Injeção estereotáxica de microRNA-expressando Lentiviruses ao mouse Região CA1 do hipocampo e avaliação do resultado Behavioral

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar os efeitos neurológicos e cognitivos da superexpressão de micro RNA em camundongos. Isso é conseguido preparando o lentivírus que expressa micro RNA como uma segunda etapa. O lentivírus é injetado em uma região específica do cérebro, o que permite que o micro RNA se expresse e realize a regulação sobre seus alvos.

São obtidos resultados que mostram efeitos cognitivos da superexpressão de micro RNA devido à entrega anatomicamente direcionada do lentivírus no cérebro do camundongo. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a engenharia genética, é que a engenharia genética é uma técnica muito mais trabalhosa e demorada do que a injeção direta de lentivírus. Além disso, a injeção de lentivírus permite o controle espacial e temporal completo e o acompanhamento da molécula que está sendo superexpressa.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do espelho neurono, como qual seria o efeito de uma expressão excessiva ou insuficiente de um espelho específico no aprendizado e na memória, conforme avaliado por testes comportamentais, As implicações desta técnica se estendem à terapia de doenças neurodegenerativas porque os microRNAs são passíveis de intervenções terapêuticas. Incube as células de embalagem plaqueadas até que atinjam 90% de confluência, depois transfecte-as primeiro, mude seu meio para sem soro. DMEM suplementado com uma glutamina milimolar e 50 miligramas por mililitro.

A estreptomicina de penicilina então transfecta as células com o plasmídeo vetorial APL KO 0,1 pur que codifica para as porções delta R 8,2 e VSVG e plasmídeo com o micro RNA de interesse. Use 10 microlitros de um miligrama por mil, polietilina como transportador em 24 horas e 48 horas. Após a transfecção, colete os lentivírus embalados e filtre-os através de um filtro de 0,45 micrômetro.

Concentrar o filtrado com lentivírus numa ultracentrifugação a 15 graus Celsius e 70 000 Gs durante duas horas. Descarte o sobrenadante e suspendemos o lentivírus em água destilada deionizada apenas o suficiente para dissolver totalmente o pellet, de modo que não haja aglomerados visíveis. Em seguida, faça alíquotas do concentrado para armazenar a 70 graus Celsius negativos.

Em seguida, meça as células de embalagem de infecção do vírus com vírus diluído em série. Em uma placa de 12 poços de um mililitro de vetor a um milionésimo de mililitro de vetor por poço. O título resultante deve ser de pelo menos 1 bilhão de partículas infecciosas por mililitro.

Pese o animal e anestesieste-o com uma injeção IP de uma mistura de cetamina. Use o volume proporcional ao peso do animal conforme especificado para cada medicamento. Espere até que o animal esteja totalmente anestesiado.

Em seguida, verifique se há falta de reflexo de retirada no membro posterior quando não houver reflexo. Injete o animal por via subcutânea com o analgésico IL conforme especificado na caixa. Coloque o animal sob uma lâmpada de aquecimento ou em uma almofada de aquecimento e umedeça os olhos com pomada.

Por fim, raspe a área entre as duas orelhas com uma máquina de aparar e higienize a pele com etanol 70%. Coloque o animal dentro do aparelho de som T e ajuste as hastes nas fendas, logo dentro das orelhas do animal. Em seguida, use um bisturi para fazer uma incisão posterior anterior de cerca de 1,5 centímetros entre as orelhas e mantenha a incisão aberta com pinças cirúrgicas.

Em seguida, limpe a superfície do crânio com um cotonete até que a interseção entre a sutura coronal e as suturas sagitais seja visível. Isso inclui o bgma e a interseção entre as suturas coronal e lambdoide ou o lambda. Agora posicione a ponta da seringa presa no estereótipo ao ponto bgma em todos os três eixos logo abaixo das coordenadas.

Eles são os pontos zero. Em seguida, levante a seringa no eixo vertical para que um movimento mais plano não arranhe o crânio do bgma. Mova a seringa para o local desejado para o hipocampo ca um, por exemplo, para baixo dois milímetros no eixo AP, para cima e para baixo 1,8 milímetros no eixo LM e para baixo 1,5 milímetros no eixo DV.

Em seguida, abaixe a ponta da seringa até que ela toque o crânio. Marque o local e, em seguida, afaste a seringa para abrir espaço para a broca no local. Usando um perfurador fino, faça um buraco raso no osso do crânio.

Segure o perfurador com firmeza e não perfure o tecido mole. A perfuração em pulsos curtos pode ajudar durante a perfuração. Certifique-se de estudar uma mão usando a outra para que a perfuração do osso não se estenda mais profundamente no tecido mole.

Retire metade de um mililitro da solução concentrada de lentivírus para a seringa. Coloque a seringa acima do orifício e abaixe-a lentamente verticalmente até atingir a superfície do crânio. Continue a abaixar a seringa no cérebro muito lentamente.

Defina a bomba digital para 0.02 mililitros por minuto para injetar lentamente o volume em 25 minutos. Isso evitará o refluxo e garantirá uma disseminação bem-sucedida. Inicie a perfusão em alguns tipos de seringas.

Considere inserir a seringa mais meio milímetro antes de recuar para as coordenadas originais e iniciar a infusão enquanto a substância está sendo infundida. Umedeça a área exposta com PBS para evitar a desidratação do tecido. Quando terminar, aguarde cinco minutos antes de retirar a seringa.

Isso permite que o material se espalhe para o cérebro em vez de recuar de volta para o caminho da seringa. Em seguida, remova a seringa muito lentamente e observe se há refluxos. Se um refluxo for observado, uma fração do material injetado provavelmente foi perdida.

Sele a ferida com histo acron tomando cuidado para não deixar histo acron vazar para os olhos do animal. Em seguida, para evitar que o animal desidrate, injete um mililitro de solução salina aquecida intraperitoneal. Coloque o animal em uma gaiola de recuperação que esteja em uma almofada aquecida.

Observe o animal enquanto ele se recupera por uma hora após quatro a seis semanas, avalie a memória de navegação do animal como no labirinto aquático de Morris. O lentivírus terá infectado a maioria das células-alvo. A essa altura, uma injeção de 0,5 microlitros de lentivírus no ca.

Uma região do hipocampo de um camundongo foi feita conforme descrito no protocolo. O animal foi posteriormente sacrificado e fatias de 40 mícrons de espessura de seu cérebro foram analisadas. Para a expressão de GFP, a coloração DAPI pode ser vista em vermelho.

Em resumo, isso resultou em uma esfera infectada de cerca de um milímetro no eixo do balanço rostral e cerca de 0,5 milímetros nos EAs medial lateral e ântero-posterior. Camundongos injetados com um vetor lente codificador de micro RNA foram comparados com controles no labirinto aquático de Morris. Após três dias de treinamento, um caminho representativo do camundongo de controle até a plataforma submersa mostrada em verde era muito mais curto do que o de um animal experimental em vermelho.

No geral, os animais experimentais tiveram mais dificuldade em aprender a tarefa e os controles Uma vez dominados. Essa técnica pode ser feita em cerca de 40 minutos por mouse. Com a taxa de fluxo sendo o único fator limitante Siga este procedimento.

Outros métodos, como a injeção sistemática de oligonucleotídeos, podem ser realizados para responder a perguntas como até que ponto esse procedimento altera a comunicação cérebro-corpo. Não se esqueça de que trabalhar com lentivírus pode ser extremamente perigoso e precauções como jaleco descartável e luvas neutras devem ser usadas. Além disso, artigos de vidro e plástico contendo resíduos líquidos devem ser descontaminados antes do descarte em um saco de risco biológico.