Usando Quantitative PCR em tempo real para determinar enxerto célula dadora num modelo murino de osso Competitiva Marrow Transplantation
7 de março de 2013
Determinando o enxerto de células do doador representa um desafio em ratinho ósseas modelos de transplante de medula que carecem bem definidos marcadores fenotípicos. Nós descrevemos uma metodologia para quantificar o enxerto de células de doadores do sexo masculino em camundongos fêmeas receptoras de transplante. Este método pode ser utilizado em todas as estirpes de ratinho para o estudo de funções HSC.
O objetivo geral deste procedimento é realizar uma técnica baseada em PCR para quantificar a enxertia de células doadoras em um modelo competitivo de transplante de medula óssea murina, o que é realizado primeiramente efetuando um transplante de medula óssea em camundongos fêmeas receptores utilizando células doadoras de machos. Em seguida, o sangue periférico é coletado dos camundongos receptores em diferentes momentos e o DNA genômico é isolado. As amostras são preparadas para uma curva padrão.
Por fim, a PCR em tempo real é realizada com amostras padrão e amostras de teste. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram o enxerto de células derivadas de doador masculino em camundongos receptores fêmeas, mediante cálculo em relação a uma curva padrão com porcentagem conhecida de DNA masculino versus feminino. A vantagem do método masculino em comparação com métodos existentes, como o baseado em citometria de fluxo, é que ele é mais sensível, mais econômico e as amostras podem ser armazenadas por longo período.
Acima de tudo, nossa técnica é altamente independente de linhagem e pode ser utilizada em qualquer background genômico de camundongos, como um marcador de superfície celular bem definido para diferenciar as células doadoras das células receptoras. Após a eutanásia de camundongos doadores machos FVB/n e fêmeas, sob uma cabine de fluxo laminar, utilize pequenas tesouras e pinças para dissecar os ossos do fêmur e da tíbia e coloque-os em uma placa de cultura tecidual de 60 milímetros contendo seis mililitros de RPMI 1640 gelado com 5% de FBS inativado pelo calor. Utilize uma toalha de papel absorvente (Kim wipe) para remover o músculo e outros tecidos e corte ambas as extremidades de cada diáfise óssea na placa. Em seguida, conecte as extremidades dos ossos a uma agulha de 23 gauge acoplada a uma seringa de 3 mL preenchida com RPMI 1640 contendo 5% de FBS inativado pelo calor e realize a lavagem da medula óssea.
Utilize a mesma agulha para desagregar o tecido da medula óssea por aspirações repetidas. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrifugue por cinco minutos a 400 G. Após a remoção do sobrenadante, re-suspenda as células em um mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos à temperatura ambiente e incube à temperatura ambiente por cinco minutos antes de adicionar cinco a 10 mililitros de RPMI 1640 com 5% de FBS inativado pelo calor. Passe as células através de um filtro celular e colete o fluxo em um novo tubo. Após centrifugar as células por cinco minutos a 400 G e remover o sobrenadante, o pellet deve estar ausente de coloração vermelha, indicando a remoção completa dos glóbulos vermelhos. Re-suspenda em 10 mililitros de RPMI 1640 com 5% de FBS inativado pelo calor, adicione uma pequena alíquota a um hemocitômetro após leve vortex e conte as células.
Calcule o volume de células necessário para misturar com células femininas competidoras numa proporção de cinco para dois para transplante de medula óssea. Como etapa final para preparar as células para injeção, misture os pellets de células doadoras e competidoras, lave com PBS e reconstitua em PBS numa concentração final de cinco vezes 10 à sexta por mililitro de células doadoras e duas vezes 10 à sexta por mililitro de células competidoras, quatro a seis horas antes do transplante de medula óssea. Irradie camundongos receptores fêmeos com radiação gama de césio 137 numa dose única de 11 grays.
Coloque as camundongas irradiadas em um dispositivo de contenção e injete as células doadoras e competidoras misturadas através da veia da cauda, em um volume total de 0,1 mililitro, de modo que cada camundonga receba cinco vezes 10 à quinta potência de células doadoras e duas vezes 10 à quinta potência de células da medula óssea competidoras para coleta de amostras de sangue. Após anestesiar, colete cerca de 50 microlitros de sangue em tubos revestidos com EDTA por meio de sangramento retro-orbital. Colete também amostras de camundongos machos e fêmeas com idade correspondente.
A seguir, isole o DNA genômico de camundongos e camundongos de estudo. Para a curva padrão, adicione cerca de 200 microlitros de tampão de lise de hemácias à temperatura ambiente a cada amostra de sangue e incube por cinco minutos. Adicione um mililitro de PBS e centrifugue para remover a maior parte das hemácias lisadas.
Em seguida, utilize um kit de extração de DNA sanguíneo para isolar o DNA, pré-aquecendo o tampão de eluição a 37 graus Celsius. Para aumentar o rendimento, meça a concentração de DNA de cada amostra. Aquelas com uma razão de OD 260/280 entre 1,8 e 2,0 são utilizadas para análises posteriores.
Para preparar uma curva padrão, dilua o DNA masculino e feminino até uma concentração de quatro nanogramas por microlitro e prepare a mistura de DNA de acordo com estas orientações. Monte a placa de reação de PCR misturando o reagente cyber green super mix com os iniciadores mostrados aqui e com DNA genômico. Cada reação de 20 microlitros contém 400 nanomolares de cada iniciador e cinco microlitros de DNA genômico de células sanguíneas, realizada em triplicata.
Realize a PCR de acordo com as condições descritas no protocolo textual e obtenha os valores de ciclo limite ou CT. Calcule o delta CT multiplicado pela quantidade CT elevado a ZY1 menos CT elevado a BCL2 e os níveis de expressão de ZY1 ou 2 elevado a menos delta CT. Gere curvas padrão plotando a média dos valores de 2 elevado a delta CT em triplicata contra a porcentagem conhecida de DNA masculino na mistura, com ajuste por regressão linear. Abaixo seguem exemplos de curvas padrão plotadas com os valores médios de 2 elevado a delta CT em função das porcentagens de DNA masculino.
Este gráfico inclui uma temperatura específica de fusão para os amplicons BCL2 e ZFY1 localizadas em 78,5 e 88,5 graus Celsius, respectivamente. BCL2 é usado como gene de referência para normalizar a quantidade total de DNA carregado em cada reação de PCR. As curvas de amplificação de BCL2 para cada amostra padrão se fundem umas com as outras, independentemente da concentração de DNA masculino, indicando quantidades iguais de DNA carregado.
No entanto, as curvas de amplificação de ZFY migraram para a esquerda com o aumento das quantidades de DNA masculino na amostra; células-tronco hematopoéticas de camundongos PIM TKO apresentam defeitos na reconstituição de camundongos letalmente irradiados, e, como esperado, camundongos receptores transplantados com células PIM TKO exibiram uma porcentagem muito menor de células masculinas em comparação com camundongos transplantados com células do tipo selvagem. Para validar nosso método, testamos a enxertia de células doadoras masculinas em camundongas transplantadas, que receberam células da medula óssea de camundongos do tipo selvagem versus camundongos PIM triplo knockout ou TKO em diferentes momentos pós-transplante, tanto no sangue periférico após seis semanas quanto em amostras de medula óssea após 16 semanas. Foram analisadas após assistir a este vídeo.
Você deve ter uma boa compreensão de como usar o método baseado em PCR para quantificar o enxerto de células doadoras em um modelo competitivo de transplante de medula óssea em camundongos.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método baseado em PCR para quantificar o enxerto de células doadoras masculinas em camundongos fêmeas após transplante de medula óssea. A técnica é sensível, econômica e aplicável a diversas linhagens de camundongos.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia do Transplante
Antecedentes
- A enxertia de células doadoras é difícil de quantificar em modelos de camundongos.
- Os métodos existentes podem apresentar baixa sensibilidade ou exigir marcadores específicos.
- A PCR em tempo real oferece uma alternativa robusta para quantificação.
- Este método pode ser aplicado a diversas origens genômicas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para quantificar o enxerto de células doadoras.
- Aprimorar a sensibilidade e viabilidade econômica em comparação com a citometria de fluxo.
- Validar o método em diferentes linhagens de camundongos.
Métodos Utilizados
- Transplante de medula óssea em camundongos fêmeas utilizando células doadoras masculinas.
- Coleta de sangue periférico e isolamento de DNA genômico.
- Preparação de curvas-padrão para análise de PCR.
- PCR em tempo real para quantificar células derivadas de doadores masculinos.
Resultados Principais
- O método quantificou com sucesso os níveis de enxerto de células masculinas em receptores femininos.
- Os resultados demonstraram sensibilidade superior em comparação com métodos tradicionais.
- Curvas-padrão foram estabelecidas para correlacionar concentrações de DNA com enxerto.
- A técnica foi validada em diferentes linhagens de camundongos.
Conclusões
- O método baseado em PCR é eficaz para quantificar o enxerto de células doadoras.
- Essa abordagem pode aprimorar estudos sobre as funções de células-tronco hematopoiéticas.
- Ele fornece uma ferramenta versátil para pesquisadores em biologia de transplantes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A PCR quantitativa em tempo real para enxerto de células doadoras em modelos de transplante de medula óssea murina atende à necessidade crítica de uma medição sensível e independente de marcadores da função de células-tronco hematopoiéticas. Esta abordagem permite a validação robusta de alvos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta inicial e na pesquisa pré-clínica, especialmente quando a citometria de fluxo convencional é limitada pela disponibilidade de marcadores específicos de linhagem. O método aumenta a confiança preditiva e apoia decisões de portfólio ajustadas ao risco nos fluxos de pesquisa e desenvolvimento de terapias hematopoiéticas e genéticas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite avaliação quantitativa da enxertia de células-tronco hematopoiéticas em diversos contextos genéticos.
- Apóia a validação funcional de genes ou moléculas candidatas que regulam a biologia das CTH.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao fornecer medida direta da contribuição das células doadoras.
- Aprimora a confiança preditiva para o avanço de alvos nos portfólios de pesquisa hematopoiética.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece um ensaio padronizado e reproduzível para medir o enxerto de células doadoras sem depender de marcadores de superfície celular.
- Permite escalonamento do ensaio e reutilização da plataforma em diversas linhagens de camundongos e modelos genéticos.
- Fornece resultados quantitativos adequados para análise comparativa e triagem de modificações genéticas ou intervenções terapêuticas.
- Reduz a complexidade operacional e o custo em comparação com métodos baseados em citometria de fluxo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para a avaliação da reconstituição hematopoética e da eficácia da terapia gênica.
- Garante continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, permitindo medições consistentes do enxerto.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados quantitativos e reprodutíveis.
- Facilita o desenvolvimento de biomarcadores translacionais para terapias com células hematopoéticas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de quantificação de enxertia baseado em PCR se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico, permitindo testes precoces de hipóteses, validação de compostos promissores e pesquisas translacionais nos fluxos de trabalho de terapia hematopoiética e genética.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao quantificar a contribuição de células doadoras em modelos de transplante competitivo.
- Triagem: Oferece prontidão do ensaio e reprodutibilidade para avaliação de intervenções genéticas ou farmacológicas.
- Análises: Fornece medições quantitativas e resultados baseados em curvas-padrão para comparação estatística robusta.
- Pesquisa Translacional: Permite continuidade pré-clínica e alinhamento de biomarcadores em estudos de reconstituição hematopoética.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma capacidade amplamente aplicável e independente de marcadores para diversos modelos murinos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos da função de CSH.
- Valor Operacional: Padroniza a mensuração do enxerto, melhora a reprodutibilidade e reduz os custos com equipamentos.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de prosseguir ou interromper projetos e a eficiência do capital ao fornecer dados robustos e quantitativos.
- Impacto sobre o Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de programas de terapia hematopoiética e gênica.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em PCR quantitativa e extração de DNA genômico.
- Necessita de acesso a equipamentos de PCR em tempo real e conjuntos de iniciadores validados.
- Exige padronização entre equipes nos protocolos de preparação de amostras e análise de dados.
- Adaptável a diferentes linhagens de camundongos e fundos genéticos que não possuem marcadores superficiais específicos.
- Depende da geração precisa de curva padrão e controles de normalização.
