+to+gene+expression+and+plasticity+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system.</a> Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).</li>
<li>Guzowski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+behaviorally+relevant+neural+circuits+with+immediate-early+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression.</a> Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).</li>
<li>Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+circuits+and+systems+using+transgenic+reporters+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).</li>
<li>Lyford, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+growth+factor+and+activity-regulated+gene%2C+encodes+a+novel+cytoskeleton-associated+protein+that+is+enriched+in+neuronal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites.</a> Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).</li>
<li>Link, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatodendritic+expression+of+an+immediate+early+gene+is+regulated+by+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).</li>
<li>Shepherd, J. D., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+views+of+Arc%2C+a+master+regulator+of+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity.</a> Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).</li>
<li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in Neurosciences. 34 (4), 177-187 (2011).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Wang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+a+role+of+arc+in+enhancing+orientation+specificity+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex.</a> Cell. 126 (2), 389-402 (2006).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), e680(2008).</li>
<li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Large-Scale+Neural+Activity+with+Cellular+Resolution+in+Awake%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+Mice.+Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake.</a> Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li>
<li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li>
<li>Eichhoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+of+the+aging+and+diseased+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Nucl.+Med.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain.</a> Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).</li>
<li>Klohs, J., Rudin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+molecular+events+in+the+brain+by+noninvasive+imaging.+The+Neuroscientist%3A+a+review+journal+bringing+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22neurology+and+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology.</a> neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).</li>
<li>Chen, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chamber+and+artificial+dura+method+for+long-term+optical+imaging+in+the+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey.</a> Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).</li>
<li>Kleinfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).</li>
<li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).</li>
<li>Stosiek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de imagem in vivo descrito aqui permite o exame repetido de mudanças Arco de expressão de genes nos mesmos conjuntos de neurônios durante vários dias no animal vivo. É um método eficiente e versátil para a obtenção de informação sobre a plasticidade neural relacionadas com a dinâmica molecular em neurónios individuais em resposta a várias experiências comportamentais. Padrão métodos histoquímicos como a hibridização in situ e imuno pode conseguir uma única célula resolução 3, mas nã...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do Equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> FV1000 multi-fotão microscópio de varredura a laser </td><td> Olimpo </td><td> FV1000MPE </td><td> Imagem </td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção </td><td> Omano </td><td> 555V107 </td><td> Cirurgia </td></tr><tr><td> Stereotaxis fase cirurgia para ratos </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 726335 </td><td> Cirurgia </td></tr><tr><td> 20X 25X ou objetiva de imersão de água </td><td> Olimpo </td><td> XLPL25XWMP </td><td> Imagem </td></tr><tr><td> Estágio do microscópio com cabeça de fixação de quadro </td><td> Feitos </td><td> N / A </td><td> Imagem </td></tr><tr><td> Pinça fina </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11251-20 </td><td> Cirurgia </td></tr><tr><td> Dental broca rebarba </td><td> Belas Science Tools </td><td> 19007-05 </td><td> Cirurgia </td></tr><tr><td> Câmera CCD </td><td> QImaging </td><td> QICAM 12 bits </td><td> Imagem </td></tr></tbody></table>

vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

A capacidade do cérebro de mudar em resposta a experiência é essencial para a função saudável do cérebro, e anomalias no presente processo contribuem para uma variedade de desordens cerebrais 1,2. Para melhor compreender os mecanismos pelos quais os circuitos cerebrais reagem a experiência de um animal requer a capacidade de monitorar as alterações dependentes da experiência molecular em um dado conjunto de neurónios, ao longo de um período de tempo prolongado, em que o animal vivo. Embora a experiência e atividade neural associada é conhecido por desencadear mudanças de expressão gênica em neurônios 1,2, a maioria dos métodos para detectar tais mudanças não permitir a observação repetida dos mesmos neurônios durante vários dias ou não tem resolução suficiente para observar neurônios individuais 3 , 4. Aqui, descrevemos um método que combina in vivo de dois fótons de microscopia, com um repórter fluorescente geneticamente codificado para rastrear experiência dependentes de mudanças de expressão gênica em neurônios corticais individuais sobre o<html> claro do dia-a-dia experiência. Uma das bem estabelecidas experiência dependentes de genes é regulada Atividade proteína associada citoesqueleto (Arco) 5,6. A transcrição do arco é rápida e altamente induzida pela intensificação da actividade neuronal 3, e do seu produto de proteína regula a endocitose de receptores de glutamato e de longo prazo de plasticidade sináptica 7. A expressão do arco tem sido amplamente utilizada como um marcador molecular para mapear os circuitos neuronais envolvidas em comportamentos específicos 3. Na maioria destes estudos, a expressão Arc foi detectada por hibridação in situ ou imuno-histoquímica em secções de cérebro fixos. Embora esses métodos revelaram que a expressão do arco foi localizada para um subconjunto de neurónios excitatórios após experiências comportamentais, como os padrões de expressão celular do arco pode mudar com múltiplos episódios de experiências repetidas ou distintivo mais dias não foi investigada. ntent &quot;&gt; in vivo de dois fótons de microscopia oferece uma poderosa forma de examinar a experiência adquirida dependentes de alterações celulares no cérebro vivo 8,9. Para permitir a análise de expressão Arc em neurônios vivos por dois fótons de microscopia, que anteriormente gerou um knock- na linha de rato em que um repórter GFP é colocado sob o controle do promotor endógeno do arco 10. Este protocolo descreve as preparações cirúrgicas e procedimentos de imagiologia de seguimento experiência dependentes de padrões de expressão de Arc-GFP em conjuntos neuronais do animal vivo. Neste método , crónicas janelas cranianas foram primeiro implantado em ratinhos Arc-GFP nas regiões corticais de interesse. Estes animais foram então repetidamente fotografada por dois fotões microscopia após desejados paradigmas de comportamento ao longo de vários dias. Este método pode ser geralmente aplicável a animais portadores outros repórteres fluorescentes de experiência dependentes de alterações moleculares 4.

<html> Este protocolo descreve um método para rastrear experiência dependentes de alterações moleculares nos neurônios corticais individuais em animais vivos. Uma janela crónica craniana é primeiro criado sobre uma região cortical de interesse num rato carregando um repórter fluorescente da expressão do gene. Dois fotão-microscopia pode então ser acoplado com vários paradigmas de comportamento para observar comportamentalmente induzidas alterações moleculares em neurónios individuais e rastrear tais mudanças nos mesmos c...

Experiência dependentes de alterações moleculares nos neurônios são essenciais para a capacidade do cérebro de se adaptar em resposta aos desafios comportamentais. Um<em&gt; In vivo</em&gt; Dois fótons método de imagem é descrito aqui que permite o acompanhamento de tais alterações moleculares em individuais neurônios corticais através de repórteres codificados geneticamente.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Mudanças moleculares dependentes experimentadas nos neurônios são essenciais para a capacidade do cérebro de se adaptar em resposta a desafios comportamentais. Um método de imagem in vivo de dois fótons é descrito aqui que permite o rastreamento de tais mudanças moleculares em neurônios corticais individuais por meio de repórteres geneticamente codificados. Um dos genes dependentes experientes bem estabelecidos é a proteína ou arco associado ao citoesqueleto regulado pela atividade.A transcrição do ARC é rápida e altamente induzida pela intensificação da atividade neuronal Para permitir o exame da expressão do arco em neurônios vivos por duas microscopias fotográficas, usamos uma linha de camundongo knockin na qual um repórter GFP é colocado sob o controle do promotor do arco endógeno. Este protocolo descreve as preparações cirúrgicas e procedimentos de imagem para rastrear padrões de expressão de GFP de arco dependente experientes em conjuntos neuronais no animal vivo. Primeiro, descreveremos a preparação animal necessária para esta técnica.Um animal arc GFP será submetido a uma cirurgia na janela craniana e se recuperará da cirurgia por aproximadamente duas semanas. A qualidade da janela craniana é então verificada e, se os neurônios puderem ser visualizados através dela, o animal é colocado em um ambiente aquático até o início dos experimentos comportamentais e de dois fótons. Esses animais são então repetidamente fotografados por duas microscopias fotográficas.Depois que os paradigmas comportamentais desejados forem concluídos ao longo de vários dias, limpe todas as ferramentas em um esterilizador de esferas quentes. Antes da cirurgia asséptica, limpe o local da cirurgia com etanol a 70% e coloque panos limpos. Anestesiar o animal com solução de Everton a 1,2% administrada a 0,02 mililitros por grama intraperitoneal.Verifique o nível de anestesia usando pinças de cauda ou dedo do pé para garantir a sedação total. Cubra os olhos do animal com pomada oftálmica estéril e injete dexametasona 0,2 miligramas por quilograma e carprofeno cinco miligramas por quilograma por via subcutânea. Raspe o cabelo sobre o crânio entre as orelhas e esterilize a pele com esfoliante Betadine e três cotonetes alternados de 70% de etanol Monte o animal em um estágio de cirurgia estereotáxica com barras de ouvido com uma almofada de aquecimento de circulação de água abaixo do animal ajustada a 37 graus.Verifique regularmente os níveis de anestesia do animal e complemente a dose original do anestésico conforme necessário. Injete 200 microlitros de 0,5% de marcaína sob a pele do couro cabeludo para anestesiar a área, incisar a pele e remover a aba da pele sobre o crânio. Remova o periósteo e seque a área com cotonetes limpos.Use uma broca odontológica de alta velocidade com uma broca de 0,5 milímetro para delinear suavemente um círculo de três a cinco milímetros de diâmetro sobre a região do cérebro de interesse, dependendo de suas necessidades. Molhe periodicamente o local de perfuração com solução salina estéril a 0,9% e limpe a poeira óssea com cotonetes limpos. Se o osso sangrar, use espuma de gel pré-embebida em solução salina estéril para enxugar o sangramento e espere que ele pare.Quando a última camada óssea for atingida, levante e remova a ilha óssea com uma pinça de ponta fina. Você pode encontrar anexos durais na prateleira inferior do osso. Se a sua janela cruzar a sutura óssea, elas devem ser removidas com cuidado.À medida que o retalho ósseo é levantado, role a espuma úmida e gel suavemente sobre a dura-máter exposta para limpar sua superfície e aguarde o desaparecimento do sangramento dural. Se a sua região de interesse estiver em um local com dura-máter particularmente espessa, pode ser necessário remover a dura-máter acima. Se for esse o caso, separe suavemente a dura-máter da PIA abaixo com uma pinça muito fina.Faça uma pequena incisão na dura-máter levantada com outro par de pinças finas. Em seguida, segure as bordas cortadas e divida suavemente a dura-máter. A dura-máter é fina, mas forte, portanto, tome cuidado para não cortar o cérebro com as bordas intactas da dura-máter.Ao trabalhar para trás e para longe de sua região de interesse, lave a área generosamente com LCR A estéril ou solução salina estéril. Se o crânio ao redor se curvar significativamente ao redor da dura-máter ou pia exposta, use adesivo de célula rápida para preencher os espaços que não fariam contato próximo com a lamínula da tampa da janela em regiões que não serão fotografadas. Em seguida, coloque uma lamínula de vidro estéril suavemente sobre a dura-máter ou pia.Use gel acrílico Sano para cobrir o adesivo de elastômero e as bordas do vidro. Lamínula. Cubra todo o crânio exposto com gel de cianoacrilato Sano ou uma mistura maluca de cola e cimento dental.Incorpore uma barra de fixação de cabeça de metal feita sob medida na extremidade oposta do crânio. Devolva o animal a uma câmara de recuperação quente após uma injeção intraperitoneal de cetoprofeno cinco miligramas por quilograma para controle da dor. Continue o analgésico por dois dias após a cirurgia.Após duas semanas de recuperação pós-operatória, anestesiar o animal com flúor ISO. 5% para indução, 1,5% para manutenção. Monte-o em um estágio de microscópio personalizado com uma estrutura de fixação da cabeça e verifique a clareza óptica da janela craniana.Sob iluminação com luz azul, a clareza dos vasos sanguíneos da superfície do cérebro é altamente indicativa da qualidade da janela craniana. Se suas bordas estiverem bem definidas, é provável que a janela seja utilizável. Antes de iniciar um protocolo comportamental, o animal deve ser mantido em um ambiente de gaiola doméstica consistente para minimizar a variação do dia-a-dia.No arco basal, os níveis de expressão de GFP iniciam o treinamento comportamental ou os paradigmas de estimulação ambiental, dependendo da região cerebral de interesse. Por exemplo, os animais podem ser expostos a diferentes ambientes visuais durante dias consecutivos para obter imagens de populações distintas de neurônios no arco do córtex visual, a fluorescência GFP nos neurônios normalmente atinge seu nível máximo duas horas após a estimulação. A linha do tempo experimental pode ser otimizada para facilitar a detecção da expressão de ARC GFP em neurônios em seus níveis máximos de fluorescência.Após a conclusão de uma sessão de treinamento comportamental ou estimulação ambiental, anestesie o animal com flúor ISO 5% para indução, 1,5% para manutenção. Monte o animal no estágio de microscópio feito sob medida com estrutura de fixação da cabeça. Sob o microscópio de dois fótons, a posição da cabeça do animal é fixada à estrutura de fixação da cabeça que se conecta diretamente ao palco usando a barra de metal implantada no crânio.O flúor ISO e o oxigênio são continuamente fornecidos ao camundongo por meio de um cone nasal. A temperatura corporal é mantida usando uma almofada de aquecimento. Certifique-se de que os detectores do microscópio estejam protegidos da luz ambiente.Ao realizar a varredura a laser de dois fótons em uma sala escura, use uma lente de imersão em água de abertura numérica de 20 x ou 25 x 1,05 para obter imagens. Primeiro, sob iluminação de epifluorescência, adquira uma imagem dos padrões dos vasos sanguíneos superficiais sobre a região cerebral de interesse com uma câmera CCD. Para alinhamento futuro da imagem, inicie a varredura a laser de dois fótons para adquirir uma pilha de imagens 3D.O comprimento de onda de excitação do laser de dois fótons é definido em 920 nanômetros e a potência é definida em aproximadamente 50. A fluorescência emitida por miliwatts é detectada simultaneamente em um arco de canal verde e vermelho. A fluorescência GFP aparece apenas no canal verde, enquanto a autofluorescência tecidual aparece em ambos os canais.As pilhas de imagens típicas têm dimensões de aproximadamente 320 por 300, 20 por 100 micrômetros, uma resolução horizontal de 0,5 micrômetros por pixel e uma resolução vertical de três micrômetros por pixel. Depois de adquirir a pilha de imagens, devolva o animal à sua gaiola de origem. Não perturbe o animal até a próxima sessão comportamental e de imagem.Repita o comportamento e o procedimento de imagem ao longo dos dias, conforme desejado. Use a imagem do vaso sanguíneo da superfície cerebral previamente adquirida para se orientar de volta ao mesmo local de imagem. A força dessa técnica é que ela permite o exame de alterações na expressão gênica do arco no mesmo conjunto de neurônios ao longo de vários dias.No animal vivo. Os métodos HISTOQUÍMICOS padrão podem atingir a resolução de uma única célula, mas não podem rastrear alterações na expressão gênica nos mesmos neurônios ao longo de vários dias. Outras técnicas de imagem, como ressonância magnética ou métodos de imagem nuclear, não têm a resolução para obter imagens de neurônios individuais.Como tal, nenhum outro método existente para medir as alterações na expressão gênica pode corresponder tanto à resolução espacial quanto à cobertura temporal do método de imagem descrito aqui. Uma etapa crítica neste procedimento é a cirurgia da janela craniana. Deve ser realizado com cuidado extra para evitar traumas no cérebro ou deixar sangue sob a lamínula de vidro.A dura-máter pode ser removida, se necessário. Lembre-se de que a profundidade máxima de imagem no cérebro usando este procedimento dependerá da clareza da janela craniana, da configuração do microscópio e do brilho dos repórteres fluorescentes. Este protocolo de imagem in vivo é um método eficiente e versátil para obter informações sobre a dinâmica molecular relacionada à neuroplasticidade em neurônios individuais em resposta a várias experiências comportamentais, e provavelmente será geralmente aplicável a camundongos transgênicos portadores de repórteres fluorescentes para outros genes regulados experientes.

in-vivo-two-photon-imaging-experience-dependent-molecular-changes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Para entender a dinâmica da rede de microcircuitos no neocórtex, é essencial para gravar simultaneamente a atividade de um grande número de neurônios. In-vivo de dois fótons de imagens de cálcio é o único método que permite registrar a atividade de uma densa população neuronal com uma única célula de resolução.

Vivo em 2-Photon Imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos Ratos

Um protocolo minimamente invasiva para estabilizar a coluna vertebral do mouse e executar...

Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia

Source: Mizuno, H., et al. In Vivo Imagem de dois fótons de neurônios corticais em camundongos neonatais. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo mostra a microscopia de dois fótons sendo usada para obter imagens de neurônios no cérebro de um filhote de camundongo transgênico anestesiado. O laser de dois fótons permite imagens mais profundas com alta resolução espacial e dispersão mínima de luz, permitindo a captura detalhada da morfologia neuronal, incluindo projeções dendríticas.

Microscopia de dois fótons para imagem da morfologia neuronal em um filhote de camundongo

Fonte: Kamei, R., et. al., Imagem crônica de dois fótons in vivo da microglia no hipocampo de camundongos. J. Vis. Exp. (2022)O vídeo demonstra o processo de configuração e imagem para microscopia in vivo de dois fótons da dinâmica microglial no hipocampo CA1 (Cornu ammonis 1) e giro denteado, garantindo o alinhamento óptico ideal e a avaliação da integridade estrutural.

Imagem in vivo de dois fótons da dinâmica microglial no hipocampo de camundongos

É descrito um método para a marcação de neurónios com corantes fluorescentes funcionais pré-determinados micro-domínios do neocórtex. Primeiro, a imagem do sinal óptico intrínseco é usado para obter um mapa funcional. Em seguida, dois fotões microscopia é utilizado para marcar e neurónios de imagem dentro de um domínio de micro-do mapa.

Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem

A imagem de lapso de tempo no animal vivo fornece informações valiosas sobre a reorganização estrutural no cérebro intacto. Aqui, apresentamos uma preparação de crânio afinado que permite imagens transcranianas de estruturas sinápticas marcadas com fluorescência no córtex de camundongo vivo por microscopia de dois fótons.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite imagens crônicas de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos usando microscopia in vivo de dois fótons na linha transgênica Thy1-GFP. Essa abordagem é combinada com a injeção de vírus adeno-associado que expressa mCherry no hipocampo dorsal. Essas técnicas permitem o monitoramento de longo prazo da plasticidade estrutural dependente da experiência em RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

Apresentamos um na vivo dois fotões protocolo para o córtex cerebral de ratos neonatais de imagem de imagem. Este método é adequado para analisar a dinâmica do desenvolvimento dos neurônios corticais, os mecanismos moleculares que controlam a dinâmica neuronal e as mudanças na dinâmica neuronal em modelos de doenças.

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Este método descreve uma preparação crônica que permite o acesso óptico ao hipocampo de camundongos vivos. Esta preparação pode ser utilizada para realizar imagens ópticas longitudinais de plasticidade estrutural neuronal e plasticidade celular evocada por atividade ao longo de um período de várias semanas.

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Este trabalho descreve um método para observação crônica in vivo da microglia em repouso no CA1 do hipocampo de camundongos usando cirurgia precisamente controlada e microscopia de dois fótons.

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Aprenda a rastrear mudanças moleculares dependentes de experiência em neurônios corticais usando imagem in vivo de dois fótons. Este método permite estudar plasticidade neural em tempo real.

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