Isolar e imunocoloração linfócitos e células dendríticas a partir de placas de Peyer Murino

O objetivo geral deste procedimento é isolar e imunocorar linfócitos e células dendríticas de placas pagadoras de neurônios, usando duas abordagens experimentais paralelas. Primeiro, extirpe os adesivos de pagadores frescos do camundongo, intestino delgado. Em seguida, dissocie fisicamente os adesivos do pagador, colha o tecido e passe-o por um filtro de malha para gerar uma suspensão de célula única para análise de citometria de fluxo.

Colha as células por centrifugação e distribua alíquotas em uma placa inferior redonda de 96 poços. Em seguida, rotule as células com anticorpos contra marcadores de superfície específicos do tipo de célula. Prossiga imediatamente para a análise de citometria de fluxo para enumerar os tipos específicos de células Em paralelo, isole as placas do pagador e congele as amostras de tecido.

Em blocos OCT, seção criogênica, as amostras são rotuladas com anticorpos contra marcadores de superfície específicos do tipo de célula e, em seguida, visualizadas por microscopia a laser de varredura confocal em conjunto. Esses métodos quantificarão células B, células T e células dendríticas em compartimentos específicos dentro dos tecidos de contato do pagador. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque os tecidos de remendo do PI são extremamente frágeis e podem ser facilmente danificados.

Durante o manuseio. Coloque o intestino delgado recém-isolado em uma cama de toalhas de papel úmidas ou lenços umedecidos. Em seguida, molhe o intestino delgado suavemente com solução salina para evitar a desidratação do tecido.

Agora, identifique visualmente os adesivos pagadores individuais localizados no lado antimesentérico do intestino. Normalmente, um único camundongo tem de cinco a 10 manchas pagadoras visíveis que são distribuídas uniformemente do duodeno ao íleo. O uso de tesouras cirúrgicas curvas geralmente extirpa os adesivos do pagador individual.

Coloque-os na solução de equilíbrio de Hank frio, mantendo o tecido a quatro graus Celsius para preservar a viabilidade celular. Em seguida, transfira os adesivos do pagador para cinco mililitros de meio de dissociação do baço e agite a 250 RPM por 15 a 20 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, para gerar uma suspensão de célula única, coloque a amostra em um filtro de células de malha de náilon estéril de 70 mícrons e triture à força o tecido na malha usando a base de um êmbolo de uma seringa de um cc para remover os agregados celulares restantes.

Decantar a suspensão celular através de uma segunda célula de 70 mícrons, filtrar e recolher as células num tubo cónico de 15 ou 50 mililitros. Dispense 10 a cinco células por poço em células de pellets de placa inferior redonda de 96 poços por centrifugação por cinco minutos a 1000 vezes. G.Em seguida, transvase o sobrenadante invertendo suavemente a placa.

Agora ressuspenda as células no tampão de bloco FC e incube no gelo por 15 minutos. Em seguida, adicione anticorpos conjugados com flúor diretamente às suspensões celulares na diluição desejada e incube em células de lavagem de gelo com 100 microlitros de tampão de fluxo. Em seguida, ressuspenda as células em 400 microlitros de tampão de fixação para analisar as células por citometria de fluxo para isolar os adesivos pagadores para criossecção.

Corte segmentos transversais de 0,5 centímetro do intestino delgado contendo um único adesivo de pagador. Transfira o tecido para uma placa de Petri contendo PBS. Em seguida, coloque os segmentos de tecido intestinal verticalmente dentro de moldes de base contendo OCT.

Mergulhe os moldes em nitrogênio líquido e deixe o tecido congelar completamente. Remova os moldes de base congelados do nitrogênio líquido usando uma pinça. Deixe o molde aquecer a temperatura ambiente apenas o tempo suficiente para que as bordas do bloco OCT amoleçam.

Em seguida, remova o bloco congelado de OCT do molde. Inverta o molde e pressione suavemente a parte de trás para ejetar o bloco em um pedaço limpo de papel alumínio de quatro por quatro centímetros. Embrulhe imediatamente o tecido na folha e coloque em um saco de amostra rotulado armazenado em nitrogênio líquido ou em gelo seco, seção criogênica do tecido usando um micrótomo criogênico LI a CM 3 0 5 0 s ou equivalente.

Defina a temperatura da câmara no criostato para menos 21 graus Celsius. Idealmente, corte seções de 12 a 14 mícrons de espessura. Colete as seções em lâminas de microscópio Supercross plus glass.

Inspecione as amostras visualmente usando um microscópio de luz de baixa potência padrão. Mergulhe as lâminas em acetona por dois minutos. Esteja ciente de que a incubação prolongada pode fazer com que os tecidos se desprendam da lâmina.

Lave as amostras três vezes com PBST. Em seguida, circunde as seções com uma caneta hidrofóbica de imagem. Agora incube as amostras em tampão de bloco, cubra as seções de tecido com solução primária de anticorpos.

Seque a área ao redor das seções usando lenços umedecidos ou outro tecido absorvente sem tocar nas seções de tecido reais. Usando uma pipeta ou conta-gotas, coloque suavemente uma gota de meio de montagem de ouro prolongado diretamente na seção. Aplique uma lamínula de vidro, evitando bolhas de ar e enxugando qualquer excesso de montagem.

A análise de fax médio de suspensões monodispersas de células patch pagadoras totais revela uma clara distinção entre preparações celulares boas e ruins em preparações celulares boas. Com mais de 80% de viabilidade, a grande maioria das células demonstra alta dispersão direta, indicando alto volume celular e baixa dispersão lateral consistente com baixa granularidade celular. Neste experimento, a má preparação celular foi deliberadamente preparada para demonstrar que, em uma população ruim, a maioria das células exibe FSC baixo, SSC alto e está fora da marcha R indicada.

Essas células provavelmente estão passando por apoptose e/ou necrose. Aqui um coquetel de até quatro Fluor diferentes. Quatro anticorpos monoclonais conjugados para discriminar entre uma variedade de tipos de células.

Em payers patch suspensões de célula única foram usadas rotulagem com um conjunto de marcadores de diferenciação. CD 19 e B dois 20 revelam que as células B constituem cerca de 60% dos pagadores fechados. Os subconjuntos de células T específicas da população de células-patch podem ser facilmente enumerados por marcação dupla com anticorpos contra CD três e CD quatro, ou CD três e CD oito, CD quatro positivo e CD oito células T positivas constituem aproximadamente 23% e 9%, respectivamente, do total de células patch pagantes.

Os subconjuntos da DC, eles seriam CD 11 C positivo e CD 1 0 3 positivo também podem ser enumerados por este método. Os CDs positivos para CD 11 C contribuem com cerca de 8% da população total fechada, o que equivale aproximadamente a 10.000 CDs por patch de pagadores. Entre a população de células C positivas para CD 11, aproximadamente 4,7% foram duplamente positivas para B e 20 positivas.

Resultados semelhantes são obtidos quando células remendadas pagadoras são coletadas de camundongos C 57 pretos seis. Preparações celulares inadequadas podem levar a resultados altamente enganosos, principalmente porque as células mortas ou moribundas tendem a se ligar aos anticorpos de forma não específica. Normalmente, isso leva a uma super-representação de B 2 2 0 positivo e CD três células positivas duplas positivas, bem como B duas células B positivas 20 e células T CD quatro positivas células duplamente positivas.

As seções criogênicas de patch de pagamento de camundongos são passíveis de análise histopatológica, bem como de imunomarcação. Enquanto o poder das seções in fornece mais resolução no nível celular quando corado por h e e, as zonas claras e escuras dos centros germinativos dos patches pagadores são mais facilmente demarcadas nas seções da seção criogênica. Nesta seção criogênica típica de patch de pagadores, anti CD três anticorpos, rotule as células T anti anticorpos CD 11 C.

Destaque as células dendríticas e os anticorpos anti B dois 20. Destaque as células B Após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para os pesquisadores da área entenderem como tipos específicos de células, como células dendríticas dentro de tecidos linfóides associados ao intestino, respondem a antígenos intestinais e patógenos microbianos.

Essas informações influenciaram o design e o desenvolvimento de vacinas para mucosas.