Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

O objetivo geral deste procedimento é realizar e avaliar experimentos de entrega gênica utilizando nanopartículas poliméricas não virais. Isso é realizado primeiramente transfectando células com partículas de entrega gênica. A eficiência de transfeção é então avaliada por microscopia e análise de citometria de fluxo de alto rendimento.

Em seguida, a concentração da distribuição de tamanho das nanopartículas e o número de plasmídeos por partícula são determinados utilizando um instrumento de análise de rastreamento de nanopartículas. Em última instância, este método permite a caracterização do tamanho das nanopartículas e a eficácia de transfeção utilizando nanopartículas. A principal vantagem do uso de nanopartículas poliméricas biodegradáveis para entrega gênica é que elas podem ser mais seguras e eficazes do que outros métodos de transferência gênica.

A principal vantagem da análise de rastreamento de nanopartículas em comparação com métodos existentes, como a dispersão dinâmica de luz, é que a análise de rastreamento de nanopartículas fornece diretamente a distribuição média por número e a concentração de partículas. Este método ajudaria a responder perguntas fundamentais na área de entrega gênica não viral, como o número de plasmídeos por partícula, o que é importante para estudos de coexpressão. O protocolo a seguir é demonstrado utilizando células endoteliais retinianas humanas ou hre como células modelo e poli beta amino ésteres ou PBA AEs como polímeros modelo.

Observe que as condições de cultivo e os solventes podem precisar ser ajustados dependendo das células e polímeros utilizados 24 horas antes da transfeção. Use uma pipeta multicanal para semear hre em placas de cultura de tecidos transparentes, com fundo plano, de 96 poços, numa concentração de 25 a 50 células por microlitro.

Isso resultará em uma confluência de 70 a 80% no dia da transfeção; prepare e rotule placas claras de 96 poços, não tratadas para cultura de tecidos, para servirem como placas-mestre na preparação e diluição do PBA e do DNA. Duas placas idênticas serão preparadas.

Um para avaliar a toxicidade e outro para avaliar a eficiência de transfeção. Siga o polímero poli beta amino éster ou PVAE e as soluções estoque de P-E-G-F-P-N 1D NA em temperatura ambiente. Após descongelar, use uma pipeta de 12 canais para preparar um poço contendo 50 microlitros de DNA a 0,06 miligramas por mililitro em tampão de acetato de sódio 25 milimolar para cada condição.

A seguir, na mesma placa, dilua os polímeros PBAE até 10 miligramas por mililitro em tampão de acetato de sódio. Em seguida, dilua ainda mais os polímeros PBAE em razões de massa do polímero para massa do DNA de 30 e 60, em 50 microlitros de tampão de acetato de sódio. Para a formação de nanopartículas, use uma pipeta de 12 canais para combinar os 50 microlitros de PBAE diluído com os 50 microlitros de DNA plasmidial diluído, misturando vigorosamente por pipetagem para cima e para baixo.

Em seguida, deixe a mistura incubar à temperatura ambiente por 10 minutos para permitir a autoagregação. Após a autoagregação, utilize uma pipeta de 12 canais para adicionar gota a gota 20 microlitros da solução de nanopartículas a cada poço das células semeadas contendo meio, transfectando quatro poços por condição conforme mostrado neste diagrama. Para cada placa, reserve pelo menos quatro poços para cada um dos controles negativo e positivo.

O controle negativo consiste em células não tratadas e os controles positivos consistem em células transfectadas com um reagente comercialmente disponível, como lipo 2000 ou Fuge hd. Incube as placas com as células transfectadas a 37 graus Celsius por quatro horas. Após a incubação, utilize a pipeta de 12 canais para remover o meio das células e substitua por 100 microlitros por poço de meio hre fresco. Incube por mais 24 a 48 horas.

No dia seguinte, retire uma placa do incubador. Avalie a transfeção celular e a toxicidade por microscopia de fluorescência e quantifique a toxicidade celular utilizando o ensaio Cell Titer 96 Aqueous One, conforme descrito no texto acompanhante. Após 48 horas, retire a outra placa do incubador.

Avalie a eficiência de transfeção por fluorescência, microscopia e citometria de fluxo conforme descrito no texto acompanhante. Utilize os dados de toxicidade e transfeção obtidos aqui para determinar as concentrações ideais de PBAs a serem usadas em experimentos futuros. O Nano Site NS 500 é um instrumento de análise de rastreamento de nanopartículas que pode fornecer informações sobre a distribuição de tamanho de uma amostra de nanopartículas mediante o rastreamento da difusão de nanopartículas individuais; antes do uso, prepare o sistema fluidico do Nano Site em um tubo microcentrífuga de 0,5 mililitro.

Prepare o PBA e o DNA plasmático para análise como antes, nas mesmas concentrações utilizadas na seção anterior deste vídeo. Após a automontagem, dilua a solução de nanopartículas 100 vezes em PBS em um novo tubo de 1,5 mililitro para obter um volume final de pelo menos 500 microlitros. Isso resultará em uma concentração de nanopartículas na faixa apropriada para análise de rastreamento de nanopartículas.

Em seguida, carregue a amostra no sítio nano. Certifique-se de não introduzir bolhas de ar e verifique visualmente se há entre 20 e 100 partículas na tela. Um número ideal para o rastreamento de nanopartículas é aproximadamente 50 partículas.

Se houver partículas em excesso ou em número insuficiente, lave o NS 500, ajuste a diluição em PBS e recarregue a amostra. Se o número de partículas na tela estiver entre 20 e 100, capture os vídeos. Após a captura dos vídeos, prossiga para a etapa de processamento abrindo um arquivo de vídeo no mesmo software.

Em seguida, uma vez que o arquivo esteja aberto, aumente o ganho da tela. Selecione o ajuste automático dos parâmetros da imagem marcando as caixas apropriadas. Se uma partícula na tela for reconhecida pelo software, ela será marcada com uma cruz vermelha.

Após marcar todas as partículas, clique no botão processar no software para processar o arquivo de vídeo. O tamanho das partículas, as médias da distribuição de tamanho e a concentração de partículas serão então exibidas para verificar se a contagem de partículas está correta. Repita este procedimento utilizando a mesma amostra diluída por dois x e quatro.

Células em PBS apre foram transfectadas com nanopartículas E-G-F-P-P-B-A-E conforme mostrado neste vídeo. Para avaliar visualmente a eficiência de transfeção, realizou-se imagem por microscopia de fluorescência. Essas imagens mostram a fluorescência, o campo claro e as imagens fusionadas das células transfectadas. Como visto na imagem fusionada, a maioria das células expressa EGFP e mantém a morfologia normal.

Para quantificar a eficiência de transfeção, foi realizada citometria de fluxo, conforme pode ser observado nesta figura após o direcionamento na população viável. A população não ressecada não continha células positivas para EGFP. No entanto, 71,6% das células tratadas foram positivas para EGFP. A análise de rastreamento de nanopartículas foi então utilizada para determinar a distribuição de tamanho e a concentração das nanopartículas.

Para esta análise, é importante que a distribuição do tamanho das partículas seja monodispersa. Com base nessas informações, o número médio de plasmídeos por partícula pode ser calculado dividindo a concentração de plasmídeos na solução pela concentração de partículas determinada pelo NS 500. O número de plasmídeos por partícula é uma distribuição que reflete a distribuição do tamanho das partículas.

No interior da amostra, haverá partículas maiores com valor de plasmídeos por partícula acima da média, bem como partículas menores com valor de plasmídeos por partícula abaixo da média. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de não deixar polímeros degradáveis em solvente aquoso por muito tempo antes de adicionar as nanopartículas às células para uso com ncy; ajuste a diluição apropriada para a determinação do tamanho. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como transfectar tipos celulares aderentes com polímeros de entrega gênica não virais, bem como medir a eficácia da transfeção e a distribuição do tamanho das partículas.

Não se esqueça de que trabalhar com células humanas apresenta risco biológico. Sempre use equipamento de proteção individual e trabalhe em uma cabine de segurança biológica ao realizar este procedimento.