Avaliação da função muscular do músculo extensor longo dos dedos Ex vivo E músculo tibial anterior Em situ Em Ratos

O objetivo geral deste procedimento é determinar com precisão as propriedades mecânicas dos músculos dos membros do camundongo. Isso é feito medindo as propriedades contráteis e passivas do músculo extensor longo dos dedos ex evo, ou medindo as propriedades contráteis do músculo tibial anterior in situ, em última análise, podem ser obtidos resultados que permitem uma melhor compreensão das alterações fisiológicas em várias doenças musculares e se as intervenções experimentais melhoram a função muscular. Este método fornece uma avaliação completa da propriedade contrátil e passiva do músculo esquelético, que são dois aspectos inseparáveis da função mecânica do músculo esquelético necessários para o movimento corporal.

Portanto, a demonstração visual do procedimento de dissecção muscular é fundamental, pois requer muitas habilidades e manipulação. Além disso, a principal vantagem da avaliação NC dois da propriedade contrátil dos grandes músculos sobre os métodos existentes, como o SA in vitro, é que a abordagem do instituto não perturba o fluxo sanguíneo normal e a oxigenação. Uma grande preocupação no estudo da fisiologia muscular é a oxigenação do músculo alvo.

Em um SA in vitro para músculos grandes, como o músculo TA, a difusão de oxigênio pode não atingir o centro do músculo. As implicações dessa técnica se estendem a uma terapia de doenças musculares porque a medição precisa da função mecânica do músculo esquelético também pode ser usada para avaliar a progressão de doenças musculares e determinar a eficácia terapêutica de novas células gênicas e intervenções farmacológicas. Todos os procedimentos com animais apresentados aqui foram aprovados pelo comitê institucional induzido por cuidados com animais.

Esta é uma cirurgia de não sobrevivência para configurar o sistema de teste muscular para os experimentos ex vivo. Comece montando o banho de tecido prendendo o tubo oxi ao banho de tecido da camisa de água. Conecte o banho montado ao aparelho de montagem muscular e coloque a válvula de agulha na drenagem do banho.

Conecte a linha de gás e as linhas de circulação de água ao banho. Deixe a água circular a 30 graus Celsius na câmara da camisa e cinco PSI de gás fluam através do tubo de oxi. Encha o banho com tampão de campainha e equilibre-o com um fluxo de gás constante.

Ligue os instrumentos e carregue o software DMC para dissecar o arter muscular EDL arter anestesiando e colocando o mouse em uma almofada de aquecimento. Raspe o membro posterior e verifique se há sedação beliscando o dedo do pé. Posicione o mouse na placa de dissecação e retire a pele da perna.

Use dois alfinetes de costureira para prender o membro posterior no pé e no músculo grácil. Coloque uma lâmpada de aquecimento acima do mouse para manter a temperatura corporal central em 37 graus Celsius e continuamente funda todos os músculos expostos com tampão de toque quente sob um microscópio estéreo, disseque a pele para expor o tendão distal do TA e o ligamento extensor e remova suavemente a fáscia que cobre o músculo TA. Corte o ligamento extensor para liberar o tendão distal do TA.

Corte o tendão distal do TA e use-o para remover o músculo TA com um pedaço fino de algodão embebido em tampão de ringer. Pare o sangramento causado pela ruptura da vasculatura do músculo TA. Em seguida, usando uma sutura de seda de pão, amarre um nó quadrado duplo seguido por um nó de laço na junção do tendão do músculo distal do músculo EDL.

Em seguida, faça uma incisão no músculo bíceps feminino para expor o tendão proximal e amarre o mesmo conjunto de nós na junção do tendão do músculo proximal. Use a mesma linha de sutura para fazer um nó quadrado duplo. Para prender o gancho do braço de alavanca aos nós proximais ou distais.

Para dissecar suavemente o músculo EDL do membro posterior. Primeiro, corte o tendão proximal superior aos nós de sutura e corte a vasculatura abaixo do músculo. Em seguida, corte o tendão distal inferior ao nó de sutura.

Cubra o membro posterior exposto com um pedaço de algodão embebido em argolas. Por fim, prenda o gancho ao braço da alavanca e alinhe os músculos verticalmente entre os eletrodos. Prenda a linha de sutura distal ao pino fixo.

Mergulhe o músculo no tampão de ringer e ajuste a tensão de repouso para 1,0 gramas. Deixe o músculo se equilibrar por pelo menos 10 minutos. Para medir as propriedades contráteis do músculo EDL, defina os parâmetros para cada um dos seguintes protocolos no software DMC, conforme apresentado aqui.

Para o primeiro protocolo, estabilize o músculo EDL estimulando-o três vezes a 150 hertz com um 62º descanso entre as estimulações. Para o segundo protocolo, deixe os músculos relaxarem por dois minutos e, em seguida, determine o comprimento ideal ou NL estimulando o músculo EDL em diferentes tensões de repouso. Use o paquímetro digital para medir o comprimento ideal do músculo entre os nós distal e proximal.

Deixe o músculo relaxar por dois minutos. Para o protocolo três, ajuste a tensão de repouso para L zero e meça a força muscular na estimulação de contração única. Determine a tensão do Twitch ou pt, o tempo para o pico de tensão ou TPT e o tempo de meio relaxamento do pt.

Deixe o músculo relaxar por dois minutos. Para realizar o quarto protocolo, ajustar a tensão de repouso para NL e medir a força muscular testética gerada em diferentes frequências de estimulação. Meça o P NAUGH onde a Força Muscular atinge a força titânica máxima.

Meça o tempo até o pico de tensão e metade do tempo de relaxamento para o p-naugh. Comece o protocolo cinco permitindo que o músculo relaxe por cinco minutos, ajuste a tensão de repouso para L Naugh e aplique 10 ciclos de contrações excêntricas com dois minutos de descanso entre os ciclos. Calcule a perda de força relativa do PN após cada ciclo de contração excêntrica.

Por fim, retire o músculo EDL do aparelho e corte os tendões no local da sutura. Determine o peso úmido do músculo e calcule a área da seção transversal do músculo. Para medir as propriedades passivas do músculo EDL, disseque o músculo EDL contralateral e conecte-o ao aparelho conforme demonstrado anteriormente.

Neste vídeo, submeta o músculo a um protocolo de alongamento de seis etapas, onde o músculo é forçado a 160% L zero em incrementos de 10%. Analise o perfil de tensão de estresse para avaliar a propriedade viscosa do alongamento muscular EDL e mantenha o músculo em 10% L zero e meça a taxa de relaxamento de estresse nos seguintes prazos. Comece aquecendo o estágio animal termocontrolado a 37 graus Celsius com água circulatória.

Ligue o e carregue o software DMC. Depois de expor o músculo TA no membro posterior do camundongo anestesiado, use uma sutura de seda de pão para dar um nó quadrado duplo ao redor do ligamento da patela. Em seguida, dê um nó quadrado duplo seguido de um nó de laço na junção do tendão muscular ou MTJ do tendão distal.

Use a mesma sutura para fazer um laço de aproximadamente 10 milímetros. Posicione o animal de bruços e exponha o músculo bíceps fems. Exponha o nervo ciático e dê um nó quadrado duplo em torno de sua extremidade proximal.

Corte o nervo superior ao nó e disseque cuidadosamente cerca de cinco milímetros de seu comprimento em direção ao joelho. Não estique ou danifique o nervo. Prepare o músculo ta contralateral, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo, e cubra um dos membros posteriores com um pedaço de algodão embebido em tampão de ringer.

Em seguida, posicione o animal de bruços na plataforma do animal e use as linhas de sutura do ligamento da patela ao redor do pino do joelho para dar um nó quadrado duplo para prender o joelho. Em seguida, depois de prender os pés no bloco de proteção SIL, prenda a plataforma do animal no estágio termocontrolado e posicione a lâmpada de calor para manter a temperatura corporal do núcleo do animal em 37 graus Celsius. Depois de prender o eletrodo à plataforma, conecte o nervo ciático ao eletrodo, corte o tendão TA do membro posterior descoberto distal ao nó distal e prenda a alça de sutura ao gancho do braço de alavanca.

Cubra o músculo exposto do membro posterior com algodão embebido em tampão de toque quente para registrar as medidas contráteis do músculo TA. Use os parâmetros e o protocolo no software DMC demonstrado anteriormente neste vídeo para o músculo EDL e use o software para analisar os dados. Depois de fazer as medições do músculo TA, retire a alça de sutura do tendão distal do TA do gancho do braço de alavanca e meça as propriedades contráteis do músculo TA contralateral, conforme demonstrado Após a eutanásia do animal, remova os músculos TA e determine seu peso úmido.

Para calcular a área da seção transversal, esta tabela mostra as propriedades morfométricas do músculo EDL em camundongos pretos normais 10 e deficientes em distrofina ou MDX aos quatro a seis meses de idade. Mostramos aqui uma representação das propriedades contráteis e passivas do músculo EDL de camundongos pretos 10 e MDX, incluindo o tempo de força titânica máxima específica da força Twitch até o pico de tensão e o tempo de meio relaxamento da força titânica máxima absoluta. O tempo para atingir o pico de tensão e o tempo de meio relaxamento também podem ser calculados a partir da força de contração absoluta.

O perfil de tensão e a taxa de relaxamento de tensão são usados para descrever as propriedades passivas do músculo EDL. A ausência de distrofina tem um impacto significativo nas propriedades contráteis e passivas do músculo EDL. As forças específicas do Twitch e do Titanic são significativamente reduzidas no músculo M-D-X-E-D-L.

Por exemplo, o tempo para atingir o pico de tensão é significativamente mais rápido, enquanto o tempo de meio relaxamento é significativamente mais lento no músculo MDXEDL. Além disso, o perfil de tensão de tensão sugere que a rigidez é significativamente aumentada no músculo M-D-X-E-D-L. O músculo M-D-X-E-D-L também produz uma força de resistência significativamente maior antes de atingir o pico de estresse, enquanto os pós-pico diminuem muito mais rápido.

Além disso, a taxa de relaxamento do estresse foi significativamente maior no músculo M-D-X-E-D-L em comparação com a do músculo preto 10 EDL. Uma vez dominado o procedimento de dissecção, a análise ex vivo da propriedade contrátil e passiva do músculo EDL pode ser feita em 40 minutos. E a avaliação in situ da propriedade contrátil de ambos os músculos TA pode ser feita em 60 minutos após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para os pesquisadores avaliarem as propriedades contráteis e passivas do músculo esquelético no campo da doença muscular para ajudar a determinar a eficiência do tratamento após este procedimento. Outro método, como a análise histopatológica do músculo esquelético, pode ser realizado para responder a perguntas adicionais. Por exemplo, o efeito do tratamento experimental na histopatologia do músculo esquelético.