Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

O objetivo geral deste procedimento é realizar e avaliar experimentos de entrega de genes usando nanopartículas poliméricas não virais. Isso é feito primeiro seccionando células com partículas de entrega de genes. A eficiência da transfecção é então avaliada por microscopia e análise de citometria de fluxo de alto rendimento.

Em seguida, a concentração de distribuição de tamanho de nanopartículas e plasmídeos por partícula são determinados usando um instrumento de análise de rastreamento de nanopartículas. Em última análise, este método permite a caracterização do tamanho das nanopartículas e a eficácia da transfecção usando nanopartículas. A principal vantagem do uso de nanopartículas poliméricas biodegradáveis para entrega de genes é que elas podem ser mais seguras e eficazes do que outros métodos de transferência de genes.

A principal vantagem da análise de rastreamento de nanopartículas sobre os métodos existentes, como o espalhamento dinâmico de luz, é que a análise de rastreamento de nanopartículas fornece diretamente a distribuição média numérica e a concentração de partículas. Este método ajudaria a responder a questões-chave no campo de entrega de genes não virais, como o número de plasmídeos por partícula, o que é importante para estudos de co-expressão. O protocolo a seguir é demonstrado usando células endoteliais retinianas humanas ou hre como células modelo e ésteres de aminoácidos polibeta ou AEs PBA como polímeros modelo.

Observe que as condições de cultura e os solventes podem precisar ser ajustados dependendo das células e polímeros usados 24 horas antes. Transfecção. Use uma pipeta multicanal para semear hre em cultura de tecidos transparente tratada plana. Placas de 96 poços inferiores a uma concentração de 25 a 50 células por microlitro.

Isso dará 70 a 80% de fluência no dia da transfecção, preparará e rotulará a cultura de tecidos não tratada com clareza. Placas de 96 poços para servir como placas mestras para preparar e diluir o PBA e o DNA. Duas placas idênticas serão preparadas.

Um para avaliar a toxicidade e outro para avaliar a eficiência da transfecção. Siga as soluções de estoque de éster polibeta amino ou polímero PVAE e P-E-G-F-P-N 1D NA à temperatura ambiente. Uma vez hawed, use uma pipeta de 12 canais para preparar um poço contendo 50 microlitros de 0,06 miligramas por mililitro de DNA em tampão de acetato de sódio 25 milimolares para cada condição.

Em seguida, na mesma placa, diluir os polímeros PBAE a 10 miligramas por mililitro em tampão acetato de sódio. Em seguida, dilua ainda mais os polímeros PBAE em proporções de peso do polímero para peso do DNA de 30 e 60 e 50 microlitros de tampão acetato de sódio. Para a formação de nanopartículas, use uma pipeta de 12 canais para combinar os 50 microlitros de PBA diluído com os 50 microlitros de DNA plasmático diluído misturados vigorosamente pipetando para cima e para baixo.

Em seguida, deixe a mistura incubar em temperatura ambiente por 10 minutos para permitir a automontagem. Após a automontagem, use uma pipeta de 12 canais para adicionar 20 microlitros da solução de nanopartículas gota a gota a cada poço das células semeadas contendo quatro poços transfectados médios por condição, conforme mostrado neste diagrama. Para cada placa, reservar pelo menos quatro alvéolos para cada um dos controlos negativos e positivos.

O controle negativo consiste em células não tratadas e os controles positivos, consistem em células transfectadas com um reagente disponível comercialmente, como lipo 2000 ou Fuge hd. Incube as placas com as células transfectadas a 37 graus Celsius por quatro horas Após a incubação, use a pipeta de 12 canais para remover o meio das células e substitua-o por 100 microlitros por poço de hre fresco. Incubar em meio por mais 24 a 48 horas.

No dia seguinte, remova uma placa da incubadora. Avalie a transfecção e a toxicidade celular por microscopia de fluorescência e quantifique a toxicidade celular usando o ensaio aquoso de título celular 96, conforme descrito no texto anexo. Após 48 horas, remova a outra placa da incubadora.

Avalie a eficiência da transfecção por fluorescência, microscopia e citometria de fluxo, conforme descrito no texto anexo. Use os dados de toxicidade e transfecção adquiridos aqui para determinar as concentrações ideais de PBAs a serem usadas em experimentos futuros. O nano site NS 500 é um instrumento de análise de rastreamento de nanopartículas que pode fornecer informações sobre a distribuição de tamanho de uma amostra de nanopartículas, rastreando a difusão de nanopartículas individuais antes de usar o sistema fluídico do nano site em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro.

Prepare o PBA e o DNA plasmático para análise como antes nas mesmas concentrações usadas na seção anterior deste vídeo. Após a automontagem, diluir a solução de nanopartículas 100 vezes em PBS em um novo tubo de 1,5 mililitro para obter um volume final de pelo menos 500 microlitros. Isso produzirá uma concentração de nanopartículas na faixa apropriada para análise de rastreamento de nanopartículas.

Em seguida, carregue a amostra no nano site. Certifique-se de não introduzir bolhas de ar verificadas visualmente para garantir que haja entre 20 a 100 partículas na tela. Um número ideal para rastreamento de nanopartículas é de aproximadamente 50 partículas.

Se houver muitos ou poucos, lave o NS 500, ajuste a diluição em PBS e recarregue a amostra. Se o número de partículas na tela estiver entre 20 a 100, capture vídeos. Depois que os vídeos forem capturados, prossiga para o estágio de processamento abrindo um arquivo de vídeo no mesmo software.

Então, quando o arquivo estiver aberto, aumente o ganho da tela. Selecione o ajuste automático para os parâmetros de imagem clicando nas caixas apropriadas. Se uma partícula na tela for reconhecida pelo software, ela será marcada com uma cruz vermelha.

Depois que todas as partículas estiverem marcadas, clique no botão de processo no software para processar o arquivo de vídeo. O tamanho da partícula, as médias de tamanho de distribuição e a concentração de partículas serão exibidos para verificar se a contagem de partículas é precisa. Repita este procedimento usando a mesma amostra diluída em dois x e quatro.

Forex em PBS apre foram transfectados com as nanopartículas E-G-F-P-P-B-A-E como mostrado neste vídeo. Para avaliar visualmente a eficiência da transfecção, foram realizadas imagens de fluorescência. Essas imagens mostram o campo claro de fluorescência e as imagens mescladas das células transfectadas como visto na imagem mesclada, a maioria das células expressa EGFP e mantém a morfologia normal.

Para quantificar a eficiência da transfecção, foi realizada citometria de fluxo, como pode ser visto nesta figura após o gating na população viva. A população não ressecada não continha células positivas para EGFP. No entanto, 71,6% das células tratadas foram positivas para EGFP nano site A análise de rastreamento de nanopartículas foi então usada para determinar a distribuição e concentração do tamanho das nanopartículas.

Para esta análise, é importante que a distribuição do tamanho das partículas seja monodispersa. Usando essas informações, o número médio de plasmídeos por partícula pode ser calculado dividindo a concentração de plasmídeos em solução pela concentração de partículas determinada pelo NS 500. O número de plasmídeos por partícula é uma distribuição que reflete a distribuição do tamanho das partículas.

Dentro da amostra, haverá partículas maiores com o valor de plasmídeos por partícula maior que a média, bem como partículas menores com o valor de plasmídeos por partícula mais baixo que a média. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não permitir que polímeros degradáveis permaneçam em solvente aquoso por muito tempo antes de adicionar nanopartículas às células para usar ncy, ajuste a diluição apropriada para dimensionamento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como transfectar tipos de células de adesão com polímeros de entrega de genes não virais, bem como medir a eficácia da transfecção, bem como a distribuição do tamanho das partículas.

Não se esqueça de que trabalhar com células humanas é biorrisco. Sempre use equipamento de proteção individual e trabalhe em um gabinete de biossegurança durante a execução deste procedimento.