Name: Marcação metabólica de RNA recém-transcrita para alta resolução Gene Expression Profiling de síntese de RNA, Processamento e Decay em cultura de células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprenda a marcar metabolicamente RNA recém-transcrito com 4-tiouridina para perfil de expressão gênica de alta resolução. Este método aumenta dez vezes a sensibilidade na detecção de mudanças na expressão gênica em culturas de células eucarióticas.

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Gostaríamos de agradecer a Amie Regan para a leitura cuidadosa do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por NGFN Além disso concessão # 01GS0801, MRC bolsista G1002523 e NHSBT concessão WP11-05 para LD e DFG concessão FR2938/1-1 para CCF

1. Marcação metabólica com 4-tiouridina Faça um plano detalhado da instalação experimental / programação, por exemplo, quando adicionar o 4SU para cultura de células e quando a colheita das amostras. Plano de pelo menos 5 minutos entre cada condição. Apenas o tratamento de células de uma condição de cada vez. Lidar com máx. 3-5 pratos em um determinado momento. Pega células tão rapidamente quanto possível, para minimizar as alterações nos níveis de temperatura e de CO 2. Evite expor as células à luz brilhante após 4SU é adicionado como isso pode resultar em crosslinking de RNA 4SU-rotulados para proteínas celulares. Início da rotulagem <ol><li> Thaw 4 tiouridina (4SU) imediatamente antes da utilização e pipeta quantidade necessária de 4SU para cada condição em um tubo Falcon estéril. </li><li> Tome a quantidade necessária de meio de cultura celular (5 ml por 10 centímetros prato) fora os pratos e adicionar ao tubo Falcon 4SU contendo e misture bem. Remova e descarte o meio restante dos pratos. </li> &lt;li&gt; Aplicar 4SU contendo meio de volta para os pratos. </li></ol> Fim de etiquetagem <ol start="4"><li> Remova o meio de cultura de células a partir de células. Adicionam-se 5 ml de reagente Trizol para cada placa. Para as experiências de complexos, incluindo vários pontos de tempo ou condições, este passo é melhor realizado por duas pessoas, uma remoção do meio, a adição de outro reagente Trizol e colheita do ligado. </li><li> Incubar durante 5 min a temperatura ambiente durante a lise celular completa. </li><li> Usar uma pipeta de 10 ml para enxaguar a placa cuidadosamente com o Trizol adicionado. Isto ajuda a lise celular completa e a recuperação da amostra. Manusear com cuidado como Trizol é extremamente perigoso quando entrar em contato com a pele ou com os olhos! Tem antídoto para queimaduras de fenol na mão (por exemplo, polietileno glicol 300 ou 400 em álcool etílico industrial (70:30)). Transferir as amostras para tubos de polipropileno. Por favor, note que os tubos Falcon padrão não resistir a essas forças de G). As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C durante pelo menos um mês até RNA total is preparados. </li></ol> 2. Preparação de RNA Utilizando Modificado Trizol Protocolo <ol><li> Adicione 1 ml de clorofórmio (0,2 ml por ml Trizol) e agitar vigorosamente por 15 segundos. Incubar à temperatura ambiente durante 2-3 minutos. </li><li> Centrifugar a 13.000 × g durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Transferir fase superior aquosa (contendo o ARN) para um novo tubo de 15 ml de polipropileno. </li><li> Adicionar ½ volume de reacção de ambos os ARN precipitação tampão e isopropanol (por exemplo, a 3 ml de sobrenadante adicionar 1,5 ml de tampão de precipitação de ARN e 1,5 ml de isopropanol). </li><li> Misturar bem. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Centrifugar a 13.000 × g durante 10 min a 4 ° C. Elimine o sobrenadante. </li><li> Girar brevemente (5.000 × g por 30 segundos) e remova isopropanol residual com uma pipeta de 200 mL. </li><li> Adicionar um volume igual de etanol a 75% e agitar até que o tubo destaca pelete. Evite dividi-lo em pequenos pedaços, pois isso pode fazer a remoção de residual etanol difícil. </li><li> Centrifugar a 13.000 × g durante 10 min a 4 ° C. Elimine o sobrenadante. </li><li> Girar RNA brevemente e remover o etanol restante com uma pipeta de 200 mL. Repita o passo e remover o etanol restante com uma pipeta de 20 mL. Depois destas duas etapas, sem posterior secagem do sedimento deverá ser executado. </li><li> Adicionar 100 mL de H 2 O para 100 ug de RNA rendimento esperado e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo 5-6 vezes para ajudar na dissolução do RNA. </li><li> Dissolver e desnaturar ARN por aquecimento a 65 ° C durante 10 minutos (agitador) e colocar imediatamente em gelo. </li><li> Medir a concentração de RNA a 260 nm usando um espectrofotómetro NanoDrop, seguindo as instruções do fabricante. Este ARN pode ser armazenada a -80 ° C durante pelo menos um mês. </li></ol> 3. A biotinilação específica do tiol de RNA recentemente transcrito <ol><li> Comece com 60-80 ug de RNA celular total. </li><li> Constituem etiquetagem reacção. Pipeta no seguinteordem (RNA por ug): <ol class="lalpha"><li> 1 ul de tampão 10x Biotinilação </li><li> 7 ul do RNA (contendo 1 ug de RNA diluídas sem nuclease H2O) </li><li> 2 ul biotina-HPDP (1 mg / mL de DMF) </li></ol></li></ol> Sempre adicione a biotina-HPDP último e misture imediatamente por pipetagem. No caso da biotina precipita, o conteúdo de DMF pode ser aumentada para uma concentração final de 40%. <ol start="3"><li> Incubar à temperatura ambiente durante 1,5 horas, com rotação. </li><li> Adicionar um volume igual de clorofórmio. Misture vigorosamente. Incubar durante 2 - 3 minutos, até as fases começam a separar-se e as bolhas começam a desaparecer. </li><li> Centrifugar a 20.000 × g durante 5 min a 4 ° C. Transferir cuidadosamente a fase aquosa superior num novo tubo. </li><li> Repita os passos 3.4 e 3.5 uma vez. Você pode querer realizar esta etapa em 2 mL da fase de bloqueio Gel tubos pesados ​​para reduzir a perda de RNA. </li><li> Precipitação do RNA: adicionar 1/10 do volume de NaCl 5 M e um volume igual deisopropanol à fase aquosa. </li><li> Centrifugar a 20.000 × g durante 20 min a 4 ° C. Elimine o sobrenadante. </li><li> Adicionar um volume igual de 75% de etanol, de centrifugação a 20.000 x g durante 10 min a 4 ° C, desprezar o sobrenadante. </li><li> Girar brevemente e remover o etanol residual, com uma pipeta de 200 uL. </li><li> Girar brevemente e remover o etanol residual com pipeta 20 ul. </li><li> Não permitir que o RNA para secar. Re-suspende-lo em 50-100 ul de H2O (~ 1 mL por 1 jig de RNA). Misture bem por pipetagem cima e para baixo 5-6 vezes. </li><li> Verifique a qualidade da RNA por análise eletroforética para excluir a degradação do RNA. </li></ol> 4. Dot Blot Análise de 4SU-incorporação (Opcional) 4SU ​​incorporação pode ser facilmente determinada por meio de análise de ARN biotinilados dot blot. Este é um passo opcional que permite a resolução de problemas ea estimativa das taxas de incorporação 4SU relação a um controle oligo biotinilado DNA. Para este ensaio nós recommend usando iodoacetil-biotina em vez de biotina-HPDP para biotinylation de RNA 4SU-rotulados no passo 3.2. Isso resulta em uma biotinilação irreversível de 4SU-RNA. Assim, os métodos baseados em colunas (por exemplo RNeasy) pode ser usado para a recuperação de quantidades muito pequenas de RNA biotinilado (por exemplo, 5 mg). Enquanto o RNA biotinilado utilizando biotina-HPDP também é adequado para este ensaio, o sinal resultante é mais fraca e a razão sinal-ruído menos favorável (Figura 3). <ol><li> Siga o protocolo para 4SU a rotulagem e isolamento de RNA total de celulares, conforme descrito nas seções 1 e 2. </li><li> Biotinylate 4SU marcado RNA, conforme descrito na seção 3 substituindo biotina-HPDP com iodoacetil-biotina e fazer duas extrações clorofórmio para remover completamente o excesso de resíduos iodoacetil-biotina. </li><li> Recuperar ARN biotinilados por precipitação de isopropanol / etanol, como descrito, ou usando uma abordagem baseada em coluna (por exemplo, RNeasy) no caso de pequenas quantidades de RNA (&lt;10 ug) São utilizados. </li><li> Incubar a membrana Zeta em água livre de nuclease, com balanço, durante 10 min. </li><li> Aqui a membrana para fora da água sem nuclease e remover fluidos excessivos pela colocação da membrana entre duas toalhas de papel limpas e pressionando firmemente. Secagem ao ar da membrana durante 5 min irá resultar em pontos mais agradáveis. </li><li> Para cada amostra, preparar 20 ul de RNA de 200 ng / mL, utilizando tampão de ligação de ponto de gelo mancha fria (NaOH 10 mM, EDTA 1 mM). Aplicar 5 ul desta diluição (isto é, 1 mg de RNA), assim como três diluições de 10 vezes subsequentes (isto é, 100, 10 e 1 ng de ARN, respectivamente) para a membrana Zeta por pipetagem. Pipetagem através de uma prateleira vazia de ponteiras podem ser empregues para proporcionar o espaçamento uniformemente distribuída. Alternativamente, o uso de um aparelho de dot blot de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Aplicar 5 ul do DNA marcado com biotina-oligo em concentrações variando entre 20 ng / mL e 20 pg / mL (isto é, 100-0,1 ng oligo) cont como positivarol à membrana por pipetagem. Use uma amostra 4SU ingênuo biotinilado como controle negativo. </li><li> Ar seco a membrana por 5 min. </li><li> Incubar a membrana durante 30 minutos em 40 ml de tampão de bloqueio com agitação. </li><li> Incubar a membrana com 10 ml de 1:1000 de estreptavidina-peroxidase de rábano silvestre durante 15 min (5 ml de PBS + 5 ml de SDS a 20% + 10 ul de estreptavidina-peroxidase de rábano silvestre) </li><li> Lavar membrana duas vezes em 40 ml de PBS + 10% de SDS (20 ml de PBS + 20 ml de SDS a 20%) durante 5 min. </li><li> Lavar membrana duas vezes em 40 ml de PBS + 1% de SDS (38 ml de PBS + 2 ml SDS a 20%) durante 5 min. </li><li> Lavar membrana duas vezes em 40 ml de PBS + 0,1% de SDS (40 ml de PBS + 200 ul de 20% SDS) durante 5 min. </li><li> Remover o líquido excessivo, colocando membrana entre duas toalhas de papel limpo e pressionando-os firmemente. </li><li> Visualize ligada à membrana HRP utilizando ECL acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Colocar a membrana em folha de plástico / saco, remover as bolhas de ar e incubar durante 2 min no escuro. </li><li> Expor membranafilme por 1-5 min. </li></ol> 5. Separação de RNA etiquetados e não etiquetados Usando revestidas de estreptavidina Magnetic Beads <ol><li> Calor tampão de lavagem (3 ml por amostra) a 65 ° C num banho de água. </li><li> Prepare ditiotreitol fresco 100 mm (TDT) em nuclease livre de H 2 O. Fazê-lo por decantação 15 - 30 mg de pó de DTT em um ambiente limpo 50 ml tubo Falcon colocado na escala ultra-fino. Pesar e adicionar a quantidade necessária de livre de nuclease de H 2 O. </li><li> Calor biotinilado amostras de RNA a 65 ° C durante 10 minutos para desnaturar e colocar imediatamente em gelo. </li><li> Lugar μMacs colunas no suporte magnético. Recomenda-se não processar mais de 12 amostras de cada vez (6-8 amostras são ideais). </li><li> Colunas Miltenyi pré-equilibrar com 1 ml a temperatura ambiente tampão de lavagem. Isso levará cerca de 15 min. </li><li> Enquanto isso, adicionar 100 ul de pérolas de estreptavidina a 50-100 ul de ARN biotinilados. Incubar à temperatura ambiente durante 15 minutos com rotação. </li> &lt;<html> li&gt; Se qualquer uma das colunas não iniciou o escoamento até agora isto pode ser facilitado por pressionando suavemente sobre o topo da coluna com um dedo de luva. Uma vez que o fluxo começou as colunas drenar rapidamente. </li><li> Aplicar o ARN / contas às colunas. Descarte o flow-through, a menos que você deseja recuperar a fração de RNA não marcado (ver secção 7). </li><li> Lavar três vezes com 0,9 ml de 65 ° C, tampão de lavagem (1 ml ponteiras encolher quando pipetagem tampões a 65 ° C). </li><li> Lavar três vezes com 0,9 ml de tampão de lavagem à temperatura ambiente. </li><li> Pipetar 700 ul tampão RLT (RNeasy kit MinElute limpeza, Qiagen) para novos tubos de 2 ml e colocá-los sob as colunas. </li><li> Eluir os transcritos de RNA recentemente no buffer RLT pela adição de 100 ul de 100 mM de DTT para as colunas. </li><li> Realizar uma segunda ronda de eluição de 3 min mais tarde no mesmo tubo, adicionando mais 100 ul de 100 mM de DTT. </li></ol> 6. A recuperação de ARN recentemente transcrito onte ú &quot;&gt; Continuar com o Cleanup MinElute RNeasy (Qiagen) protocolo seguindo as instruções do fabricante. Elute em 25 ul de duas concentrações livre de nuclease H O. Medida RNA usando um espectrofotômetro Nanodrop. Para evitar a necessidade de descongelar e voltar a congelar RNA antes da apresentação para um ensaio de elevado débito, recomendamos preparar ADNc imediatamente após o RNA recentemente transcrito é purificado. Use 2,5 ul de RNA recentemente transcrito em 20 ul da mistura de síntese de cDNA para a síntese de cDNA, seguindo as instruções do fabricante. realizar os controlos de qRT-PCR utilizando um : 10 diluições da mistura de cDNA de RNA Armazenar a -80 ° C.. 7. Recuperação de, consolidado ARN não marcado (Opcional) Caso o RNA não ligado tem de ser recuperado, recolher e combinar o fluxo através de (após a adição da solução de pérolas de estreptavidina-RNA às colunas) e a primeira lavagem para a precipitação subsequente. Normalmente, é suficiente para precipitar apenas 50% do ARN não ligado como this vai conter&gt; 80% do material de partida. <ol><li> Adicionar um volume igual de isopropanol (sem sal deve ser adicionado como o tampão de lavagem já contiver um M de NaCl). </li><li> Centrifugar a 20.000 × g durante 20 min a 4 ° C. Elimine o sobrenadante. </li><li> Adicionar um volume igual de 75% de etanol, de centrifugação a 20.000 x g durante 10 min a 4 ° C, desprezar o sobrenadante. </li><li> Girar brevemente e remover o etanol residual, com uma pipeta de 200 uL. </li><li> Girar brevemente e remover o etanol residual com pipeta 20 ul. </li><li> Não permitir que o RNA para secar. Ressuspender em 100 ul de H2O Misture bem por pipetagem cima e para baixo 5-6 vezes. Incubar a 65 ° C durante 10 min com agitação e transferir directamente em gelo. </li><li> Verifique a qualidade da RNA por análise eletroforética para excluir a degradação do RNA. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Marcação metabólica de RNA recém-transcrita aumenta substancialmente o poder das tecnologias de alto rendimento, como microarrays e RNA-seq, fornecendo modelos mais adequados para lidar com a questão biológica de interesse. O presente protocolo foi extensivamente otimização. Ele permite o enriquecimento&gt; 1.000 vezes maior de RNA recentemente transcrito e proporciona resultados altamente reprodutíveis. O delineamento experimental do experimento 4SU-tagging é de crucial importância como RNA...

Perfil de expressão gênica é uma ferramenta chave usada para estudar os processos celulares e da rede complexa interação associado. Estudos sobre a abundância de ARNm foram tipicamente o método de escolha para obter conhecimentos básicos sobre os mecanismos moleculares subjacentes. O desenvolvimento de microarrays de todo o transcriptoma 1 e, mais recentemente, o sequenciamento de próxima geração de RNA (RNA-seq) 2-4 alimentou esta abordagem. Embora estas tecnologias revolucionaram nossa compreensão da complexidade da expressão gênica celular, eles enfrentam grandes limitações devido às propriedades intrínsecas de sua amostra do modelo, ou seja, de RNA celular total. Primeiro, as variações a curto prazo nos níveis de ARN total não coincidem alterações nas taxas de transcrição, mas é inerentemente dependente do ARN de semi-vida dos respectivos transcritos. Enquanto uma indução quíntupla de uma transcrição de curta duração, por exemplo, que codifica para um factor de transcrição, serão facilmente detectável no ARN totaldentro de uma hora, a mesma indução de uma transcrição de longa duração, por exemplo, codificação de uma enzima metabólica, ficará praticamente invisível. Além disso, mesmo uma paragem completa (&gt; 1000 vezes down-regulation) na taxa de transcrição de um gene da média com um ARN de semi-vida de cinco horas simplesmente demorar cinco horas para os seus níveis de RNA total de apenas diminuirá duplo . Assim, a análise do RNA total de favorece a detecção de sobre-regulação de transcritos de vida curta, muitos dos quais codificam para factores de transcrição e de genes com funções reguladoras 5. Além disso, a cascata está obscurecido cinética verdadeira de regulação e os eventos de sinalização primários não pode ser diferenciado do secundário. Ambos, por sua vez, pode resultar em viés substancial nas análises a jusante da bioinformática. Em segundo lugar, as alterações nos níveis de ARN total não pode ser atribuída a alterações na síntese de RNA ou deterioração. Medidas deste último requer abordagens invasivos de células, por exemplo, bloqueadores transcriptisobre o uso de actinomicina D 6, e monitorização da deterioração contínua estendida ao longo do tempo de RNA. Com um ARNm de semi-vida média das células de mamífero de 5 - 10 horas 5,7, níveis de ARNm da maioria dos genes somente terão diminuído de menos de duas vezes após várias horas de detenção transcripcional. Estas diferenças relativamente pequenas resultar em medições grosseiramente imprecisas de ARNm de semi-vida para a maioria dos genes celulares, devido à natureza exponencial das equações matemáticas subjacentes. Finalmente, enquanto que o RNA-seq de ARN celular total mostrou que aproximadamente metade dos nossos genes estão sujeitos a eventos de splicing alternativos 8, a cinética subjacentes, bem como os mecanismos dinâmicos orientadores de tecidos e específicos de regulação do contexto de processamento de ARN permanecem pouco compreendidos. Além disso, a contribuição de processamento do RNA para a expressão diferencial de genes, em particular para RNAs não-codificantes, permanece a ser determinada. Ao todo, estas limitações representam grandes obstáculos paramodelagem cinética bioinformática dos mecanismos moleculares subjacentes. Recentemente, desenvolveu uma abordagem, o perfil de expressão do gene denominado de alta resolução, para ultrapassar estes problemas 5,7,9. Baseia-se na marcação metabólica de RNA recém transcrito usando 4 tiouridina (4SU-tagging), um derivado uridina que ocorre naturalmente, e oferece acesso directo às transcrições recém-transcritos com o mínimo de interferência no crescimento celular e expressão gênica (ver Figura 1) 5, 10-12. A exposição das células eucarióticas a resultados 4SU na sua absorção rápida, a fosforilação de 4SU-trifosfato, e incorporação de RNA recentemente transcrito. Após isolamento do RNA celular total, a fracção de ARN marcado é 4SU-tiol especificamente biotinilados gerar uma ligação de dissulfureto entre a biotina e os transcritos de RNA recentemente. &quot;Total RNA celular&quot;, então pode ser quantitativamente separados em rotulada (&#39;recentemente transcrito&#39;) e não marcado (&quot;pré-existing &#39;) ARN com elevado grau de pureza usando esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. Finalmente, o ARN marcado é recuperado a partir das pérolas por simples adição de um agente redutor (por exemplo ditiotreitol) a clivagem da ligação dissulfureto e libertação do ARN recém transcritos a partir das pérolas. RNA recém transcrito retrata a atividade transcricional de cada gene, durante o período de exposição 4SU. 4SU-tagging na escala de tempo de minutos, portanto, fornece um retrato instantâneo da expressão gênica eucariótica e um modelo ideal para a jusante análises de bioinformática (por exemplo, análise de promotor). Nos casos em que as condições de estado estacionário pode ser assumidas, os índices de recém-transcrita / total, o recém-transcrito / sem rótulo e sem rótulo / RNA total de proporcionar o acesso não-invasivo para RNA precisos meia-vida 7,13. Além disso, é importante notar que os transcritos de RNA recentemente purificados após tão pouco como 5 minutos de 4SU-marcação (5 min 4SU-RNA) é menor que 15 e 60 min 4SU-RNA.Ao realizar tanto ultra-curtos e progressivamente mais 4SU-tagging em uma única configuração experimental combinado com RNA-seq, a cinética de processamento de RNA são revelados na resolução de nucleotídeos 9. Finalmente, as análises de curso de tempo de RNA recém transcrito e total combinado com modelagem computacional permitem uma análise integrativa da síntese de RNA e decadência 14. Em conclusão, esta abordagem permite a análise direta da dinâmica da síntese de RNA, processamento e degradação em células eucarióticas. É aplicável em todos os principais organismos modelo, incluindo mamíferos, insetos (Drosophila), anfíbios (Xenopus) e levedura 5,15,16. Ele é diretamente compatível com a análise de microarray 5,17, RNA-seq 9,13,14, e é aplicável in vivo 12,15. Aqui, vamos detalhar a metodologia de rotular, isolar e purificar RNA recém transcrito em células de mamíferos cultivadas. Além disso, potenciomêtroproblemas ai e armadilhas são discutidos.

<table><tbody><tr><td>4-tiouridina</td><td>Carbosynth</td><td>T4509</td><td>Prepare o estoque de 50 mM em H2O estéril, armazene a -20 > C em alíquotas de 50-500 &mu; l, descarte o reagente não utilizado, não congele novamente.</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)</td><td><forte>AVISO - CORROSIVO e PERIGOSO PARA A SAÚDE!</forte> Garanta o acesso imediato ao antídoto de fenol (PEG-Metanol); Armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma</td><td>372978</td><td>AVISO - PERIGOSO PARA A SAÚDE</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio, sem nuclease</td><td>Sigma</td><td>C8532</td><td>Prepare a solução-mãe de 1,6 M usando água sem nuclease.</td></tr><tr><td>NaCl livre de nuclease 5M</td><td>Sigma</td><td>71386</td><td>Solução de estoque</td></tr><tr><td>H2O livre de nuclease</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td>Faça alíquotas de 1 ml em tubos sem nuclease.</td></tr><tr>Tampão <td></td><td></td><td>de precipitação de RNA</td><td>1,2 M NaCl, citrato de sódio 0,8 M em água livre de nuclease. Prepare-se com antecedência em condições estritamente livres de nuclease. Armazene em temperatura ambiente em tubos de falcão de 50 ml.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td>Use com água livre de nuclease para preparar etanol a 80%, armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>1 M Tris Cl livre de nuclease, pH 7,5</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td>Solução estoque</td></tr><tr><td>500 mM EDTA livre de nuclease, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>Solução estoque</td></tr><tr><td>10x Tampão de biotinilação (BB)</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA em água livre de nuclease, faça alíquotas de 1 ml.</td></tr><tr><td>Dimetilformamida (DMF)</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link biotina-HPDP</td><td>Pierce</td><td>21341</td><td>Preparar 1 mg/ml de solução-mãe dissolvendo 50 mg de biotina-HPDP em 50 ml de DMF. O aquecimento suave melhora a solubilização. Armazene a 4 &deg; C em alíquotas de 1 ml.</td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Tubos pesados 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0032 005.152</td><td>Opcional para a etapa de extração do clorofórmio.</td></tr><tr><td>Membrana Zeta</td><td>BIORAD</td><td>162-0153</td><td></td></tr><tr><td>10x Tampão</td><td></td><td></td> de ligação de mancha de pontos <td>100 mM NaOH, 10 mM EDTA</td></tr><tr><td>Biotina-oligo</td><td></td><td></td><td>5'-biotina, 25 nucleotídeos, qualquer sequência</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Fisher</td><td>BPE9738</td><td>Para 100 ml de solução estoque a 20%, adicione 20 g de SDS a 80 ml de PBS pH 7-8 e ajuste o volume para 100 ml. Mantenha todas as soluções de SDS de alta porcentagem acima de 20 ° C. Quente as soluções ligeiramente devem precipitar SDS.</td></tr><tr><td>EZ-Link Iodoacetil-LC-Biotina</td><td>Pierce</td><td>21333</td><td>Prepare 1 mg/ml de solução-mãe dissolvendo 50 mg de iodoacetil-biotina em 50 ml de DMF. O aquecimento suave melhora a solubilização. Armazene a 4 &deg; C em alíquotas de 1 ml. Gera biotinilação irreversível e específica para tióis.</td></tr><tr><td>Tampão fosfato solução salina</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> bloqueador <td>de manchas de pontos Misture 20 ml 20% SDS com 20 ml 1 x PBS pH 7-8 e adicione EDTA à concentração final de 1 mM.</td></tr><tr><td>Estreptavidina-rábano peroxidase </td><td>Vector</td><td>Laboratories SA5004</td><td>Armazene a -20 ° C. Misture 10 ml 20% SDS com 10 ml 1 x PBS. Adicione 20 &mu; l Estreptavidin-HRP antes do uso. </td></tr><tr><td>Reagente ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>RNP2109</td><td>Use seguindo as instruções do fabricante.</td></tr><tr><td>Super RX, Filme X-RA, 18x24 cm</td><td>Fujifilm</td><td>47410 19236</td><td></td></tr><tr><td>&mu; Macs Streptavidin Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>Armazene as contas a 4 °C.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> de lavagem <td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1% Tween 20 em H2O. livre de nuclease.</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>43817</td><td>Preparar como 100 mM DTT em H2O livre de nuclease, preparar sempre fresco antes de utilizar.</td></tr><tr><td>Kit RNeasy MinElute</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Armazene colunas a 4 &deg; C, restantes componentes do kit à temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno com tampa de rosca de 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td>Compatível com tubos de polipropileno com tampa de rosca de 2,0 ml de dimetilformamida</td></tr><tr><td></td><td>Sarstedt</td><td>72.694.005</td><td>Compatível com tubos de dimetilformamida</td></tr><tr><td>de 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Compatível com tubos de dimetilformamida</td></tr><tr><td>de 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Compatível com dimetilformamida</td></tr><tr><td colspan="4">Todas as soluções/reagentes devem ser armazenados em temperatura ambiente, a menos que especificado de outra forma.</td></tr><tr><td colspan="4">Equipamento </td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV/VIS</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 1000</td><td>Ou equivalente. Use volume baixo (1-2 &mu; l) para medições de baixas concentrações de RNA para evitar perda excessiva de amostras.</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml</td><td>VWR International</td><td>525-0153</td><td>Ao contrário dos tubos padrão de 15 ml, estes toleram até 15.000 &#215; g</td></tr><tr><td>Centrífuga de alta velocidade</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-25</td><td>Ou equipamento equivalente capaz de atingir 13.000&#215; g</td></tr><tr><td>Rotor de alta velocidade</td><td>Beckman Coulter</td><td>JLA-16250</td><td>Ou equipamento equivalente capaz de atingir 13.000&#215; g</td></tr><tr><td>Adaptadores para tubos de 15 ml</td><td>Laborger&#228; te Beranek</td><td>356964</td><td>Ou equipamento equivalente capaz de atingir 13.000&#215; g</td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>Ou equivalente.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer compacto</td><td>Ou equivalente.</td></tr><tr><td>Suporte magnético</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>Um suporte comporta 8 &mu; Colunas Macs.</td></tr><tr><td>Banho de água</td><td>Grant</td><td>SUB Aqua 5</td><td>Ou equivalente.</td></tr><tr><td>Escala ultrafina</td><td>A& D</td><td>GR-202</td><td>Ou equivalente.</td></tr><tr><td>E-Gel iBase Power System</td><td>Invitrogen</td><td>G6400UK</td><td>Para géis de RNA; ou equivalente.</td></tr><tr><td>Géis pré-fabricados de agarose E-Gel EX 1%</td><td>Invitrogen</td><td>G4020-01</td><td>Para géis de RNA; ou equivalente.</td></tr></tbody></table>

marcação metabólica de rna recém-transcrita para alta resolução gene expression profiling de síntese de rna, processamento e decay em cultura de células

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

O desenvolvimento de microarrays de todo o transcriptoma e sequenciamento de próxima geração que revolucionou a nossa compreensão da complexidade da expressão gênica celular. Juntamente com uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos, medições precisas da cinética subjacentes tornaram-se cada vez mais importante. Aqui, essas metodologias poderosas enfrentam grandes limitações devido às propriedades intrínsecas das amostras de modelos que estudam, ou seja, total de RNA celular. Em muitos casos, mudanças de RNA celular total de ocorrer ou muito devagar ou rápido demais para representar os eventos moleculares subjacentes e sua cinética com resolução suficiente. Além disso, a contribuição de alterações na síntese de ARN, o processamento, e da deterioração não são facilmente diferenciados. Recentemente, desenvolveu perfis de alta resolução expressão gênica para superar essas limitações. A nossa abordagem baseia-se na marcação metabólica de RNA recentemente transcrito com 4-thiourijante (portanto também designado por 4SU-tagging) seguido por purificação rigorosa do ARN recém transcritos usando biotinilação específica do tiol e as esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. A técnica é aplicável a uma ampla gama de organismos, incluindo vertebrados, Drosophila e levedura. Foram aplicados com sucesso 4SU codificação para estudar a cinética em tempo real das actividades de factor de transcrição, proporcionar medições precisas da RNA meia-vida, e obter novos conhecimentos sobre a cinética de processamento do ARN. Finalmente, a modelagem computacional pode ser empregue para gerar uma análise global integrado dos mecanismos moleculares subjacentes.

1. Material de Partida e os rendimentos esperados Após 1 hora (hr) de 4SU-exposição de RNA recentemente transcrito representa cerca de 1-4% do RNA celular total. Esta será mais baixa em células de crescimento a ser preso em que já não conta para sintetizar o RNA para o crescimento celular / replicação. Quando a rotulagem por 1 hr, recomendamos iniciar o ensaio com 60-80 mg de RNA total. Começando com menos de 30 ug de RNA total de resultados em peletes pequenas de RNA que são difíceis de ver, a...

RNA celular total fornece um modelo pobre para estudar mudanças de curto prazo na síntese de RNA e decadência, bem como a cinética de processamento de RNA. Aqui, descrevemos a marcação metabólica de RNA recentemente transcrito com 4-tiouridina seguido por biotinilação específica do tiol e a purificação do ARN recém transcritos que permitam ultrapassar estas limitações.

Marcação metabólica de RNA recém-transcrita para alta resolução Gene Expression Profiling de síntese de RNA, Processamento e Decay em cultura de células

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Este método tem como objetivo medir diretamente e com precisão a cinética do processamento e decaimento da síntese de RNA em culturas de células eucarióticas. As células são expostas à presença de quatro tiouridinas para marcação metabólica do RNA recém-transcrito, em seguida, lisam-se as células marcadas e purifica-se o RNA celular total, realizando-se uma doação específica de biotina tiofílica para biotinilar seletivamente as moléculas de RNA recém-transcrito. A seguir, utilizam-se esferas magnéticas revestidas com estreptavidina para capturar os transcritos recém-transcritos marcados com tiouridina, separando-os do RNA pré-existente, obtendo frações de RNA contendo RNA total, recém-transcrito e não marcado, pré-existente.O RNA pode então ser submetido a análises posteriores, incluindo Q-R-T-P-C-R, microarranjos ou sequenciamento de nova geração. Em comparação com estudos sobre RNA total celular, a análise de RNA recém-transcrito fornece um aumento de aproximadamente dez vezes na sensibilidade para detectar mudanças de curto prazo na expressão gênica. Além disso, facilita medições precisas dos tempos de meia-vida do RNA e, pela primeira vez, revela efetivamente a cinética do processamento do RNA. A marcação metabólica de transcritos recém-sintetizados pode ser aplicada com sucesso para dissecar os mecanismos moleculares regulatórios da expressão gênica.Também pode ser aplicado a outros organismos modelo, como ops, oph e levedura. Comece com um plano detalhado do experimento, reservando pelo menos cinco minutos entre cada condição. Descongele o rótulo de tiouridina momentos antes do uso e distribua a quantidade necessária para cada condição em tubos estéreis tipo falcon.Para cada condição de tratamento, transfira cinco mililitros do meio de cultura celular de cada placa de cultura de 10 centímetros para o tubo contendo as quatro tiopurinas e misture bem. Aspire completamente o meio remanescente das culturas. Em seguida, adicione novamente às células o meio contendo o marcador e incube pelo tempo definido experimentalmente. Após a remoção do meio de cultura celular, adicione cinco mililitros de triol a cada placa.Incube por cinco minutos à temperatura ambiente para completa lise celular. Enxágue cuidadosamente a placa com o triol adicionado e transfira as amostras para tubos de polipropileno, que são capazes de suportar a centrifugação a 13.000 G. As amostras podem então ser armazenadas a menos 20 graus Celsius ou usadas imediatamente para preparar RNA celular total seguindo o protocolo do triol. Inicie com amostras de 60 a 80 microgramas de RNA celular total. Para a reação de marcação, adicione um microlitro de tampão 10x de biotina a um micrograma de RNA diluído em sete microlitros de água livre de nucleases.Em seguida, adicione dois microlitros de biotina HPDP a um miligrama por mililitro, DMF por um micrograma de RNA e misture imediatamente por pipetagem. Se a biotina precipitar, o teor de DMF pode ser aumentado. Incube a reação à temperatura ambiente por 1,5 hora sob rotação na concentração final de 40%.Em seguida, adicione um volume igual de clorofórmio, misture vigorosamente e incube por dois a três minutos até que as fases comecem a se separar e as bolhas comecem a desaparecer. Centrifugue as amostras e, em seguida, transfira cuidadosamente a fase aquosa superior para um novo tubo. Após uma segunda extração com clorofórmio, adicione um décimo do volume de cloreto de sódio cinco molar e um volume igual de isopropanol.Para precipitar o RNA da fase aquosa, pelotize o RNA por centrifugação. Descarte o sobrenadante e lave o pellet uma vez com volume igual de etanol 75% após a centrifugação, descartando o sobrenadante. Gire brevemente e remova o etanol residual com uma pipeta de 200 microlitros.Centrifugue novamente e remova o etanol residual com uma pipeta de 20 microlitros; ressuspenda o RNA em 50 a 100 microlitros de água, misturando bem por pipetagem. Avalie a qualidade do RNA por eletroforese para excluir degradação do RNA.Equilibre três mililitros de tampão de lavagem por amostra a 65 graus Celsius em banho-maria. Também desnature as amostras de RNA biotinilado a 65 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, coloque imediatamente no gelo.Posicione as colunas microm máx na base magnética. Pré-equilibre as colunas Milton e com um mililitro de tampão de lavagem na temperatura ambiente. Enquanto isso, adicione 100 microlitros de microesferas de estreptavidina ao RNA biotinilado e incube por 15 minutos à temperatura ambiente sob rotação.Se alguma das colunas não tiver iniciado o escoamento, pressione suavemente o topo da coluna com um dedo com luva. Uma vez iniciado o fluxo, as colunas escoam facilmente. Aplique as misturas de microesferas de RNA às colunas. Se o RNA não marcado for analisado, colete então o eluato da fração de RNA não marcado, seguido de três lavagens com 0,9 mililitros de tampão de lavagem a 65 graus Celsius, e depois mais três lavagens com 0,9 mililitros de tampão de lavagem à temperatura ambiente.A seguir, pipete 700 microlitros do tampão RLT em novos tubos de dois mililitros e posicione-os sob as colunas. Adicione 100 microlitros de DTT recém-preparado, 100 milimolar, às colunas para eluir o RNA recém-transcrito no tampão RLT. Após três minutos, adicione outros 100 microlitros de DTT 100 milimolar à coluna e colete o EENT no mesmo tubo.Continue com o protocolo de purificação RN easy mini loot conforme descrito nas instruções do fabricante, adicionando 25 microlitros de água livre de nucleases à coluna e colocando as colunas em tubos no centrifugador. Após uma centrifugação de um minuto, remova as colunas dos tubos e determine as concentrações de RNA utilizando um espectrofotômetro nano drop. Esteja ciente de que as medições espectrofotométricas de RNA recém-transcrito não são muito confiáveis e tendem a superestimar o conteúdo real de RNA.Para evitar a necessidade de descongelar e re-congelar o RNA antes de submetê-lo a um ensaio de alto rendimento, recomendamos preparar o CDNA imediatamente após a purificação do RNA recém-transcrito. Utilize 2,5 microlitros do molde de RNA recém-transcrito em uma reação de síntese de CDNA de 20 microlitros, seguindo as instruções do fabricante. Dilua as amostras de CDNA na proporção de um para dez e analise cinco microlitros da diluição de CDNA por Q-R-T-P-C-R.Armazene as amostras de CD NA a menos 80 graus Celsius para determinar a concentração mínima de quatro SU necessária para a recuperação eficiente de RNA recém-transcrito. Purifique o RNA recém-transcrito após marcação com quatro SU em concentrações crescentes de quatro SU e analise por eletroforese. Aqui, a recuperação de RNA recém-transcrito marcado por uma hora em fibroblastos humanos primários aumentou substancialmente de 50 a 200 micromolar de quatro SU, mas depois começou a se estabilizar. Alternativamente, meça a incorporação de quatro SU por análise de dot blot no RNA biotinilado utilizando um conjugado de estreptavidina peroxidase de rábano silvestre.A eficiência de biotinilação do biotin. HPDP é aproximadamente três vezes menor do que a do biotin. Otto acetil. Assim, um em cada três ou quatro resíduos de su em recém-transcritos.O RNA é na verdade biotinilado pelo HPDP biotinilado. As intensidades do sinal também podem ser quantificadas por comparação com o controle biotinilado. A recuperação de oligos de DNA do RNA recém-transcrito é altamente quantitativa.Esses dados derivados do Bioanalyzer da Agilent mostram que o RNA recém-transcrito contém quantidades significativamente maiores de transcritos não emparelhados grandes. Por fim, as taxas de incorporação de quatro su no RNA recém-transcrito podem até ser quantificadas diretamente por análise espectrofotométrica. Isso requer a precipitação do RNA recém-transcrito com glicogênio, isopropanol e etanol.O pico adicional em 330 nanômetros reflete a taxa de incorporação de quatro SU no RNA recém-transcrito. Não se esqueça de que trabalhar com tril pode ser extremamente perigoso. Portanto, um antídoto para ossos de fenol, composto por polietilenoglicol 300 misturado com álcool metílico industrial, na proporção de 70 para 30, deve estar prontamente disponível.Depois de assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como rotular metabolicamente e purificar o RNA recém-transcrito, o que, no total, levará cerca de oito horas para seis a doze amostras.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós descrevemos uma técnica para a análise da síntese de RNA global em hipóxia utilizando imagens. Clique química rotulagem de RNA não tenha sido previamente realizada sob hipóxia e permite a visualização de mudanças globais de RNA no nível da célula única. Esta abordagem complementa as técnicas de RNA médios existentes, permitindo a visualização direta das mudanças célula-célula em síntese de RNA global.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Beacons bimoleculares proporcional (RBMBs) pode ser usado para imagens simples transcrições de RNA projetados em células vivas. Aqui, nós descrevemos a preparação e purificação de RBMBs, entrega de RBMBs em células de formação de microporos e de imagem fluorescente de transcritos de ARN em tempo real.

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

Este manuscrito descreve um método para a rotulagem individual RNA mensageiro (mRNA) transcrições com fluorescente-etiquetadas sondas de DNA, para uso em único-molécula fluorescência em situ (smFISH) as experiências de hibridação em e. coli. smFISH é um método de visualização que permite a deteção simultânea, localização e quantificação de simples moléculas de mRNA em células individuais fixas.

Método para a rotulagem transcritos em células individuais Escherichia coli para único-molécula fluorescência In Situ as experiências de hibridação

Este protocolo descreve a utilização combinatória de ChIP-seq, seq-4sU, RNA total-seq e Ribossoma profiling para linhas de células e as células primárias. Permite rastreamento de alterações em fator de transcrição vinculativas, novo de transcrição, processamento de RNA, volume de negócios e tradução ao longo do tempo e exibindo o curso geral dos acontecimentos nas células ativadas e/ou rápida mudança.

Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

Nós descrevemos uma plataforma de análise de RNA de transferência original chamada SPOt (plataforma simplificada para observar o tRNA). Local simultaneamente mede níveis celulares de todos os tRNAs em amostras biológicas, em apenas três passos e em menos de 24 horas.

Etiquetando metabólica e caracterização das RNAs de transferência usando Macroarrays

Esse método pode ser usado para medir a síntese do RNA. 5-Bromouridine é adicionado às células e incorporado na RNA sintetizado. Síntese de RNA é medido pela extração do RNA imediatamente depois da rotulagem, seguido de 5-Bromouridine-alvo da imunoprecipitação de rotulados RNA e análise por transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase quantitativa.

Investigação da síntese do RNA usando 5-Bromouridine rotulagem e imunoprecipitação

O protocolo descrito aqui baseia-se a quantificação de todo o genoma de mRNA recentemente sintetizadas purificada de células de levedura rotuladas com 4-thiouracil. Este método permite medir a síntese de mRNA desacoplada do decaimento do mRNA e, portanto, fornece uma medição precisa da transcrição do RNA polimerase II.

Saccharomyces cerevisiae Metabólica de rotulagem com 4-thiouracil e a quantificação dos recém sintetizado mRNA como um Proxy para a RNA polimerase II atividade

O uso do uracil swcnts a purificar sensitivamente e especificamente o RNA recentemente transcrito do fermento Saccharomyces cerevisiae.

Rotulagem metabólica extremamente rápida e específica do RNA in vivo com 4-Thiouracil (Ers4tU)

Fornecemos métodos detalhados para marcar metabolicamente e purificar transcritos nascentes para análise do transcriptoma em embriões iniciais de Xenopus usando 5-etinil-uridina (5-EU).

Marcagem Metabólica do Transcriptoma Nascente em Xenopus : Embriogênese Precoce

Este procedimento descreve como estabelecer culturas primárias de células hematopoiéticas da medula óssea de camundongos e é seguido por transfecção usando o Gene Pulser sistema de eletroporação MXCell.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

Aprenda a marcar metabolicamente RNA recém-transcrito com 4-tiouridina para perfil de expressão gênica de alta resolução. Este método aumenta dez vezes a sensibilidade na detecção de mudanças na expressão gênica em culturas de células eucarióticas.

Marcação metabólica de RNA recém-transcrita para alta resolução Gene Expression Profiling de síntese de RNA, Processamento e Decay em cultura de células (Vídeo) | JoVE Journal

Marcação metabólica de RNA recém-transcrita para alta resolução Gene Expression Profiling de síntese de RNA, Processamento e Decay em cultura de células

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