Name: Mitocôndrias associadas Membranas ER (MAMs) e glicoesfingolipídeos microdomínios enriquecidos (GEMS): Isolamento de cérebro de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprenda a isolar MAMs e frações GEMS de cérebro de rato adulto usando dissecação, homogeneização e centrifugação em gradiente de sacarose. Este método reprodutível permite estudar metabolismo celular em neurociência.

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Reconhecemos a contribuição de Renata Sano na concepção do protocolo inicial. Ad&#39;A. detém os joalheiros para Crianças (JFC) cadeira dotada de Genética e Terapia Gênica. Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH GM60905, DK52025 e CA021764, e os americanos libaneses sírios Charities Associados (ALSAC).

<html> O protocolo que se segue destina-se ao isolamento e purificação de MAMs e gemas de cérebro de rato Soluções necessárias para o isolamento de mitocôndrias, MAMs e pedras preciosas O fracionamento de obter preparação mitocondrial crua: Solução A: 0,32 M de sacarose, 1 mM de NaHCO 3, 1 mM de MgCl2, 0,5 mM de CaCl 2 + inibidores de protease (adicionar fresco, conforme necessário) Solução B: 0,32 M de sacarose, 1 mM de NaHCO 3 Inibidores da Protease + (adicionar fresco, conforme necessário) Isolamento MAMs: Meio de isolamento: 250 mM de manitol, 5 mM de HEPES pH 7,4, 0,5 mM de EGTA, 0,1% BSA Gradiente de tampão: 225 mM de manitol, 25 mM HEPES pH 7,5, 1 mM de EGTA, 0,1% BSA (concentração final) Isolamento GEMs: conteúdo &quot;&gt; Tampão de Extracção GEM: 25 mM HEPES pH 7,5, 0,15 M NaCl, 1% Triton X-100 Os inibidores de protease + (adicionar fresco, conforme necessário) Tampão GEM solubilizante: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, EDTA 5 mM, SDS a 1% + inibidores da protease (adicionar fresco, conforme necessário). 1. Fracionamento subcelular Primeiro Passo: Remoção de Núcleos, células não lisadas e restos celulares <ol><li> Euthanize do mouse em câmara de gás 2. </li><li> Remover imediatamente cérebro, reduzir pela metade, coloque em tubos de 2 ml em gelo e pesar. </li></ol> Nota: Mantenha as metades do cérebro separado durante todo o procedimento. O seguinte aplica-se ao tratamento de um meio único cérebro. <ol start="3"><li> Cérebro lugar metade em um 2 ml de pré-refrigerados de vidro moedor de tecido Dounce contendo 1 ml de solução A. frio Misturar com 15 tacadas no total de um pilão grande folga. </li><li> Transferir para um tubo Falcon de 15 ml, em gelo, e diluahomogeneizados até 10 volumes w / v, por exemplo 0,225 g a 2,25 ml. </li><li> Centrifugar a 1.400 xg amostra durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante e transferir para um tubo de centrífuga de 30 ml de fundo redondo de vidro, em gelo. Certifique-se de não perturbar o sedimento. </li><li> Ressuspender o sedimento em 10 volumes dos mesmos de uma solução. Homogeneizar no mesmo moinho, com 3-6 movimentos de um pilão de pequena folga, 1 ml de cada vez. </li><li> Transferir para um tubo de 15 ml fresco falcon e centrifugar a 710 xg durante 10 min a 4 ° C. Isso resulta em um pellet de núcleos e restos celulares. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante e piscina com o sobrenadante guardado no passo 1.6. </li></ol> 2. Segunda Etapa: Isolamento mitocôndrias bruto <ol><li> Centrifugar os sobrenadantes a 13.800 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga Ultra-Clear Beckman, em gelo </li><li> Ressuspender o sedimento em 10 volumes de solução A. Homogeneizar no mesmo moinho, com 3-6 movimentos de um pilão de pequena folga, 1 ml de cada vez. </li><li> Centrifugar o passo 2.1. </li><li> Repita os passos 2,2-2,4. </li><li> O sedimento resultante é uma fracção enriquecida mitocondrial. Piscina os sobrenadantes (citosol e ER), cubra com parafilme e manter em gelo. </li><li> Ressuspender o sedimento com 6 golpes de um pilão de pequena folga, em 4,8 ml / g (g é referida ao peso do cérebro original) de solução B, em um homogeneizador de fresco. </li><li> Utilizando pipetas de Pasteur de vidro, preparar um gradiente de sacarose descontínuo de um tubo de centrífuga Ultra-Clear Beckman, adicionando subsequentemente a parte inferior do tubo, como se segue, com cuidado, assegurando que nenhum bolhas formam-se: Resupended Pellet (0,32 M de sacarose) 3 ml de sacarose mM 850 (em 1 mM de NaHCO3) 3 ml de sacarose 1 M (em 1 mM de NaHCO3) 3 ml de sacarose 1,2 M (em 1 mM NaHCO3) </li><li> Centrifugar a 82.500 xg durante 2 horas a 4 ° C. A separação resultante, no final do gradiente irá produzir três bandas e uma pelota: 1) de mielina e de contaminantes de membrana outros (0,32 M - 0,85 M de interface), 2) ER, Golgi, as membranas plasmáticas (0,85 M - 1 M de interface); 3) sinaptossomas (1 M - 1,2 M de interface), 4) bruto mitocôndrias (pellet), que é utilizada para os passos de purificação subsequentes </li></ol> 3. Isolamento de mitocôndrias associada membrana ER, MAMs <ol><li> Ressuspender o bruto fresco mitocôndrias isoladas a partir de uma metade do cérebro, em 2 ml de meio de isolamento contendo inibidores de protease recentemente adicionados. </li><li> Prepare um gradiente de Percoll 30% com Gradiente ml de buffer de 8 por metade do cérebro, e colocar em um tubo de centrífuga Ultra-Clear Beckman. </li></ol> * Nota: Certifique-tampão gradiente mais concentrado (1,43 vezes) para alcançar a concentração final correta depois diluting Percoll a 30%. <ol start="3"><li> Suspensão mitocondrial camada em cima do gradiente preparado lentamente para evitar bolhas. </li><li> Centrifugar a 95.000 xg durante 30 min, 4 ° C. </li><li><ol class="lroman"><li> Remover a fracção pesada (banda inferior) PRIMEIRO com uma pipeta de Pasteur de vidro e transferir para um tubo de vidro de fundo redondo de fresco, em gelo. </li><li> Remova a fracção leve (banda superior) SEGUNDA com outra pipeta de Pasteur de vidro e transferir para um tubo de vidro separado de fundo redondo, fresco, em gelo. </li></ol></li><li> Diluir ambas as fracções recolhidas no passo 3.5 com 10 ml meio de isolamento e centrifugar a 6300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Descartar o sobrenadante a partir da fracção pesada obtida no passo 3.6, ressuspender o sedimento com um outro meio de isolamento de 10 ml e centrifugar de novo, como no passo 3.6. O sedimento resultante será a fracção pura mitocondrial. </li><li> Transferir o sobrenadante do Frac Luzção obtida no passo 3.6 para um tubo de centrífuga Ultra-Clear Beckman, em gelo. Descartar o sedimento. </li><li> Adicionar meio de isolamento suficientes para o sobrenadante obtido no passo 3.8 para encher o tubo e centrifuga-se a 100.000 xg durante 1 h, 4 ° C. O sedimento resultante será a fracção MAMs. Remova cuidadosamente e elimine o sobrenadante. </li></ol> Nota: Nesta etapa, você também pode centrifugar a 100.000 xg durante 1 hora, 4 ° C, o sobrenadante salvo no passo 2.6. O sedimento será a fracção sobrenadante ER e a fracção citosólica. 4. Extração de glicoesfingolipídeos enriquecidas microdomínios, Gemas <ol><li> Lisar as fracções puras mitocôndrias e / ou MAM em 500 ml-1 ul de tampão de extracção durante 20 minutos em gelo. </li><li> Centrifugar os lisados ​​a 15300 xg durante 2 min a 4 ° C. </li><li> Recolher os sobrenadantes (Triton X-100 o material solúvel) e re-centrifugação de pelotasdurante 2 minutos para remover o restante material solúvel. (Triton X-100 As mitocôndrias extraído e / ou Triton X-100 MAMs extraídos). </li><li> Solubilizar pelotas em solubilizantes Buffer. Este material solubilizado representa as fracções de gema e pode ser usado para análise posterior. </li></ol>

<ol><li>Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organellar+junctions+promote+targeted+Ca2%2B+signaling+in+smooth+muscle%3A+why+two+membranes+are+better+than+one%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one.</a> Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).</li>
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</ol>

Nenhum dos autores tem quaisquer conflitos de interesse a declarar.

Os locais de contacto entre as membranas intracelulares ou entre organelas e da membrana plasmática de células representam dinâmicas plataformas de sinalização para os processos celulares básicos. A caracterização exata de sua função e composição em ambas as condições fisiológicas e patológicas requer protocolos de purificação confiáveis ​​e reprodutíveis. Os métodos descritos aqui foram especificamente optimizados pelo nosso laboratório para o isolamento e purificação dos MAMs e as suas gemas correspondentes a partir d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENTES </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Fracionamento </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Fisher Scientific </td><td> S5-500 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-5761 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio, hexa-hidratada </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> O cloreto de cálcio hidratado, </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C-5080 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> MAM </td></tr><tr><td> D-Manitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9546-250G </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E4378-250G </td><td></td></tr><tr><td> BSA, Fracção V, de choque de calor, liofilizado </td><td> Roche </td><td> 03-116-964-001 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> GEM </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-500 ml </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de Sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Roche </td><td> 03-118-142-001 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144S-500 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dodecil sulfato de sódio (SDS) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP166-500 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Comum </td></tr><tr><td> Inibidores de protease Tablets, completa EDTA-livres </td><td> Roche </td><td> 11-873-580-001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPAMENTOS </td></tr><tr><td> 2 ml Douce todo em vidro Grinders Tecido </td><td> Kimble perseguição </td><td> 885300-0002 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml de polipropileno cónicas Tubos Centrífuga, BD Falcon </td><td> BD </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml de fundo redondo tubos de centrífuga de vidro </td><td> Kimble perseguição </td><td> 45500-30 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml de fundo redondo de vidro CentriTubos Fuge </td><td> Kimble perseguição </td><td> 45500-15 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de ultracentrifugação, ultra-claro, Thinwall, mm 14x89 </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Cole-Parmer </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> Descartável vidro borosilicato Pasteur Pipetas, 9 &quot; </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678 20C- </td><td></td></tr></tbody></table>

mitocôndrias associadas membranas er (mams) e glicoesfingolipídeos microdomínios enriquecidos (gems): isolamento de cérebro de rato

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

Organelas intracelulares são estruturas altamente dinâmicas com diferentes forma e composição, que estão sujeitos a células específicas sinais intrínsecos e extrínsecos. As membranas são freqüentemente justapostas em locais de contato definidas, que se tornam centros de troca de moléculas de sinalização e componentes de membrana 1,2,3,4. As inter-organellar microdomínios de membrana que são formados entre o retículo endoplasmático (ER) e das mitocôndrias durante a abertura do IP3-sensitive Ca 2 + canal são conhecidos como as mitocôndrias associado-ER membranas ou mams 4,5,6. A composição de proteína / lípido e propriedades bioquímicas dos sítios de contacto de membrana têm sido extensivamente estudadas em particular em relação ao seu papel na regulação da Ca 2 + intracelular 4,5,6. O ER serve como o armazenamento primário do Ca 2 + intracelular, e, nessa qualidade regula uma variedade de processos celulares a jusante de sinalização de Ca 2 +, including pós-traducional de dobragem de proteína e proteína maturation7. As mitocôndrias, por outro lado, manter a homeostase de Ca2 +, por tamponação citosólica concentração de Ca2 + que impede a abertura de vias apoptóticas jusante de Ca 2 + 4,8 desequilíbrio. A natureza dinâmica das MAMs torna locais ideais para dissecar mecanismos básicos celulares, incluindo Ca 2 + de sinalização e regulação da mitocondrial Ca 2 + sobrevivência concentração biossíntese de lipídios e transporte, metabolismo energético celular e 4,9,10,11,12. Vários protocolos têm sido descritas para a purificação dessas microdomínios de tecido do fígado e células de cultura 13,14. Tomando métodos anteriormente publicados em consideração, nós adaptamos um protocolo para o isolamento de mitocôndrias e MAMs a partir do cérebro de rato adulto. Para este procedimento, nós adicionamos uma etapa de purificação extra, ou seja, uma extração de Triton X100, que enables o isolamento da fracção microdomínio enriquecido glicosfingolípidos (GEM) dos MAMs. Estas preparações GEM partes componentes de proteínas com várias cavéolas e lipídico jangadas, derivadas a partir da membrana plasmática ou outras membranas intracelulares, e são propostos para funcionar como pontos de recolha para a agregação de proteínas receptoras e de interacções proteína-proteína 4,15.

Com base em nossa experiência com o uso deste protocolo podemos seguramente recomendar para o isolamento e purificação de MAMs, Gemas e frações mitocondriais de cérebro de rato. O processo como descrito é altamente reprodutível e consistente. Na Figura 1 mostra uma imagem representativa da camada de forma pura e mitocôndrias MAMs em um gradiente de Percoll (passo 3.4). Uma banda, definida leitoso contendo purificado mitocôndrias (Mito-P) segrega na parte inferior do tubo de ultracentrífuga, enquanto que...

Este procedimento ilustra como isolar a partir do cérebro do rato adulto membranas mitocôndrias associadas ER ou mams e as fracções enriquecidas glicoesfingolipídeos-microdomínio de MAMs e preparações mitocondriais.

Mitocôndrias associadas Membranas ER (MAMs) e glicoesfingolipídeos microdomínios enriquecidos (GEMS): Isolamento de cérebro de rato

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar a mitocôndria, a membrana do retículo endoplasm�tico, microdomínios ou MAMs (microdomínios associados à mitocôndria) do cérebro de camundongo. Os MAMs purificados são posteriormente extraídos para obter frações de microdomínios enriquecidas em lipídios do tipo glicofíngere, também chamadas de gems. Isso é realizado primeiramente por meio da dissecção do cérebro de camundongo, que é então homogeneizado em um tampão específico utilizando um homogeneizador de Dounce. O homogeneizado resultante é centrifugado em baixa velocidade para remoção de núcleos, células intactas e debris mortos.O segundo passo é preparar uma fração mitocondrial crua. Por meio de uma centrifugação adicional do sobrenadante, o precipitado resultante é ressuspenso e separado adicionalmente utilizando um gradiente de sacarose descontínuo. Em seguida, a fração mitocondrial crua é aplicada a um gradiente Percoll.Após a centrifugação e várias etapas de lavagem, obtém-se a fração mitocondrial pura e as MAMs. O passo final consiste em tratar as MAMs com uma solução contendo TRITON X-100 para extrair a fração de microdomínio enriquecida em lipídio glicofosfatidilinositol (GPI)

mitochondria-associated-er-membranes-mams-glycosphingolipid-enriched

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Aqui, apresentamos um protocolo para a isolação do rato inteiro, intacto, glândulas mamárias para investigar a expressão da matriz extracelular (ECM) e morfologia ductal. Mouse #4 glândulas abdominais foram extraídas dos ratos de 8-10 semanas nulíparas fêmeas, fixados em formalina tamponada neutra, seccionado e manchado usando imuno-histoquímica para proteínas de ECM.

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Apresentamos um protocolo em duas etapas para isolamento de mitocôndrias de alta qualidade que é compatível com a descoberta e quantificação de proteínas em escala de proteoma. Nosso protocolo não requer engenharia genética e, portanto, é adequado para estudar mitocôndrias de quaisquer células e tecidos primários.

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Este protocolo descreve uma técnica para a análise de supercomplexos respiratórios quando apenas pequenas quantidades de amostras estão disponíveis.

Isolamento de mitocôndrias para análise de supercomplexos mitocondriais a partir de pequenas amostras de cultura de tecidos e células 

Um protocolo foi desenvolvido para a preparação de mitocôndrias purificadas a partir de células microgliais, isolamento de proteínas mitocondriais para liberação de N-glicanos e detecção rápida de glicanos mitocondriais subcelulares usando ionização por eletrospray de dessorção a laser assistida por matriz infravermelha acoplada a espectrometria de massa de analisador de massa precisa de alta resolução.

Preparação mitocondrial de microglia para análise de glicanos

Aprenda a isolar MAMs e frações GEMS de cérebro de rato adulto usando dissecação, homogeneização e centrifugação em gradiente de sacarose. Este método reprodutível permite estudar metabolismo celular em neurociência.

Mitocôndrias associadas Membranas ER (MAMs) e glicoesfingolipídeos microdomínios enriquecidos (GEMS): Isolamento de cérebro de rato (Vídeo) | JoVE Journal

Mitocôndrias associadas Membranas ER (MAMs) e glicoesfingolipídeos microdomínios enriquecidos (GEMS): Isolamento de cérebro de rato

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