Name: Extracelularmente Identificar os neurônios motores de um pool do motor muscular em Aplysia californica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Aprenda a identificar neurônios motores extracelularmente em Aplysia californica usando eletrodos de vidro e sucção. Este método permite monitorar atividade neural durante padrões motores de alimentação.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH concessão NS047073 e concessão do NSF DMS1010434.

<ol><li>McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+relationships+of+the+cerebral+giant+cells+with+motoneurones+in+the+feeding+system+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis.</a> J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).</li>
<li>Benjamin, P. R., Rose, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+generation+of+bursting+in+the+feeding+system+of+the+snail%2C+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis.</a> J. Exp. Biol. 80, 93-118 (1979).</li>
<li>Peters, M., Altrup, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+organization+in+pharynx+of+Helix+pomatia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Motor organization in pharynx of Helix pomatia.</a> J. Neurophysiol. 52 (3), 389-409 (1984).</li>
<li>Church, P. J., Cohen, K. P., Scott, M. L., Kirk, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidergic+motoneurons+in+the+buccal+ganglia+of+Aplysia+californica%3A+immunocytochemical%2C+morphological%2C+and+physiological+characterizations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Peptidergic motoneurons in the buccal ganglia of Aplysia californica: immunocytochemical, morphological, and physiological characterizations.</a> J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 323-336 (1991).</li>
<li>Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+extracellular+stimulation+of+individual+neurons+in+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Eng%22%5BJournal%5D)">Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia.</a> J. Neural. Eng. 5 (3), 287-309 (2008).</li>
<li>Church, P. J., Lloyd, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+diverse+neuropeptide+cotransmitters+by+identified+motor+neurons+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia.</a> J. Neurosci. 11 (3), 618-625 (1991).</li>
<li>Church, P. J., Lloyd, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+multiple+identified+motor+neurons+recorded+intracellularly+during+evoked+feedinglike+motor+programs+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia.</a> J. Neurophys. 72 (4), 1794-1809 (1994).</li>
<li>McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vitro+Preparation+for+Eliciting+and+Recording+Feeding+Motor+Programs+with+Physiological+Movements+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica.</a> J. Vis. Exp. (70), e4320(2012).</li>
<li>Cullins, M. J., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrode+fabrication+and+implantation+in+Aplysia+californica+for+multi-channel+neural+and+muscular+recordings+in+intact%2C+freely+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals.</a> J Vis. Exp. (40), e1791(2010).</li>
<li>Zhurov, Y., Weiss, K. R., Brezina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+or+loose+coupling+between+components+of+the+feeding+neuromusculature+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Tight or loose coupling between components of the feeding neuromusculature of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 94 (1), 531-549 (2005).</li>
<li>Hurwitz, I., Goldstein, R. S., Susswein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+pattern-initiation+and+motor+functions+in+the+B31+and+B32+neurons+of+the+buccal+ganglia+of+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of pattern-initiation and motor functions in the B31 and B32 neurons of the buccal ganglia of Aplysia californica.</a> J. Neurophysiol. 71 (4), 1514-1527 (1994).</li>
<li>Morton, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+activity+in+motor+neurons+that+produce+radula+movements+distinguishes+ingestion+from+rejection+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia.</a> J. Comp. Physiol. A. 173 (5), 519-536 (1993).</li>
<li>Iles, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+synaptic+activation+of+the+fast+coxal+depressor+motoneurone+of+the+cockroach.+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and synaptic activation of the fast coxal depressor motoneurone of the cockroach. Periplaneta americana.</a> J. Exp. Biol. 56 (3), 647-656 (1972).</li>
<li>Westerfield, M., McMurray, J. V., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+motoneurons+and+their+innervation+of+axial+muscles+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish.</a> J. Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).</li>
<li>Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+buccal+motor+programs+elicited+by+a+cholinergic+agonist+applied+to+the+cerebral+ganglion+of+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica.</a> J. Comp. Physiol. A. 179 (4), 509-524 (1996).</li>
<li>Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+patterns+of+the+B31%2FB32+pattern+initiators+innervating+the+I2+muscle+of+the+buccal+mass+during+normal+feeding+movements+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica.</a> J. Neurophys. 75 (4), 1309-1326 (1996).</li>
<li>Morton, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+buccal+nerve+activity+that+distinguishes+ingestion+from+rejection+can+be+used+to+predict+behavioral+transitions+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia.</a> J. Comp. Physiol. A. 172 (1), 17-32 (1993).</li>
<li>Warman, E. N., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+chronic+single-unit+extracellular+recording+in+freely+behaving+animals+using+pipette+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new technique for chronic single-unit extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes.</a> J. Neurosci. Methods. 57 (2), 161-169 (1995).</li>
<li>Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contingent-dependent+enhancement+of+rhythmic+motor+patterns%3A+an+in+vitro+analog+of+operant+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning.</a> J. Neurosci. 17 (21), 8093-8105 (1997).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Behavioral+biology+of+Aplysia%22">Behavioral biology of Aplysia</a>. , Freeman. San Francisco. (1979).</li>
<li>Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+organization+of+the+buccal+system+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica.</a> J. Comp. Neurol. 312 (2), 207-222 (1991).</li>
<li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outputs+of+radula+mechanoafferent+neurons+in+Aplysia+are+modulated+by+motor+neurons%2C+interneurons%2C+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Outputs of radula mechanoafferent neurons in Aplysia are modulated by motor neurons, interneurons, and sensory neurons.</a> J. Neurophysiol. 83 (3), 1621-1636 (2000).</li>
<li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83 (3), 1605-1620 (2000).</li>
<li>Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+an+identified+histaminergic+neuron%2C+and+its+possible+role+in+arousal+of+feeding+behavior+in+semi-intact+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia.</a> J. Neurosci. 6 (8), 2403-2415 (1986).</li>
<li>Rosen, S. C., Teyke, T., Miller, M. W., Weiss, K. R., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+cerebral-to-buccal+interneurons+implicated+in+the+control+of+motor+programs+associated+with+feeding+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of cerebral-to-buccal interneurons implicated in the control of motor programs associated with feeding in Aplysia.</a> J. Neurosci. 11 (11), 3630-3655 (1991).</li>
<li>Jing, J., Weiss, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+variants+of+a+motor+act+in+a+modular+and+hierarchical+motor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network.</a> Curr. Biol. 15 (19), 1712-1721 (2005).</li>
<li>Azizi, F., Lu, H., Chiel, H. J., Mastrangelo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+neurostimulation+using+pulse+code+modulation+%28PCM%29+microfluidic+chips%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical neurostimulation using pulse code modulation (PCM) microfluidic chips.</a> J. Neurosci. Methods. 192 (2), 193-198 (2010).</li>
<li>Zhurov, Y., Proekt, A., Weiss, K. R., Brezina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+internal+state+are+expressed+in+coherent+shifts+of+neuromuscular+activity+in+Aplysia+feeding+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Changes of internal state are expressed in coherent shifts of neuromuscular activity in Aplysia feeding behavior.</a> J. Neurosci. 25 (5), 1268-1280 (2005).</li>
<li>Baker, B. J., Kosmidis, E. K., Vucinic, D., Falk, C. X., Cohen, L. B., Djurisic, M., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+activity+with+voltage-+and+calcium-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 25 (2), 245-282 (2005).</li>
<li>Fejtl, M., Stett, A., Nisch, W., Boven, K. -H., Möller, A. On Micro-Electrode Array Revival. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFejtl%2C+M+%22Advances+in+Network+Electrophysiology+Using+Multi-Electrode+Arrays%22">Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays</a>. Baudry, M., Taketani, M. , Springer Press. New York. 24-37 (2006).</li>
</ol>

Não temos nada a revelar.

Em animais com grandes neurónios identificados, tais como moluscos (por exemplo, Lymnaea, Helix e Aplysia), análise de piscinas do motor é geralmente feita usando gravação intracelular 1,2,3,4. Neste protocolo, descrevemos um processo para identificar individualmente os neurônios motores de um pool do motor utilizando uma técnica extracelular. Usamos as medidas de força como uma ilustração desse processo. Pode-se também usar EMG para medir inervações musculares. Resumidamente, para fazer iss...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S671 </td><td> Biológica, Certified </td></tr><tr><td> Cloreto de potássio </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217 </td><td> Certificado ACS </td></tr><tr><td> Hexa-hidrato de cloreto de magnésio </td><td> Acros Organics </td><td> 19753 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Hepta-hidrato de sulfato de magnésio </td><td> Fisher Scientific </td><td> M63 </td><td> Certificado ACS </td></tr><tr><td> Di-hidrato de cloreto de cálcio </td><td> Fisher Scientifc </td><td> C79 </td><td> Certificado ACS </td></tr><tr><td> Glucose (dextrose) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528 </td><td> BioXtra </td></tr><tr><td> MOPS Buffer </td><td> Acros Organics </td><td> 17263 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Carbacol </td><td> Acros Organics </td><td> 10824 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> De hidróxido de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> SS255 </td><td> Certificado </td></tr><tr><td> Ácido clorídrico </td><td> Fisher Scientific </td><td> SA49 </td><td> Certificado </td></tr><tr><td> Único de cano de vidro capilar </td><td> Sistemas AM </td><td> 6150 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming-Brown micropipeta extrator modelo P-80/PC </td><td> Sutter Instruments </td><td></td><td> Incandescência utilizada: FT345B </td></tr><tr><td> Fio de aço inoxidável revestido com esmalte </td><td> Califórnia fio fino </td><td></td><td> 0.001D, revestimento h </td></tr><tr><td> Casa de silicone II Glue </td><td> GE </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Duro Quick-Gel supercola </td&gt; <td> Henkel Corp. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AM Sistemas amplificador modelo 1700 </td><td> Sistemas AM </td><td></td><td> Configurações de filtro: 10-500 Hz para o nervo I2 / muscular; 300-500 Hz para todos os outros nervos </td></tr><tr><td> Pulsemaster Multi-Canal Estimulador </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> A300 </td><td></td></tr><tr><td> Isolador de estímulo </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> A360 </td><td></td></tr><tr><td> AxoGraph X </td><td> AxoGraph Científico </td><td></td><td> Software para gravações </td></tr><tr><td> Ouro pinos </td><td> Bulgin </td><td> SA3148 / 1 </td><td></td></tr><tr><td> Conector Ouro Sockets </td><td> Bulgin </td><td> SA3149 / 1 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard Elastômero de Silicone 184 </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100 x 15 mm Prato cristalizadas </td><td> Pyrex </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Graxa de alto vácuo </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dicas de pipeta </td><td> Fisher Scientific </td><td> 21-375D </td><td></td></tr><tr><td> Pinos Minutien </td><td> Belas Science Tools </td><td> 26002-10 </td><td></td></tr><tr><td> Massa de modelar </td><td> Sargent Arte </td><td> 22-4400 </td><td></td></tr><tr><td> Sussurre bomba de ar </td><td> Tetra </td><td> 77849 </td><td></td></tr><tr><td> Tubulação de aquário </td><td> Eheim </td><td> 7783 </td><td> 12/16 mm </td></tr><tr><td> Elite airstone </td><td> Hagen </td><td> A962 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas Primavera Tesoura </td><td> Belas Science Tools </td><td> 15000-08 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont n º 5 pinça fina </td><td> Scienc finaFerramentas E </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly-Clark </td><td> 34155 </td><td></td></tr></tbody></table>

extracelularmente identificar os neurônios motores de um pool do motor muscular em<em&gt; aplysia californica</em

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Em animais com grandes neurónios identificados (por exemplo, os moluscos), análise de pools de motor é feita utilizando técnicas intracelulares 1,2,3,4. Recentemente, desenvolveu uma técnica para extracelularmente estimular e registrar os neurônios individuais em Aplysia californica 5. Vamos agora descrever um protocolo para usar esta técnica para identificar e caracterizar os neurônios motores dentro de um pool do motor. Esta técnica tem as vantagens extracelular. Em primeiro lugar, os eléctrodos extracelulares pode estimular e registrar os neurónios através da bainha 5, de modo que não necessita de ser removido. Assim, os neurônios será mais saudável em experimentos extracelulares que nas intracelulares. Em segundo lugar, se os gânglios são girados por fixação adequada da bainha, eléctrodos extracelulares pode acessar neurónios em ambos os lados do gânglio, o que torna mais fácil e mais eficiente para identificar neurónios múltiplos na mesma preparação. Em terceiro lugar, extracelularlar eléctrodos não precisam de penetrar nas células e, portanto, pode ser facilmente deslocado para trás e para a frente entre os neurónios, causando menor dano a eles. Isto é especialmente útil quando se tenta gravar neurônios múltiplos durante repetindo padrões motores que só podem persistir por minutos. Em quarto lugar, os eléctrodos extracelulares são mais flexíveis do que os intracelulares durante os movimentos musculares. Eletrodos intracelulares pode tirar e danificar neurônios durante as contrações musculares. Em contraste, uma vez que os eléctrodos extracelulares são suavemente pressionada contra a bainha acima neurónios, que normalmente ficam acima do mesmo neurónio durante as contracções musculares, e assim pode ser usado em preparações mais intactos. Para identificar os neurônios motores de um pool do motor (em particular, o músculo I1/I3 em Aplysia) através de eletrodos extracelulares, pode-se usar recursos que não requerem medições intracelulares como critérios: soma de tamanho e localização, projeção axonal, e inervação muscular 4, 6,7. Para o conjunto de motor em particular utilizados para ilustrar a técnica, a partir dos nervos bucais gravado 2 e 3 para medir projecções axonais e mediram as forças de contracção do músculo I1/I3 para determinar o padrão de inervação do músculo para os neurónios motores individuais. Demonstramos o processo completo de primeiro identificação de neurónios motores que utilizam a inervação do músculo, em seguida, caracterizando a sua temporização durante padrões motores, a criação de um método simplificado de diagnóstico para a identificação rápida. O método simplificado e mais rápido para o diagnóstico é superior para as preparações mais intactas, por exemplo, na preparação de massa suspensa bucal 8 ou 9, in vivo. Este processo também pode ser aplicado em conjuntos de motor que, em Aplysia 10,11,12 ou em outros sistemas animais 2,3,13,14.

As Figuras 4 e 5 mostram os resultados típicos usados ​​para identificar duas I1/I3 neurónios motores. Figura 4 mostra os registos soma de um grande motor neuron, B3, durante egestive padrões semelhantes e ingestivo-like (Figuras 4C, 4D). A um-para-um picos correspondentes do canal soma e do canal BN2 ipsilateral (Figura 4E), mostram que a especificidade do B3 gravação soma foi mantida durante padrões. B3 dispara durante a fase de retra...

Em animais com grandes neurônios identificados (<em&gt; Por exemplo</em&gt; Moluscos), análise de piscinas do motor é feita usando técnicas intracelulares<sup&gt; 1,2,3,4</sup&gt;. Recentemente, desenvolveu uma técnica para extracelularmente estimular e registrar neurônios individuais em<em&gt; Aplysia californica</em<sup&gt; 5</sup&gt;. Vamos agora descrever um protocolo para usar esta técnica para identificar e caracterizar os neurônios motores dentro de um pool do motor.

Extracelularmente Identificar os neurônios motores de um pool do motor muscular em<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar extracelularmente neurônios motores individuais de um grupo motor e, em seguida, monitorá-los e controlá-los durante padrões motores. Isso é realizado primeiramente posicionando a massa bucal preparada de plegia, com eletrodos em gancho ligados aos nervos principais, em uma câmara de registro especializada, e depois preparando os gânglios bucais e o gânglio cerebral para estimulação e registros extracelulares. O segundo passo consiste em conectar eletrodos de sucção aos nervos e músculos principais da massa bucal, acoplar transdutores de força ao músculo-alvo e posicionar eletrodos extracelulares de vidro sobre a bainha dos gânglios bucais.Em seguida, localize os neurônios motores-alvo com os eletrodos de vidro extracelulares. O passo final consiste em estimular e registrar extracelularmente os neurônios motores-alvo enquanto as forças de contração muscular são medidas simultaneamente. Em última análise, a técnica de estimulação e registro extracelular é utilizada para demonstrar a identificação de neurônios motores individuais e sua atividade neural durante diferentes padrões motores semelhantes à alimentação.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a identificação intracelular de neurônios, é que os eletrodos de vidro extracelulares podem identificar e monitorar múltiplos neurônios motores na mesma preparação durante movimentos musculares. Para ajudar a demonstrar o procedimento, estará presente Jeff McManus, outro estudante de pós-graduação do meu laboratório. Neste procedimento, para preparar os eletrodos de sucção, primeiro corte um pedaço de tubo de polietileno com cerca de 10 centímetros de comprimento. Segure o tubo em ambas as extremidades e coloque-o bem próximo à chama produzida pelo bico de Bunsen, girando-o até que fique macio.Em seguida, estique cuidadosamente o tubo enquanto o afasta da chama. A parte central do tubo ficará alongada e estreitada conforme for puxada; depois disso, corte o tubo ao meio para formar dois eletrodos em seção. Esses eletrodos de sucção são geralmente aplicados nas extremidades cortadas de nervos ou músculos, embora às vezes possam ser aplicados de forma passageira.Após fixar os eletrodos em gancho sob o microscópio, corte o nervo bucal um e o nervo esofágico bilateralmente no ponto de inserção na massa bucal. Em seguida, puxe o gânglio cerebral para frente, a fim de movê-lo para fora do caminho do músculo I dois. Depois, faça uma incisão no músculo I dois sobre o saco ular.Estenda o corte lateral e anteriormente e puxe para frente a aba do músculo I dois para expor o nervo ular. Corte os dois ramos RN e certifique-se de que os ramos sejam longos o suficiente para a fixação do eletrodo de sucção. Continue o corte no I dois em um amplo círculo ao redor dos gânglios bucais.Tendo cuidado para não cortar os nervos bucais dois ou os nervos bucais três até que os gânglios bucais e a parte anexada do músculo I dois possam ser totalmente separados da massa bucal. Depois disso, corte os nervos bucais três bilaterais no ponto de inserção na massa bucal além do local de fixação do eletrodo em gancho. Em seguida, aplique uma fina camada de graxa de vácuo ao entalhe no recipiente de registro que conecta a câmara traseira e a plataforma intermediária.Posteriormente, aplique uma camada fina de cola rápida de gel na parte inferior de vidro da câmara frontal onde será colocado o massa bucal. Transfira cuidadosamente o gânglio cerebral, os gânglios bucais e o massa bucal para a câmara de gravação. Certifique-se de que nenhum dos eletrodos em gancho esteja tracionado fortemente, o que poderia danificar os nervos.Em seguida, coloque cuidadosamente a massa bucal sobre a cola na câmara frontal do prato de gravação. Certifique-se de que sua superfície ventral esteja colada ao fundo do prato e mantenha os gânglios e os eletrodos afastados da cola. Posteriormente, adicione solução salina plegia ao prato para induzir a cura da cola.Em seguida, sob o microscópio, segure a bainha do gânglio cerebral com uma pinça e puxe-a para a câmara posterior, garantindo que os CBCs passem pela reentrância. Depois, prenda os nervos do gânglio cerebral que não sejam os CBCs, a fim de evitar danos aos CBCs intactos.Adicione mais graxa de vácuo sobre os CBCs de modo que o topo da graxa de vácuo fique ligeiramente acima da parede de proteção e não ocorra vazamento entre as câmaras. Em seguida, adicione mais solução salina plegia a ambas as câmaras do recipiente para que os gânglios fiquem completamente submersos. Para estabilizar os gânglios bucais, fixe primeiro as extremidades dos três BN na base de charuto da plataforma central.Como os nervos bucais (BN) serão registrados usando eletrodos em gancho, os alfinetes devem ser colocados mais distalmente do que os pontos de fixação dos eletrodos em gancho; em seguida, prenda as extremidades dos nervos BN e as extremidades. Depois, use dois alfinetes, previamente dobrados em ângulo reto para formar ganchos, para esticar e fixar os CBCs, de modo que os CBCs não sejam danificados. Em seguida, prenda os ramos do nervo radular (RN) entre a câmara traseira e os gânglios bucais.O músculo I dois ficará então sobre os gânglios bucais; para expor o nervo I dois, use uma pinça para segurar o músculo I dois e puxá-lo sobre os gânglios bucais, fixando dois cantos do músculo I dois para evitar danificar o nervo I dois. Em seguida, seccione o nervo I dois distal ao ponto onde seus dois ramos inervam o músculo I dois, remova o restante do músculo I dois e vire o nervo I dois de volta, fixando-o entre os dois ramos do RN. A seguir, ajuste a posição dos alfinetes para esticar e aumentar a tensão, caso um nervo esteja muito frouxo, ou para aliviar a tensão, caso um nervo esteja muito tenso.Para estabilizar ainda mais os gânglios bucais, adicione mais pinos na bainha entre os nervos. Como os gânglios bucais são posicionados com o lado côncavo voltado para cima, gire os gânglios bucais. Se os neurônios de interesse estiverem no lado rostral.Para girar um dos dois gânglios bucais, use pinças finas para segurar um excesso da bainha do CBC próximo aos gânglios bucais. Em seguida, fixe o excesso da bainha do CBC entre o CBC e o BM três e adicione um pino adicional na bainha do gânglio bucal no lado próximo à câmara frontal para minimizar o movimento do gânglio bucal. Para cortar a bainha que recobre os gânglios bucais.Use pinças finas para segurar a bainha no lado próximo à câmara posterior. Em seguida, corte a bainha excedente com tesoura fina sem expor os corpos celulares. Para minimizar danos, remova apenas a quantidade mínima necessária da bainha para visualizar os corpos celulares.Após a remoção da bainha dos gânglios bucais, puxe o nervo iTune e os RNs sobre os gânglios bucais e fixe-os entre os gânglios bucais e a câmara frontal. Para rotacionar ainda mais os gânglios bucais e preencher o eletrodo com salina aple, conecte a extremidade livre de um tubo de polietileno com 15 a 20 centímetros de comprimento na seringa à extremidade do eletrodo de vidro. Em seguida, puxe o êmbolo da seringa para trás para preencher o eletrodo com salina aplegia.Coloque o eletrodo de vidro extracelular preenchido no entalhe do suporte no manipulador. Em seguida, utilize o manipulador para posicionar a ponta do eletrodo na solução salina de plegia que contém os gânglios bucais. Depois disso, insira um fio de prata revestido com cloreto de prata no interior do eletrodo para servir como fio de gravação e conecte-o a um cabo BNC que se liga ao amplificador.Em seguida, conecte outro fio ao cabo BNC para servir como fio de referência, com a outra extremidade do fio colocada na solução salina de plegia. Nesta etapa, corte a extremidade estreita da ponta do eletrodo de sucção para que seu diâmetro corresponda ao do nervo. O diâmetro interno da ponta do eletrodo deve ser semelhante ou ligeiramente menor que o diâmetro do nervo, para garantir uma sucção firme.Como o nervo iTune e o RN estão muito próximos um do outro, posicione seus eletrodos no mesmo manipulador para economizar espaço. Gire os dois eletrodos e certifique-se de que suas pontas estejam próximas uma da outra. Em seguida, escolha um deles para a gravação do nervo iTune e o outro para a gravação do RN.Coloque a ponta do eletrodo na solução salina plegia. Conecte a extremidade livre do tubo de polietileno na seringa ao eletrodo de sucção. Em seguida, use a seringa para encher o eletrodo com solução salina aple.Posteriormente, mova a ponta do eletrodo próximo à extremidade do nervo I dois e use a seringa para sugar o nervo para dentro do eletrodo. O comprimento do nervo dentro do eletrodo deve ser de aproximadamente 0,5 a um milímetro. Para garantir um selamento firme, repita a sucção no eletrodo que será conectado ao rn para fixar os transdutores de força ao músculo.Dobre a agulha curva de cada fio cirúrgico e amarre o fio ao transdutor de força. Com pinça, segure e levante cuidadosamente uma pequena quantidade de músculo e insira a agulha na parte posterior do músculo I um I três até o ponto onde a agulha está dobrada. Em seguida, fixe outro transdutor de força à parte anterior do músculo, nas mandíbulas.Em seguida, levante os transdutores de força até que os pontos fiquem esticados, mas não estique em excesso para verificar isso. Observe a medição no transdutor de força quando o ponto ainda apresenta certa folga. Depois disso, levante o transdutor até que a medição fique ligeiramente acima desse nível de referência.Para localizar um neurônio candidato, utilize o manipulador para pressionar suavemente a ponta do eletrodo extracelular de vidro contra a bainha sobre o centro do corpo celular do neurônio, que é a melhor localização para estimulação e registro da seletividade celular. Esta figura mostra a estimulação extracelular de B três e o registro do corpo celular de B três, bem como dos nervos e regiões musculares correspondentes, de cima para baixo. Os canais são os registros do corpo celular de B três, do BN dois contralateral, do BN dois ipsilateral, do BN três ipsilateral, da força de contração da região anterior do músculo I um I três e da força de contração da região posterior do músculo I um I três.A caixa azul destaca a duração das forças nas regiões anterior e posterior do músculo I um I três. B três projeta apenas no BN dois ipsilateral. Abaixo, estão as gravações extracelulares do soma de B três e dos nervos em um padrão motor semelhante ao EST, bem como em um padrão motor semelhante ao ingestivo. As caixas azuis indicam as fases de protrusão e retrusão dos padrões.As barras vermelhas no canal SOMA B três destacam os potenciais de ação registrados do soma do B três, enquanto as barras vermelhas no canal IB dois indicam o momento correspondente em que o B três está disparando no BN dois ipsilateral. Durante os padrões motores de alimentação. Observe que a unidade do BN dois do B três é a maior entre todas as unidades.Assim, também podemos detectar as duas unidades do BN dois do B três diretamente a partir das gravações do BN dois, sem gravações do soma. Esta figura mostra a estimulação extracelular do B 43 e a gravação a partir do seu soma, bem como das nervos e regiões musculares correspondentes, de cima para baixo. Os canais são gravações do soma do B 43, do BN dois contralateral, do BN dois ipsilateral, do BN três ipsilateral, da força de contração da região anterior do músculo I um I três e da força de contração da região posterior do músculo I um I três.A caixa azul destaca as medições de força do músculo I um I três durante a atividade B 43. A atividade B 43 projeta-se apenas no BN dois ipsilateral. Abaixo estão as gravações extracelulares do soma de B 43 e dos nervos em um padrão motor semelhante ao ingestivo, bem como um padrão motor semelhante ao ingestivo.As caixas azuis indicam as fases de protrusão e retração dos padrões. As barras vermelhas no canal SOMA B 43 destacam os potenciais de ação registrados do soma B 43, enquanto as barras vermelhas no canal IBN dois indicam o momento correspondente em que B 43 dispara no BN dois ipsilateral. Nestes padrões, observe que as unidades BN dois de B 43 são pequenas e muito difíceis de detectar sem gravações somadas, mas disparam consistentemente ao final do programa motor BN dois, o que fornece outra maneira de identificá-las.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como identificar extracelularmente neurônios individuais modernos para múltiplos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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