Name: Injeção estereotáxica de microRNA-expressando Lentiviruses ao mouse Região CA1 do hipocampo e avaliação do resultado Behavioral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprenda a injeção estereotáxica de lentivirus expressando microRNA na região CA1 do hipocampo de camundongos para avaliar efeitos cognitivos. Este método permite controle espacial e temporal da expressão gênica em neurociência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudo foi apoiado pelo Edmond e Lily Safra Center for Brain Sciences (SB comunhão), The Legacy Heritage Ciências Biomédicas Programa de Parceria da Fundação Israel Science (Grant No. 378/11, a HS) e da Fundação Alemã de Israel for Scientific Pesquisa e Desenvolvimento (GIF) (Grant No. 1093-32.2/2010, a HS).

1. Preparação lentivírus <ol><li> Cultivar células HEK-293FT a 90% de confluência. </li><li> No dia da transfecção meio celular alteração DMEM isento de soro suplementado com glutamina 1 mM e 50 mg / ml de penicilina-estreptomicina. </li><li> Co-transfectar as células com um vector pLKO.1-Puro e com plasmídeos que codificam para o delta R8.2 e VSV-G e radicais da miRNA de interesse, utilizando 10 ul de 1 mg / mL de polietilenimina como um transportador 9. </li><li> Recolhe lentivírus embalados às 24 horas e 48 horas pós-transfecção, filtrar através de um filtro de 0,45 um. </li><li> Concentrar os lentivírus utilizando ultracentrifugação em 70.000 xg, por 2 horas e 15 ° C, alíquotas e armazenar a -70 ° C. </li><li> Medida por titulação do vírus infectando células HEK-293T com preparações de virus diluídos em série (1 a 10 -6 ml de vector por poço). O título resultante (um mínimo de 1 x 10 ~ 9 partículas infecciosas por ml é recomendado) é avaliada para a expressão do gene de interesse, usando a seleção puromycin e da quantificação do vírus expressando GFP através da contagem de células fluorescentes. </li></ol> Para o protocolo mais detalhado de preparação lentivírus ver 10. 2. Preparando animais para a cirurgia <ol><li> Cirurgiões vestimenta deve incluir vestido cirúrgico, luvas estéreis, gorro e máscara. </li><li> Pesa-se o animal, depois anestesiam-lo com um IP-injecção de uma mistura de cetamina, com o volume proporcional ao peso do animal, tal como especificado para cada fármaco. Para uma mistura de cetamina / xilazina, um intervalo de doses de 80-200 mg / kg de cetamina e 7-20 mg / kg de Xilazina é geralmente usado para os ratos. </li><li> Espere até que o animal está totalmente anestesiado, em seguida, verificar a falta de reflexo de retirada do membro posterior do animal através da extensão do membro e, em seguida, pressionando-o com o dedo. </li><li> Injectar o animal por via subcutânea com Rimadyl, conforme especificado na caixa, para alívio da dor. Intervalo de dose típica para Rymadil é de 5-10 mg. </li><li> Colocar o animal em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal constante e umedecer os olhos com pomada. </li><li> Raspar a área entre as duas orelhas com uma máquina de corte. </li><li> Higienizar a pele com betadine. </li></ol> 3. Exposição da Caveira e perfuração <ol><li> Colocar o animal dentro do stereotact ajustando as barras nas fendas apenas anteriores aos ouvidos do animal. </li><li> Usar um bisturi para fazer uma incisão ântero-posterior de cerca de 1,5 cm entre as orelhas e mantê-la aberta com grampos cirúrgicos (serfines). </li><li> Limpe a superfície do crânio com um cotonete até a interseção entre a sutura coronal e suturas sagital, ou seja, o bregma ea interseção entre as suturas coronal e lambdóide, ou seja, lambda, são visíveis. </li><li> Saliente da ponta da seringa, realizada pelo stereotact, ao ponto bregma, em todos os três eixos. Anote as coordenadas. Este ponto seria considerado como o po de zeroint em todos os três eixos. </li><li> Levante a seringa no eixo vertical, de modo que um movimento planar não arranhar o crânio e mover a cabeça da seringa para o local correto. Injecções de CA1 do hipocampo requerem coordena o seguinte em relação ao bregma, em mm: -2 no eixo anterior / posterior, ± 1,8 no eixo lateral / medial e -1.5 no eixo dorsal / ventral. </li><li> Abaixe a ponta da seringa até que toque o crânio e marcar o local com um marcador. Retire a seringa para trás para evitar esfaqueamento. </li><li> Faça um buraco raso, só no osso do crânio com uma multa perfurador. Segure o perfurador constante para que ele não iria continuar a perfurar os debaixo dos tecidos moles. Você pode evitar isso, firmando um lado com o outro e através da perfuração em pulsos curtos. </li></ol> 4. A injecção do lentivírus <ol><li> Retirar 0,5 ml da solução concentrada de lentivírus. </li><li> Coloque a seringa por cima do buraco e, lentamente, abaixe-o verticalmente até que reateso a superfície do crânio. Continue a diminuir a seringa no cérebro muito lentamente. Neste passo, pode ocorrer alguma hemorragia o que não indica necessariamente uma penetração falhou. Se ocorrer sangramento contê-la com um cotonete. </li><li> Regular a bomba digital para 0,02 ml / min (0,5 ul seria injectado em 25 min) e iniciar a infusão. A perfusão lenta permite um espalhamento eficaz do vírus no tecido e impede o fluxo de retorno. Em alguns tipos de seringas considerar a inserção da seringa para uma profundidade extra de 0,5 mm antes de se retirar para as coordenadas originais e infundindo. </li><li> Depois de completada a infusão é aguardar mais 5 min para permitir que o material para se propagar no cérebro em vez de se retirar de volta para dentro do canal formado pela seringa. </li><li> Retire a seringa muito lentamente e observar os fluxos de volta. Se um fluxo de retorno é observada nesta etapa, uma fracção do material injectado foi provavelmente perdida. </li></ol> 5. Selagem de Feridas e Recuperação <ol><li> Seal ªe enrolada com histoacryl. Certifique-se de evitar o vazamento do histoacryl nos olhos. </li><li> Injectar a animais por via intraperitoneal (IP) com 1 ml de solução salina pré-aquecida, a fim de evitar a desidratação. </li><li> Colocar o animal numa gaiola de recuperação que está posicionada sobre uma almofada aquecida. Assista ao animal enquanto ele se recupera de uma hora. </li></ol> Em caso de perda de peso, inapetência, fraqueza / incapacidade de obter alimentos ou água, estado moribundo ou infecção, a eutanásia do animal deve ser realizada. Métodos aceitáveis ​​para a eutanásia de roedores são os barbitúricos, anestésicos inalatórios, CO 2, CO, ou cloreto de potássio em conjunto com anestesia geral. Após 4 a 6 semanas, avaliam a memória de navegação do animal é avaliado no labirinto aquático de Morris. Os lentivírus que normalmente infectam a maioria das células no interior da esfera de injecção. 6. Avaliação comportamental no labirinto aquático de Morris <ol><li> Treinar os animais no Morris labirinto aquático. Para a formação exata e protocolo de testes ver 11. Depois de cada ensaio, secar o animal com uma toalha seca e substituí-lo na sua gaiola e refrescar a água no tanque. </li><li> Testar os animais no labirinto aquático de Morris, durante 3 dias consecutivos, quatro ensaios por dia. Cada dia inserir o animal no labirinto em cada uma das quatro direções do labirinto (norte, sul, leste e oeste), em uma ordem de mudança, por exemplo, o primeiro dia: leste-oeste-norte-sul, o dia dois: oeste-sul -nordeste. Limpe os animais depois de cada julgamento. </li><li> Durante o ensaio, os ensaios controlar o animal com um sistema de rastreio, tais como o sistema de rastreamento Noldus. </li><li> Após o ensaio de teste no dia 12, inserir o animal dentro do tanque de água, sem a plataforma, durante um minuto. Isto será usado para analisar a estratégia de pesquisa está a tomar o animal. </li><li> Analisar os dados, tal como sugerido em 12. </li></ol>

<ol><li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li>
<li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+interaction+between+the+fragile+X+mental+retardation+protein+and+the+microRNA+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway.</a> Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).</li>
<li>Simon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+miR-1+regulates+a+MEF-2-dependent+retrograde+signal+at+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions.</a> Cell. 133, 903-915 (2008).</li>
<li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+therapy+of+metachromatic+leukodystrophy+by+lentiviral+vectors%3A+correction+of+neuropathology+and+protection+against+learning+impairments+in+affected+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice.</a> Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).</li>
<li>Jakobsson, J., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+for+use+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors for use in the central nervous system.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).</li>
<li>Berson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic-associated+loss+of+hnRNP-A%2FB+in+Alzheimer%27s+disease+impairs+cortical+splicing+and+cognitive+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice.</a> EMBO Molecular Medicine. , (2012).</li>
<li>Haramati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+as+repressors+of+stress-induced+anxiety%3A+the+case+of+amygdalar+miR-34%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).</li>
<li>Shaltiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+microRNA-132+mediates+stress-inducible+cognitive+deficits+through+its+acetylcholinesterase+target%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target.</a> Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).</li>
<li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo%3A+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).</li>
<li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+%26+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J. Vis. Exp. (62), e3171(2012).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morris+Water+Maze+Experiment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Morris Water Maze Experiment.</a> J. Vis. Exp. (19), e897(2008).</li>
<li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J. Vis. Exp. (53), e2920(2011).</li>
<li>Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approach+for+intracerebroventricular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic approach for intracerebroventricular delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Injeção estereotáxica de um lentivírus é um método relativamente rápido para a avaliação in vivo, tanto para down-regulação de diferentes genes e miRNAs cima ou. A principal alternativa é um rato geneticamente modificado que é uma técnica consome muito mais trabalhoso e demorado, em seguida, a injeção direta lentivírus. Além disso, a regulação para cima, na injecção de lentivírus, ocorre a um tempo específico no ratinho adulto e não inclui qualquer possibilidade de permeabilidade durante o desenvolvimento, como...

O papel dos miRNAs particulares em funcionamento do sistema nervoso foi recentemente desafiado por injeção lentiviral em vários estudos. MiRNAs foram encontrados para ser crucial para a manutenção e re-moldar uma estrutura sinapse, sinaptogênese 2 e remodelação sinapse e manutenção 3. Estes estudos sugerem fortemente que miRNAs estão envolvidos, através de efeitos de regulação de vários níveis, tanto na formação e na manutenção da saída principal do sistema nervoso, a função cognitiva. Injeção estereotáxica de partículas lentivírus em regiões específicas no cérebro de roedores permite à procura de alterações na morfologia sinapse e atividade neuronal, e foi usado para estabelecer o significado funcional de transcritos sobre-expressos 4,5. Infecção direta de neurônios em áreas do cérebro bem definidas com miRNA-expressando lentivírus podem estar envolvidos em estudos de envelhecimento, distúrbios cerebrais e neurodegeneração; Estudos de miRNAs no campo da regulação comportamental 6-8 estão em um estado muito menos avançada, e injeção estereotáxica de miRNA-expressando partículas lentivírus seguidos por testes comportamentais podem ser úteis para tais fins. Um método muito mais trabalhoso para induzir sobre ou sub-expressão envolve a engenharia genética knock-in ou camundongos knockout. Sistemas genéticos podem ainda permitir o controlo condicional e temporal sobre a expressão (por exemplo, Cre-Lox, sistemas Tet), mas estes dificilmente oferecem a especificidade espacial do procedimento de injecção e existe quase sempre uma certa quantidade de fugas. Além disso, os procedimentos de engenharia não necessitam de cirurgia e pode ser usado em laboratórios com relativamente boa reprodutibilidade, no entanto, são lentos e exigem muito mais recursos humanos e financeiros. Além disso, o controlo temporal da sub-expressão em ratinhos injectados sobre ou é muito mais preciso em comparação com ratinhos geneticamente modificados.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipamento</td></tr><tr><td>Balança de pesagem de roedores</td><td>Burtons (Reino Unido)</td><td>115-455</td><td></td></tr><tr><td>almofada de aquecimento</td><td>FIRstTechnology</td><td>DCT-25</td><td></td></tr><tr><td>máquina de corte</td><td>Stoelting</td><td>51465</td><td></td></tr><tr><td>stereotact</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi e lâminas</td><td>Kent scientific</td><td></td><td></td>INS500348</tr><tr><td>seringa Harland</td><td>Hamilton</td><td>7632-01</td><td></td></tr><tr><td>perfurador</td><td>Stoelting</td><td>51449</td><td></td></tr><tr><td>bomba digital</td><td>Harvard aparelho</td><td>704507</td><td></td></tr><tr><td>tanque de água e plataforma</td><td>Stoelting</td><td>60135</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>ketamine </td><td>Vetoquinol(Lure France)</td><td></td><td></td>3055503</tr><tr><td>domitor</td><td>Orion pharma</td><td>107140-10</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer saúde animal</td><td>24751</td><td></td></tr><tr><td>pomada de umidade - Synthomycine 5%</td> <td>Rekah Pharmaceutical</td><td>195</td><td> </td></tr><tr><td>histoacryl</td><td>Braun</td><td>112101</td><td></td></tr><tr><td>solução salina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr></tbody></table>

injeção estereotáxica de microrna-expressando lentiviruses ao mouse região ca1 do hipocampo e avaliação do resultado behavioral

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) são moléculas de RNA de fita simples reguladoras pequenas cerca de 22 nucleotídeos de comprimento que podem cada alvo numerosas transcrições de mRNA e dim todo um gene de expressão da via pela destruição indução e / ou inibindo a tradução destes objectivos. Vários miRNAs desempenham papéis fundamentais na manutenção da estrutura e função neuronal e nas funções cerebrais de nível superior, e os métodos são procurados para manipular os seus níveis para explorar essas funções. Aqui, apresentamos uma relação direta método in vivo para examinar as consequências cognitivas de miRNAs aplicadas em excesso em ratos por injeção estereotáxica de partículas virais miRNA-codificação. Especificamente, o protocolo atual envolve a injeção na região CA1 do hipocampo, que contribui para a consolidação de mamíferos memória, aprendizagem, e as respostas ao estresse, e oferece um local de injeção conveniente. As coordenadas são medidas de acordo com a bregma rato e perfusão vírus é controlado digitalmente e mantido muito lento.Após a injecção, a ferida é selada a cirurgia e os animais recuperar. Lentivírus codificação silenciadores dos alvos de RNAm correspondentes servem para envolver a interação miRNA / target específico responsável pelo efeito observado, com camundongos normais, os camundongos injetados com solução salina e camundongos injetados com vetores lentivírus &quot;vazios&quot; como controles. Um mês após a injeção, os animais são examinados no labirinto aquático de Morris (MWM) para avaliar a sua aprendizagem de navegação e capacidades de memória. A MWM é um tanque redondo preenchido com água colorida com uma pequena plataforma submersa um centímetro abaixo da superfície da água. Estímulos visuais constantes ao redor do tanque permitem navegação espacial (som e do campo magnético da Terra pode também ajudar os animais a navegar). Monitoramento de câmeras de vídeo permite medir a rota de mergulho e o tempo para encontrar e atingir a plataforma. O mouse é ensinado pela primeira vez que a montagem da plataforma escondida oferece uma fuga da natação forçada, que é então testado para a utilização deste fuga e finalmente, a plataforma é removida e testes com sondas de examinar se o rato lembra sua localização anterior. Testes repetidos ao longo de vários dias consecutivos destacar melhorou o desempenho de ratinhos testados em menores latências para encontrar e montar a plataforma, e as vias mais directos como para alcançar a plataforma ou a sua localização. Fracasso para mostrar essa melhoria representa aprendizagem e memória prejudicada e / ou ansiedade, que pode então ser testada especificamente (por exemplo, no labirinto em cruz elevado). Esta abordagem permite a validação dos miRNAs específicos e transcrições alvo nos processos relacionados ao estresse cognitivo e / ou estudado.

A injecção de 0,5 ml no lentivírus região CA1 do hipocampo do rato, com a taxa de fluxo indicado na secção do protocolo produz uma esfera infectada de cerca de 1 mm no eixo rostral-caudal, e cerca de 0,5 mm, no médio-lateral e a anterior eixos-posterior (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50170/50170fig1.jpg" /> Figura 1. Ponto bregma e aparelhos de injeção. (A) É mostrado um mapa esquemático do b...

MicroRNAs têm papéis importantes na estrutura e função cerebral. Aqui nós descrevemos um método para impor miRNA hipocampo sobre-expressão usando a injeção estereotáxica de um lentivírus miRNA-expressando engenharia. Esta abordagem pode servir como um modo relativamente rápido para avaliar a<em&gt; In vivo</em&gt; Efeitos de miRNAs sobre-expressos em regiões específicas do cérebro.

Injeção estereotáxica de microRNA-expressando Lentiviruses ao mouse Região CA1 do hipocampo e avaliação do resultado Behavioral

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

O objetivo geral do seguinte experimento é avaliar os efeitos neurológicos e cognitivos da superexpressão de micro RNA em camundongos. Isso é alcançado por meio da preparação de lentivírus que expressam micro RNA como segundo passo. O lentivírus é injetado em uma região cerebral específica, o que permite que o micro RNA seja superexpresso e realize a regulação sobre seus alvos.São obtidos resultados que demonstram os efeitos cognitivos da superexpressão de microRNA devido à entrega anatomicamente direcionada do lentivírus no cérebro do camundongo. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a engenharia genética, é que a engenharia genética é uma técnica muito mais trabalhosa e demorada do que a injeção direta de lentivírus. Além disso, a injeção de lentivírus permite controle espacial e temporal completo, bem como o acompanhamento da molécula que está sendo superexpressa.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo dos neurônios espelho, como qual seria o efeito de uma super ou subexpressão de um espelho específico na aprendizagem e na memória, conforme avaliado por testes comportamentais. As implicações dessa técnica estendem-se para a terapia de doenças neurodegenerativas, pois os microRNAs são passíveis de intervenções terapêuticas. Incube células empacotadoras em plaqueamento até atingirem 90% de confluência, depois transfete-as primeiramente e troque seu meio por DMEM livre de soro, suplementado com um milimolar de glutamina e 50 miligramas por mililitro.Penicilina estreptomicina, em seguida, cotransfete as células com o plasmídeo do vetor A-P-L-K-O 0,1 pur que codifica as porções delta R 8,2 e VSVG e com o plasmídeo contendo o microRNA de interesse. Utilize 10 microlitros de polietileno a 1 miligrama por mililitro como transportador em 24 e 48 horas. Após a transfeção, colete os lentivírus empacotados e filtre-os através de um filtro de 0,45 micrômetro.Concentre o filtrado com lentivírus em uma ultracentrifugação a 15 graus Celsius e 70.000 Gs por duas horas. Descarte o sobrenadante e suspenda o lentivírus em quantidade mínima de água destilada desionizada necessária para dissolver completamente o precipitado, de modo que não haja grumos visíveis. Em seguida, faça alíquotas do concentrado para armazenar a menos 70 graus Celsius.Em seguida, meça o título do vírus mais infeccioso empacotando células com vírus diluído em série. Em uma placa de 12 poços, adicione de um mililitro de vetor até um milionésimo de um mililitro de vetor por poço. O título resultante deve ser de pelo menos 1 bilhão de partículas infecciosas por mililitro.Pese o animal e anestesie-o com uma injeção intraperitoneal de uma mistura de cetamina. Utilize o volume proporcional ao peso do animal conforme especificado para cada medicamento. Aguarde até que o animal esteja completamente anestesiado.Em seguida, verifique a ausência de reflexo de retirada no membro posterior quando não houver reflexo. Injete o animal subcutaneamente com o analgésico IL conforme especificado na embalagem. Coloque o animal sob uma lâmpada de aquecimento ou sobre uma almofada de aquecimento e umedeça seus olhos com pomada.Por fim, rape a área entre as duas orelhas com uma máquina de corte e sanitize a pele com etanol 70%. Coloque o animal dentro do estereotáxico e ajuste as hastes nas fendas, logo interior às orelhas do animal. Em seguida, use um bisturi para fazer uma incisão ântero-posterior de aproximadamente 1,5 centímetros entre as orelhas e mantenha a incisão aberta com pinças cirúrgicas.Em seguida, limpe a superfície do crânio com um cotonete até que a interseção entre a sutura coronal e as suturas sagitais fique visível. Isso inclui o bgma e a interseção entre as suturas coronal e lambdóide, ou o lambda. Agora, posicione a ponta da seringa segurada no estereotáxico no ponto bgma em todos os três eixos, exatamente nas coordenadas.Eles são os pontos zero. Em seguida, levante a seringa ao longo do eixo vertical para que um movimento plano não risque o crânio a partir do bgma. Mova a seringa até a localização desejada no hipocampo ca um, por exemplo, dois milímetros para baixo no eixo AP, 1,8 milímetros para cima e para baixo no eixo LM e 1,5 milímetros para baixo no eixo DV.Em seguida, abaixe a ponta da seringa até que toque o crânio. Marque o local, depois retire a seringa para abrir espaço para a broca naquele ponto. Usando uma broca fina, faça um orifício raso no osso do crânio.Mantenha a furadeira firme e não a introduza no tecido mole. Fazer furos em pulsos curtos pode ajudar durante a perfuração. Certifique-se de segurar uma mão com a outra, para que a perfuração através do osso não penetre mais profundamente no tecido mole.Retire metade de um mililitro da solução concentrada de lentivírus para dentro da seringa. Posicione a seringa acima do orifício e abaixe-a lentamente na vertical até que atinja a superfície do crânio. Continue abaixando a seringa no cérebro muito lentamente.Configure a bomba digital para 0,02 mililitros por minuto para injetar lentamente o volume em 25 minutos. Isso evitará refluxo e garantirá uma distribuição bem-sucedida. Inicie a infusão em alguns tipos de seringas.Considere inserir a seringa mais meio milímetro adicional antes de retornar às coordenadas originais e iniciar a infusão enquanto a substância estiver sendo administrada. Umedeça a área exposta com PBS para prevenir a desidratação do tecido. Ao finalizar, aguarde cinco minutos antes de retirar a seringa.Isso permite que o material se espalhe pelo cérebro em vez de retornar pelo caminho da seringa. Em seguida, remova a seringa muito lentamente e observe a ocorrência de refluxos. Se um refluxo for observado, provavelmente uma fração do material injetado foi perdida.Selar a ferida com histoacril, tomando cuidado para não deixar o histoacril vazar nos olhos do animal. Em seguida, para evitar a desidratação do animal, injetar um mililitro de solução salina aquecida por via intraperitoneal. Colocar o animal em uma gaiola de recuperação sobre uma placa aquecida.Observe o animal enquanto ele se recupera por uma hora após quatro a seis semanas, e avalie a memória de navegação do animal conforme no labirinto aquático de Morris. O lentivírus terá infectado a maioria das células-alvo. Neste momento, uma injeção de 0,5 microlitros de lentivírus no ca.Uma região do hipocampo de um camundongo foi preparada conforme descrito no protocolo. O animal foi posteriormente sacrificado e fatias de cérebro com 40 mícrons de espessura foram analisadas. Para expressão de GFP, a coloração com DAPI pode ser vista em vermelho.Em resumo, isso resultou em uma esfera infectada de aproximadamente um milímetro no eixo rostral-caudal e cerca de 0,5 milímetros nos eixos medial-lateral e anterior-posterior. Camundongos injetados com um vetor lente que codifica microRNA foram comparados com controles no labirinto aquático de Morris. Após três dias de treinamento, o trajeto representativo de um camundongo controle até a plataforma submersa, mostrado em verde, foi muito mais curto do que o de um animal experimental, em vermelho.No geral, os animais experimentais tiveram mais dificuldade para aprender a tarefa em comparação com os controles, uma vez dominada. Esta técnica pode ser realizada em cerca de 40 minutos por camundongo. A vazão sendo o único fator limitante ao seguir este procedimento.Outros métodos, como a injeção sistemática de oligonucleotídeos, podem ser realizados para responder perguntas como até que ponto este procedimento altera a comunicação entre o cérebro e o corpo. Não se esqueça de que trabalhar com lentivírus pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso de jaleco descartável tyvac e luvas neutras, devem ser adotadas. Além disso, vidraria e material plástico contendo resíduos líquidos devem ser descontaminados antes da eliminação em saco de resíduos biológicos.

stereotactic-injection-microrna-expressing-lentiviruses-to-mouse

Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Este vídeo demonstra a inibição mediada por microRNA de correntes sinápticas excitatórias em fatias de cérebro de hipocampo de camundongos. Os neurônios CA3 foram infectados com um vetor viral recombinante que abriga uma construção para expressar um repórter fluorescente, um canal de membrana ativado por luz e um microRNA que regula negativamente a expressão de canais de cálcio dependentes de voltagem. Ao colocar uma fatia em uma câmara de gravação e remendar um neurônio CA1 com uma pipeta de...

Inibição de correntes pós-sinápticas excitatórias mediada por microRNA em fatias de hipocampo de camundongo

Fonte: Chen, S., et al., Cirurgia Estereotáxica para Manipulação Genética em Células Estriatais de Cérebros de Camundongos Neonatais. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra a injeção estereotáxica de um vetor viral que codifica a Cre recombinase e a proteína de fluorescência verde ou GFP no estriado de um filhote de camundongo geneticamente modificado para obter a manipulação de genes extirpando um STOP flanqueado por loxP, ativando a proteína de fluorescência vermelha ou RFP como repórter.

Microinjeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação gênica em um filhote de camundongo estriado

Fonte: Pereira, M. et. al., Reprogramação direta in vivo de células gliais residentes em interneurônios por injeção intracerebral de vetores virais. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra a injeção estereotáxica de um vírus adeno-associado no córtex cerebral de um camundongo transgênico para fornecer reprogramação neuronal dependente de Cre e genes repórteres fluorescentes em células gliais.

Injeção estereotáxica de vetores virais para reprogramação de células gliais em modelo de camundongo

Fonte: Fricano-Kugler, C. J., et al. Projeto, embalagem e entrega de CRISPR retro e lentivírus de alto título por meio de injeção estereotáxica. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a injeção viral estereotáxica para edição precisa de genes neuronais no cérebro de camundongos. O protocolo garante a entrega precisa do vírus ao giro denteado, permitindo a marcação fluorescente e o nocaute genético mediado por CRISPR para estudar circuitos neurais, função gênica e mecanismos de doenças in vivo.

Injeção viral estereotáxica para edição de genes neuronais direcionados no cérebro de camundongos

Este artigo descreve como microinject vetores virais em cérebro de camundongos e teste em um paradigma de preferência local condicionado, que inclui uma fase de aquisição, extinção e reintegração.

Microinjeção estereotáxica de vetores virais Expressando Cre Recombinase para estudar o papel de genes alvo em cocaína condicionado Lugar de Preferência

Injecção estereotáxica de lentivírus expressando cDNAs ou shRNAs pode modular a expressão de genes em áreas específicas do cérebro de ratos. Aqui, apresentamos um protocolo para combinar injeções estereotáxica com tarefas comportamentais, como o campo aberto Test (OFT) eo Teste de Natação Forçada (FST).

Aplicando a técnica de injecção estereotáxica para estudar os efeitos genéticos sobre os comportamentos animais

Aqui, apresentamos um protocolo para infusão cerebral estereotáxica direta de beta-amilóide. Esta metodologia fornece um modelo alternativo de camundongo in vivo para abordar os efeitos de curto prazo da beta-amilóide nos neurônios cerebrais.

Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus

MicroRNAs desempenham papéis cruciais no cérebro e são alvos potenciais para modelar a neurodegeneração. No entanto, perturbar os níveis de miRNA é um desafio devido ao curto comprimento do miRNA e à inacessibilidade do tecido cerebral. Este vídeo apresenta um método para o design do antagomir e entrega específica do cérebro usando um neuropeptídeo em camundongos.

Uma alternativa simples para injeção estereotáxica para Brain Knockdown específico de miRNA

O sistema / Cas9 CRISPR oferece o potencial para fazer genoma segmentado edição acessível e disponível para a comunidade científica. Este protocolo destina-se a demonstrar como criar vírus que vai nocaute um gene de interesse utilizando o sistema / Cas9 CRISPR, e depois injetá-las estereotáxicamente no cérebro do rato adulto.

Concepção, embalagem, entrega e de alto título CRISPR retro e lentivírus via estereotáxica Injection

O objetivo deste protocolo é descrever uma aproximação para analisar o comportamento de pilhas neurais adultas da haste/progenitor em resposta à manipulação chemogenetic de um circuito neural local específico.

Regulação específica do circuito de assaying de células precursoras neurais hipocampais adultas

Este artigo demonstra a preparação de uma janela de imagem personalizada complementada com cânula de infusão e sua implantação na região ca1 do hipocampo em camundongos.

Procedimento de craniotomia para visualizar atividades neuronais no hipocampo de ratos comportadores

Aprenda a injeção estereotáxica de lentivirus expressando microRNA na região CA1 do hipocampo de camundongos para avaliar efeitos cognitivos. Este método permite controle espacial e temporal da expressão gênica em neurociência.

Injeção estereotáxica de microRNA-expressando Lentiviruses ao mouse Região CA1 do hipocampo e avaliação do resultado Behavioral

Explorar mais vídeos