Marcação metabólica de RNA recém-transcrita para alta resolução Gene Expression Profiling de síntese de RNA, Processamento e Decay em cultura de células

Este método visa medir direta e precisamente a cinética do processamento e decaimento da síntese de RNA em cultura de células eucarióticas. As células na presença de quatro tiouridina para marcar metabolicamente o RNA recém-transcrito, depois lyce as células marcadas e purificar o RNA celular total, realizam uma doação de biotina específica para bioaate seletivo, as moléculas de RNA recém-transcritas. Em seguida, use esferas magnéticas revestidas com estreptavidina para capturar as quatro transcrições recém-transcritas rotuladas do RNA preexistente, as frações de RNA contendo total, recém-transcritas e não marcadas. Preexistente.

O RNA pode então ser submetido a análises a jusante, incluindo Q-R-T-P-C-R, microarrays ou sequenciamento de próxima geração Em comparação com estudos sobre análise de RNA de células totais de recém-transcritos, o RNA fornece aproximadamente um aumento de dez vezes na sensibilidade para detectar mudanças de curto prazo na expressão gênica. Em uma ção, facilita medições precisas de meias-vidas de R e, pela primeira vez, revela a cinética do processamento de RND. A marcação metabólica de transcritos recém-sintetizados pode ser aplicada com sucesso à dissecação de mecanismos moleculares reguladores da expressão gênica.

Também pode ser aplicado a outros organismos modelo, como ops, oph e levedura. Comece com um plano detalhado do experimento, permitindo pelo menos cinco minutos entre cada condição. Descongele o rótulo de quatro tiouridina antes de usar e alíquota a quantidade necessária para cada condição em tubos de falcão estéreis.

Para cada condição de tratamento, transfira cinco mililitros do meio de cultura celular de cada placa de cultura de 10 centímetros para o tubo contendo quatro tiopurinas e misture bem aspirar o meio restante das culturas. Em seguida, adicione o rótulo contendo o meio de volta às células e incube pelo tempo definido experimentalmente. Depois de remover o meio de cultura de células, adicione cinco mililitros de triol a cada placa.

Incube por cinco minutos em temperatura ambiente para lise celular completa. Enxágue a placa cuidadosamente com o triol adicionado e transfira as amostras para tubos de polipropileno, que são capazes de suportar a centrifugação a 13.000 G. As amostras podem então ser armazenadas a menos 20 graus Celsius ou imediatamente usadas para preparar o RNA celular total seguindo o protocolo de triol. Comece com amostras de 60 a 80 microgramas de RNA celular total Para a reação de marcação, adicione um microlitro de 10 x tampão de biotina a um micrograma de RNA diluído em sete microlitros de água livre de nuclease.

Em seguida, adicione dois microlitros de biotina HPDP em um miligrama por mililitro, DMF por um micrograma de RNA e misture imediatamente por pipetagem. Se a biotina precipitar, o teor de DMF pode ser aumentado. A concentração final de 40% Incube a reação à temperatura ambiente por 1,5 horas sob rotação.

Em seguida, adicione um volume igual de mistura de clorofórmio vigorosamente e incube por dois a três minutos até que as fases comecem a se separar e as bolhas comecem a desaparecer. Centrifugue as amostras e, em seguida, transfira cuidadosamente a fase aquosa superior para um novo tubo. Após uma segunda extração com clorofórmio, adicione um décimo de volume de cloreto de sódio de cinco molares e um volume igual de isopropanol.

Para precipitar o RNA da fase aquosa, granule o RNA por centrifugação. Descarte o sobrenadante e lave o pellet uma vez com um volume igual de etanol a 75% após a centrifugação, descarte o sobrenadante. Centrifugar brevemente e remover o etanol residual com uma pipeta de 200 microlitros.

Gire novamente e remova o etanol residual com uma pipeta de 20 microlitros ressuspende, o RNA em 50 a 100. Microlitros de água misturando bem por pipetagem. Avalie a qualidade do RNA por eletroforese para excluir a degradação do RNA.

Equilibre três mililitros de tampão de lavagem por amostra a 65 graus Celsius em banho-maria. Desnaturar também as amostras de RNA biotinilado a 65 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, coloque imediatamente no gelo.

Posicione as colunas microm max no suporte magnético. Pré-equilibre as colunas Milton e com um buffer de lavagem à temperatura ambiente de um mililitro. Enquanto isso, adicione 100 microlitros de esferas de estreptavidina ao RNA biotinilado e incube em temperatura ambiente por 15 minutos sob rotação.

Se alguma das colunas não tiver começado a drenar, pressione suavemente o topo da coluna com um dedo enluvado. Uma vez que o fluxo começa, as colunas drenam prontamente, aplique as misturas de grânulos de RNA nas colunas. Se o RNA não marcado for analisado, colete o fluxo da fração de RNA não marcada e, em seguida, lave três vezes com 0,9 mililitros de tampão de lavagem a 65 graus Celsius, seguido três vezes com tampão de lavagem ambiente de 0,9 mililitros.

Em seguida, pipete o tampão RLT de 700 microlitros em novos tubos de dois mililitros e coloque-os embaixo das colunas. Adicione 100 microlitros de DTT 100 milimolar recém-preparada às colunas para eluir o RNA recém-transcrito no tampão RLT. Após três minutos, adicione mais 100 microlitros de 100 milimolares de TDT à coluna e colete o EENT no mesmo tubo.

Continue com o protocolo de limpeza de mini saque fácil RN conforme descrito nas instruções do fabricante, adicione 25 microlitros de água livre de nuclease à coluna e coloque as colunas em tubos em uma centrífuga. Após uma centrifugação de um minuto, remova as colunas dos tubos e determine as concentrações de RNA usando um espectrofotômetro de nano gotas. Esteja ciente de que as medições fotométricas de espectros de RNA recém-transcritos não são muito confiáveis e tendem a superestimar o conteúdo real de RNA.

Para evitar a necessidade de descongelar e recongelar o RNA antes de submetê-lo a um ensaio de alto rendimento, recomendamos preparar o CDNA imediatamente após a purificação do RNA recém-transcrito. Use 2,5 microlitros do molde de RNA recém-transcrito em uma reação de síntese de CDNA de 20 microlitros seguindo as instruções do fabricante. Dilua as amostras de CD NA de um a 10 e analise cinco microlitros de diluição de CD NA por Q-R-T-P-C-R.

Armazene as amostras de CD NA a menos 80 graus Celsius para determinar a concentração mínima de quatro SU necessária para a recuperação eficiente do RNA recém-transcrito, purificar o RNA recém-transcrito após a marcação de quatro SU com concentrações crescentes de quatro SU e analisado por eletroforese. Aqui. A recuperação de RNA recém-transcrito marcado por uma hora em fibroblastos humanos primários aumentou substancialmente de 50 para 200 micromolares quatro su, mas depois começou a se estabilizar. Alternativamente, meça a incorporação de quatro SU por análise de dot blot no RNA biotinilado usando um conjugado de peroxidase de estreptavidina.

A eficiência de biotina da biotina. O HPDP é aproximadamente três vezes menor que o da Otto acetil biotina. Assim, um em cada três quatro resíduos de su é recém-transcrito.

O RNA é realmente biotinilado pela biotina HPDP. As intensidades do sinal também podem ser quantificadas por comparação com o controle biotinilado. A recuperação de oligos de DNA de RNA recém-transcrito é altamente quantitativa.

Esses dados derivados do Agilent Bioanalyzer mostram que o RNA recém-transcrito contém quantidades significativamente maiores de grandes transcritos não transcritos. Finalmente, as taxas de incorporação de quatro su em RNA recém-transcrito podem até ser quantificadas diretamente por análise fotométrica de espectros. Isso requer a precipitação do RNA recém-transcrito com glicogênio, isopropanol e etanol.

O pico adicional em 330 nanômetros reflete a taxa de incorporação de quatro SU em RNA recém-transcrito. Não se esqueça de que trabalhar com tril pode ser extremamente perigoso. Portanto, um antídoto para ossos de fenol consistindo de polietilenoglicol 300 misturado com álcool metilado industrial, 70 a 30 deve estar prontamente disponível.

Então, depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rotular metabólico e purificar o RNA recém-transcrito, o que, no total, levará cerca de oito horas para seis a 12 amostras.