Name: Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprenda a avaliar a entrega gênica usando nanopartículas poliméricas não virais. Este método utiliza citometria de fluxo de alta vazão e análise de rastreamento de nanopartículas para caracterizar eficiência de transfecção.

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Os autores agradecem a MSCRF TEDCO (2009-MSCRFE-0098-00) e NIH R21CA152473 de apoio.

1. Sementeira celular <ol><li> Não permitir que as células a crescer para overconfluency. Usar células de passagem iniciais, quando a transfecção de células primárias. </li><li> Vinte e quatro horas antes da transfecção, as células Tripsinizar, contar as células utilizando um hemocitómetro, e dilui-se a suspensão de células com meio para atingir a densidade celular desejada (células / volume). Células de sementes para cultura de tecidos clara-tratado de fundo plano de 96 poços, utilizando um reservatório e pipetas multicanal. A densidade escolhida deve dar 70-80% de confluência no dia da transfecção. Por exemplo, como exibido na Tabela 1, as células foram diluídas para 25 a 50 células / ul para os dados de transfecção mostradas aqui. </li></ol> 2. A transfecção de células <ol><li> Diluição do polímero e os estoques de DNA. Descongelar polímero e soluções de reserva de ADN, à temperatura ambiente (RT). Diluir solução-mãe de polímero e solução de ADN, de uma forma clara separadamente placas de 96 poços, utilizando uma pipeta de 12 canais, Com o solvente apropriado para as concentrações necessárias para obter o peso de polímero desejada para razões de ADN de peso (p / p). Neste caso, o solvente escolhido é de 25 mM de tampão de acetato de sódio (pH = 5,2). <ol><li> DNA de diluição. Tipicamente, o DNA armazenado a 1 mg / ml é diluída em tampão de acetato de sódio a uma concentração de 0,03 a 0,06 mg / ml de uma forma clara não-tecido de cultura tratada placa de 96 poços (um bem para uma única formulação). Tabela 2 mostra o protocolo de diluição típico de DNA para uma única formulação usada para transfectar quatro cavidades replicadas em uma placa de 96 poços com células a partir do Passo 1. </li><li> Diluição do polímero. A solução de 100 mg / ml de polímero / DMSO é diluído em tampão de acetato de sódio de acordo com a concentração necessária para obter o desejado polímero de DNA proporção peso / peso. A gama de peso / peso rácios tipicamente utilizados para a entrega de genes com poli (beta-amino éster) s (PBAEs) é de 20 a 100. Polímeros PBAE são primeiro diluídos para 10 mg / ml, seguido de diluição do protocolo como mostrado na Tabela 3. As diluições de polímero pode ser realizada de uma forma clara não-tecido de cultura tratada placa de 96 poços, que corresponde à orientação da amostra da placa de diluição do DNA. </li></ol></li><li> Formação de nanopartículas. Adicionar a solução PBAE a um volume igual da solução de DNA de plasmídeo utilizando uma pipeta de 12 canais e misturar vigorosamente. Deixe a mistura incubar à temperatura ambiente durante 10 min para permitir a auto-montagem. </li><li> Transfecção de nanopartículas. Na sequência de auto-montagem, a 20 ul de nanopartículas são adicionados por poço de meio de cultura, gota a gota com a pipeta 12 de canal. Cavidades replicadas são deixados sem tratamento, ou são transfectados com reagentes disponíveis comercialmente, como controles. As células transfectadas foram incubadas a 37 ° C durante duas a quatro horas e, em seguida, os poços são substituídos por meios frescos (100 ul / poço). A escolha do tempo de incubação depende da linha celular, as condições de cultura, e um sistema de transfecção. A diferença de transfecçãoeficácia e toxicidade celular como um resultado de variação período de incubação será quantificado pelo protocolo de análise descrito no Passo 3. </li></ol> 3. Análise da eficácia de transfecção e toxicidade celular A eficiência de transfecção é analisada visualmente com um microscópio de fluorescência e quantificada utilizando um citómetro de fluxo de 48 horas após a transfecção. Toxicidade celular é analisada visualmente com um microscópio de fluorescência e quantificada utilizando o ensaio CellTiter 96 One aquosa 24 horas após a transfecção. <ol><li> A microscopia de fluorescência. Analisar visualmente os poços durante a expressão do gene repórter transfectadas (por exemplo, EGFP ou DsRed) utilizando o canal apropriado fluorescência. Aquisição de imagens para cada poço, a escolha de campos de visão que representam adequadamente a eficiência de transfecção para as formulações particulares (Figura 1). Faça uma nota de qualquer toxicidade celular observado visualmente. </li><li> Citometria de Fluxo. <ol><li> Use pipetas multicanal para preparar a placa de 96 poços por citometria de fluxo. Lavar com PBS, Tripsinizar com 30 ul / poço de tripsina / EDTA, neutralizar com 170 ul de tampão de FACS (PBS + 2% FBS), pipeta-se para baixo e, em cada poço, incluindo à volta dos rebordos, e transferir o volume de 200 uL, de todo cada poço em poços correspondentes de uma ou de fundo redondo de fundo em V-placa de 96 poços. </li><li> Centrifugar a placa a 130 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Remover 170 ul de meio de cada poço e as células pipeta para ressuspender, evitando bolhas de ar. Para utilizar uma mancha de viabilidade, como iodeto de propídio (PI), adicionam-se 10 ul de tampão FACS + PI (50:1 tampão FACS: PI de diluição; PI concentração estoque de 1 mg / ml) a cada poço. Colocar imediatamente em gelo e cobrir de luz. </li><li> Comece o C6 citômetro de fluxo Accuri, o HyperCyt de 96 poços anexo, eo software HyperView. Use HyperView Design e guias Protocolo de escolher o adequado pTipo de tarde, layout da placa e outras configurações como trepidação / SIP / lavar / agitar tempo. Para o protocolo acima, os parâmetros que se seguem foram usados, um primeiro prato de pré-, durante um minuto, e um batido de chapa pré-, durante 30 segundos a 2400 rpm. Tempo gole foi marcada para 15 segundos a 15 rpm, uma sonda enxaguar bem para cada 2 segundos, e uma inter-agitar bem a cada 12 poços para 12 segundos a 2.400 rpm. A vibração da inter-bem é importante manter as células dispersas nos meios de comunicação, bem como para a melhor capacidade de processamento dos dados, incluindo quebras temporizadas, entre grupos de cavidades (neste caso, 12 seg). </li><li> Use HyperView guia Identificação Bem para processar os dados e separados, para o bem apropriado (Figura 2). A fim de identificar os poços individuais, ele pode ajudar a usar filtro do software de ruído, bem como incluindo uma base mesmo filtro sob as configurações avançadas. </li><li> Quantificar percentual de positivamente transfectadas células vivas pela passagem apropriada para separar pop diferenteulations (Figura 3). Primeiro visualizar os dados de fluxo de um gráfico de dispersão FSC vs SSC, a fim de separar as células de detritos (Figura 3A). Se iodeto de propídio (PI) foi usado, porta a população de células individuais e vista que os dados sobre uma trama FSC vs FL3 de modo a separar as células vivas a partir de células mortas e as células vivas de porta. A fim de quantificar o número de células transfectadas, ver a população de células vivas nos canais apropriados, por exemplo, a GFP pode ser visto em FL1. Usando a população não tratada, portão as células não tratadas, a fim de identificar o sinal de fundo (Figura 3B). As células transfectadas de forma positiva pode então ser isolado usando este portão e exibindo as populações transfectadas utilizando tanto dispersão e gráficos de contorno (Figura 3C e 3D). Pode haver uma série contínua de células transfectadas de forma positiva, como células de diferentes serão transfectados para graus diferentes de fluorescência. </li></ol></li><html><li> CellTiter 96 Um ensaio aquoso <ol><li> Transfectar uma outra placa, exactamente da mesma maneira que para as medições da toxicidade celular. </li><li> Ml de pré-mistura de 96 1 de solução aquosa de ensaio CellTiter One com 10 ml de meio fresco. Remover media a partir de células e usar uma pipeta multicanal para adicionar 110 ul da solução de pré-mistura media + por poço. </li><li> Medir a absorvância a 490 nm a cada intervalo de uma hora, 1-4 horas até que a absorvância do poço com a condição sem tratamento está no intervalo linear do ensaio. Incluem quatro poços de controlo com a mídia única solução + para uma leitura absorvância de fundo. </li><li> Valores médios da absorbância dos quatro poços repetições por condição e subtrair a absorvância de fundo média de cada média. Normalizar a média corrigida para cada condição de tratamento com a média corrigida da condição sem tratamento para determinar a viabilidade celular por cento. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 4 Nanoparticle. Dimensionamento com NTA e Plasmideo Cálculos partícula por <ol><li> Primeiro sistema de fluidos do NS500 NanoSight por uma bomba de diluente para a frente em aproximadamente 1/5th a velocidade máxima ea bomba de amostra para trás em aproximadamente 1/10th a velocidade máx. Continue até que o sistema de fluidos é lavada com o diluente. </li><li> Prepare as nanopartículas para serem analisados. No caso de PBAEs, separadamente diluir o DNA plasmídeo estoque (1 mg / ml) e estoque PBAE (100 mg / ml) em tampão de acetato de sódio (25 mM, pH 5), em tubos de Eppendorf. </li><li> Dilui-se a concentração de DNA plasmídico a 0,06 mg / ml. Concentração do polímero pode variar de acordo com a proporção de peso-peso de polímero necessária para ADN (por exemplo, por 60 wt / wt partículas, o polímero é diluído para 3,6 mg / ml). </li><li> Adicionar a solução de polímero a um volume igual da solução de DNA de plasmídeo e misturar vigorosamente. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 10 min para permitir a auto-montagem. </li><li> Dilute a solução de nanopartículas de 100 vezes em PBS para que a concentração das nanopartículas para estar no intervalo apropriado para NTA e para se obter um volume final de, pelo menos, 500 uL. </li><li> Carregar a amostra no NanoSight colocando o tubo de carregamento dentro da amostra de tubo Eppendorf (Figura 4A). Certifique-se de não introduzir bolhas de ar. </li><li> No modo de captura, aumentar o nível da câmara até que as partículas podem ser vistas. Ajustar o foco, de modo que as partículas de aparência suave (Figura 4A e 4B). </li><li> Enquanto no modo padrão, ajustar o nível da câmara para além do ponto de que todas as partículas podem ser vistas no ecrã. Em seguida, diminui o nível da câmara para o nível mais baixo de tal modo que as partículas podem ainda ser observadas. Se um nível de câmera intermediário é necessário, entrar em modo avançado e modificar o obturador da câmera e ganhar para os níveis adequados. </li><li> Visualmente verifique se há entre 20 - 100 partículas no screen. Um número ideal para o rastreamento de nanopartículas é de aproximadamente 50 partículas. Se há muitos ou poucos, lave o NS500, ajustar a diluição em PBS, e re-carregar a amostra. </li><li> Ajuste a duração da captura de acordo com a tabela de modo standard. Tipicamente 30 - 60 seg é um comprimento de captura apropriado (Figura 4B). </li><li> Para carregar a amostra seguinte, lave o sistema, em seguida, voltar a carregar a amostra nova. </li><li> Uma vez que os vídeos são capturados, avançar para a fase de processamento, abrindo um arquivo de vídeo. </li><li> Há um número de parâmetros que pode ser ajustado a fim de melhor processar um vídeo (Figura 4C). O objectivo consiste em seleccionar os parâmetros que melhor capturar todas as partículas sobre a tela, conforme indicado por uma marca de cruz vermelha na tela sobre cada partícula (Figura 5). </li><li> Aumentar o ganho de tela para ver melhor as partículas. Sob o modo padrão ou avançado, selecione o ajuste automático para os parâmetros por clicking caixas apropriadas. No caso em que as configurações de auto não adequadamente selecionar partículas, desmarque a caixa e definir manualmente os parâmetros (Figura 4C). </li><li> Uma vez que todas as partículas são colhidos na tela, clique no botão de processo do software para processar o arquivo de vídeo (Figura 4C). Isto fornece a distribuição do tamanho das partículas, a média de tamanho, assim como a concentração de partículas. </li><li> A fim de assegurar que a concentração de partículas é exacta, alterar a diluição PBS, tal como através do aumento da diluição em 2x, e repetir o procedimento acima. Medindo diluições múltiplas de uma mesma amostra é recomendado para assegurar que a medição da concentração da amostra é precisa. Uma boa variedade de medição é 10 7 -10 9 partículas / ml. </li><li> Verificar se todos os plasmídeos são incorporados em nanopartículas por electroforese em gel de execução das nanopartículas e avaliar se qualquer DNA livre está presente.Se nem todos os plasmídeos são encapsulados, utilizar técnicas padrão para medir a absorvância de DNA a fim de quantificar o total plasmídeos encapsulados. </li><li> Para calcular o número médio de partículas por plasmídeos, dividir a concentração total de plasmídeo encapsulado pela concentração de partículas medido NTA. A fim de estimar a distribuição da amostra de plasmídeo por partícula, da primeira utilização do NTA histograma de tamanho de partícula para calcular a fracção de volume de cada compartimento de 1 nm de partículas. Multiplicar esta fracção de volume de distribuição pela quantidade total de plasmídeo para obter o número de plasmídeos em cada compartimento. Dividir estes números por o número de partículas em cada compartimento para obter o número de plasmídeos a partículas por cada tamanho de partícula (Figura 6). </li></ol>

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<li>Kreiss, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+DNA+size+does+not+affect+the+physicochemical+properties+of+lipoplexes+but+modulates+gene+transfer+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency.</a> Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).</li>
<li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-sized+self-assembling+lamellar+complexes+between+plasmid+DNA+and+cationic+micelles+promote+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).</li>
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</ol>

Os autores relatam nenhum conflito de interesse.

Os protocolos acima descrevem métodos para avaliar a eficácia de transfecção de formulações de nanopartículas, bem como uma maneira de caracterizar o tamanho de partícula e carga de DNA das nanopartículas. O número de plasmídeos por partícula é um parâmetro importante que pode ajudar a prever a eficácia da partícula e pode também ser usado para a determinação de dose. Análise de rastreamento de nanopartículas pode ser realizado em uma variedade de diferentes soluções aquosas, tais como os que diferem em concentração de ...

A determinação do número de plasmídeos complexados por nanopartículas é importante desenhar eficazes de nanopartículas à base de estratégias de distribuição de genes, em particular para co-entrega de plasmídeos múltiplos para a mesma célula-alvo, tal como muitas vezes é necessário reprogramar os estudos de células estaminais 12. Algumas abordagens para calcular o número de plasmídeos associados com uma nanopartícula única têm sido descritos, e cada método tem desvantagens das técnicas usadas para a estimativa de 13-16. Quantum dot rotulagem (QD), combinada com MET foi utilizada para estimar os plasmídeos por partícula de quitosano baseada em nanopartículas. Estimativa com esta técnica QD é complicado devido à necessidade de rotular o DNA, o que pode alterar as suas propriedades de auto-montagem, a possibilidade de que o DNA não marcado encapsulado não é directamente detectada; plasmídeos potencialmente sobrepostos e QDs nas imagens de TEM 2D de partículas, e outras hipóteses simplificadoras 13. Uma abordagem alternativa, que é umAPLICÁVEL microdomínios quando ordenados existir nas partículas tem sido usado para estudar lipopoliamina-DNA por meio de complexos de crio-microscopia electrónica de transmissão (Cryo-TEM), dispersão de raios X e dispersão dinâmica de luz (DLS) 14,15. Infelizmente, os materiais, tais como as nanopartículas de polímeros investigados aqui, não são aplicáveis ​​a este método. . Em outro estudo, Collins et al utilizaram um fluxo de partículas técnica de análise de imagem para o estudo (Lys) 16 contendo peptídeos / DNA complexos, no entanto, o seu método só pode avaliar maiores, micron de tamanho de partículas 16. Assim, foi recentemente desenvolvido um ensaio de novo e flexível para quantificar o número de plasmídeos por nanopartículas de 11.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Tampão fosfato salino, 1x (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2MV BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> De tampão de acetato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7899 </td><td> Diluir a 25 mM em água desionizada </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP DNA </td><td> Biopharmaceuticals Elim </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> DNA DsRed </td><td> Addgene </td><td> 21718 </td><td></td></tr><tr><td> PEI, ramificado </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter aquosa 96 Um </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materiais </td></tr><tr><td> Fundo plano claro placa de 96 poços, estéril </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> Fundo redondo clara placa de 96 poços, estéril </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12 canais Finnpipette </td><td> Thermo Scientific </td><td> NA </td><td> 5-50 e 50-300 ul </td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência </td><td> Zeiss </td><td> NA </td><td> Número do Modelo: AX10 </td></tr><tr><td> C6 citômetro de fluxo Accuri </td><td> BD Biosciences </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> Anexo HyperCyt </td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> NanoSight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação de entrega gene polimérico nanopartículas por análise nanoparticle rastreamento e alta capacidade de citometria de fluxo

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral de entrega de genes utilizando nanopartículas poliméricas emergiu como uma abordagem atraente para a terapia de gene para tratar uma doença genética e como uma tecnologia para a medicina regenerativa 2. Ao contrário dos vírus, que têm problemas de segurança significativos, as nanopartículas de polímeros pode ser concebido para ser não-tóxico, não-imunogénicas, não mutagénica, mais fáceis de sintetizar quimicamente versátil, capaz de transportar cargas maiores de ácidos nucleicos e biodegradável e / ou ambientalmente sensíveis. Os polímeros catiónicos auto-montar com o DNA carregado negativamente pela interacção electrostática, para formar os complexos da ordem de 100 nm, que são normalmente chamados de nanopartículas poliméricas. Exemplos de biomateriais usados ​​para formar nanopartículas nanoescala de entrega de genes policatiónicos incluem polilisina, polyphosphoesters, poli (amidoaminas) s e polietilenoimina (PEI), que é um não-degradável off-the-shelf polímero catiónico vulgarmente utilizados para a entrega de ácidos nucleicos 1,3. Poli (beta-aminoéster) s (PBAEs) são uma nova classe de polímeros catiónicos que sejam 4 hidroliticamente degradável 5,6 e têm-se mostrado eficazes na entrega de genes em tipos de difícil transfectam de células, tais como células endoteliais humanas da retina (HRECs) 7, células epiteliais mamárias de rato 8, células cerebrais humanas cancerosas 9 e macrovasculares (veia umbilical humana, HUVECs) células endoteliais 10. Um novo protocolo para a caracterização de nanopartículas poliméricas utilizando análise de nanopartículas de rastreamento (NTA) é descrito. Nesta abordagem, tanto a distribuição do tamanho de partícula e da distribuição do número de plasmídeos por partícula são obtidos 11. Além disso, um alto rendimento de ensaio de transfecção placa de 96 poços para rastreio rápido da eficácia de transfecção de nanopartículas poliméricas é apresentado. Neste protocolo, o poli (beta-amino éster) s (PBAEs) são utilizados como polímeros de modelo e da retina humana (células endoteliais HRECs) são utilizados como model células humanas. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para avaliar qualquer nanopartícula de polímero e de qualquer tipo de células de interesse num formato de placa de multi-poços.

A Figura 1 mostra uma imagem de microscopia de fluorescência de um exemplo de uma transfecção bem sucedida de HRECs com o plasmídeo EGFP. A imagem de campo claro é útil para assegurar que as células mantêm a sua morfologia normal. Além disso, os ensaios de viabilidade celular, tais como ensaios de MTS ou semelhantes, pode ser utilizado para avaliar a toxicidade das nanopartículas 7. A citometria de fluxo, tal como descrito, pode ser utilizado para quantificar a eficiência da transfecção. Ao u...

Um protocolo para a análise de nanopartículas de seguimento (NTA) e de alto rendimento de citometria de fluxo para avaliar as nanopartículas poliméricas entrega de genes é descrito. NTA é utilizada para caracterizar a distribuição do tamanho de partícula das nanopartículas e a distribuição de partículas por plasmídeo. De alto rendimento de citometria de fluxo permite a avaliação da eficácia de transfecção quantitativo para uma biblioteca de biomateriais de entrega de genes.

Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar e avaliar experimentos de entrega gênica utilizando nanopartículas poliméricas não virais. Isso é realizado primeiramente transfectando células com partículas de entrega gênica. A eficiência de transfeção é então avaliada por microscopia e análise de citometria de fluxo de alto rendimento.Em seguida, a concentração da distribuição de tamanho das nanopartículas e o número de plasmídeos por partícula são determinados utilizando um instrumento de análise de rastreamento de nanopartículas. Em última instância, este método permite a caracterização do tamanho das nanopartículas e a eficácia de transfeção utilizando nanopartículas. A principal vantagem do uso de nanopartículas poliméricas biodegradáveis para entrega gênica é que elas podem ser mais seguras e eficazes do que outros métodos de transferência gênica.A principal vantagem da análise de rastreamento de nanopartículas em comparação com métodos existentes, como a dispersão dinâmica de luz, é que a análise de rastreamento de nanopartículas fornece diretamente a distribuição média por número e a concentração de partículas. Este método ajudaria a responder perguntas fundamentais na área

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Bioengineering

Bioengenharia

Este artigo descreve um método para sintetizar nanoprecipitation polímero baseado em nanopartículas usando dibloco co-polímeros. Vamos discutir a síntese de dibloco co-polímeros, a técnica nanoprecipitation e aplicações potenciais.

Formulação de nanopartículas poliméricas através da técnica de dibloco Nanoprecipitation

Tipo B à base de gelatina sistema nanovectors engenharia (GENS) foi desenvolvido para a entrega do gene sistêmica e transfecção no tratamento de câncer pancreático. Por modificação com receptor fator de crescimento epidérmico (EGFR) peptídeos específicos na superfície da nanparticles, eles poderiam alvo no receptor EGFR e liberação do plasmídeo em reduzir ambiente, tais como altas concentrações de glutationa intracelular.

Entrega de genes e Transfection em células pancreáticas humanas Cancer usando Fator de Crescimento Epidérmico Receptor-alvo à base de gelatina Nanovectors Engineered

Neste artigo, nós descrevemos um método utilizando multi-espectral citometria de fluxo de imagem para quantificar a internalização de nanopartículas polianidrido ou bactérias por células RAW 264.7.

Analisando internalização celular de nanopartículas e bactérias multi-espectral por Citometria de Fluxo Imagem

Nanopartículas de plantas virais (VNPs) são promissoras plataformas para aplicações em biomedicina. Aqui, descrevemos os procedimentos para a propagação de plantas VNP, purificação, caracterização e bioconjugação. Por fim, mostramos a aplicação de VNPs para homing tumor e de imagem usando um modelo de xenoenxerto mouse e imagens de fluorescência.

Nanopartículas virais para<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Tumor

Análise da interação de nanopartículas com subpopulações definidas de células do sistema imunológico, por citometria de fluxo.

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Descrevemos técnicas baseadas em imagens de animais inteiros e citometria de fluxo para monitorar a expansão de células T CD8+ específicas do antígeno em resposta à imunização com nanopartículas em um modelo murino de vacinação.

Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação

Este manuscrito descreve uma nova técnica que permite a detecção da expressão gênica intracelular após a endocitose de nanopartículas marcadas com fluorescência diretamente em células vivas. O método não requer manipulação das células e não é restrito em relação ao gene ou espécie alvo.

Detecção de intracelular Expressão Gênica em células vivas de murino, humano e porcino Origem Usando nanopartículas marcados com fluorescência

A má compreensão do desempenho in vivo dos nanomedicamentos impede sua tradução clínica. Procedimentos para avaliar o comportamento in vivo de nanomedicamentos contra o câncer em níveis sistêmicos, teciduais, unicelulares e subcelulares em camundongos imunocompetentes portadores de tumor são descritos aqui. Essa abordagem pode ajudar os pesquisadores a identificar nanomedicamentos promissores contra o câncer para tradução clínica.

Um método completo para avaliar o<em&gt; In Vivo</em&gt; Performance of Cancer Nanomedicinas

Neste protocolo, descrevemos o fluxo de trabalho completo para isolamento rápido das vesículas extracelulares de sangue total humano e caracterização de marcadores específicos pela análise de controle de nanopartículas baseada em fluorescência. Os resultados apresentados mostram um elevado nível de reprodutibilidade e podem ser ajustados para sobrenadantes de cultura de células.

Caracterização de baseada em fluorescência rápida das vesículas extracelulares única no sangue humano, com análise de acompanhamento de nanopartículas

Aqui, um protocolo simples é apresentado para a produção de nanopartículas mRNA baseadas em polímeros poli (beta aminoester), fáceis de serem adaptados alterando o mRNA encapsulado. O fluxo de trabalho para sintetizar os polímeros, as nanopartículas e sua caracterização essencial in vitro também são descritos. Também é acrescentada uma prova de conceito em relação à imunização.

Síntese e Caracterização de nanopartículas poli-carregadas de mRNA (Beta Aminoesters) para fins de vacinação

Esse protocolo apresenta a fragmentação de Rayleigh como um processo leve para aerossolizar vetores de mRNA não virais. A deposição regional para vetores de mRNA aerossolizados é avaliada pelo modelo de Entrada Nasal Idealizada de Alberta (AINI). A expressão da proteína de fluorescência verde (GFP) em células pulmonares humanas representa a manutenção das funções fisicoquímicas e biológicas dos vetores de mRNA pós-aerossolizados.

Administração intranasal de poliplexos de mRNA via aerossóis de quebra de Rayleigh: Um método in vitro para deposição nasal e testes funcionais

Aprenda a avaliar a entrega gênica usando nanopartículas poliméricas não virais. Este método utiliza citometria de fluxo de alta vazão e análise de rastreamento de nanopartículas para caracterizar eficiência de transfecção.

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Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

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