Name: Mitocôndrias associadas Membranas ER (MAMs) e glicoesfingolipídeos microdomínios enriquecidos (GEMS): Isolamento de cérebro de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprenda a isolar MAMs e frações GEMS de cérebro de rato adulto usando dissecação, homogeneização e centrifugação em gradiente de sacarose. Este método reprodutível permite estudar metabolismo celular em neurociência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Reconhecemos a contribuição de Renata Sano na concepção do protocolo inicial. Ad&#39;A. detém os joalheiros para Crianças (JFC) cadeira dotada de Genética e Terapia Gênica. Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH GM60905, DK52025 e CA021764, e os americanos libaneses sírios Charities Associados (ALSAC).

<html> O protocolo que se segue destina-se ao isolamento e purificação de MAMs e gemas de cérebro de rato Soluções necessárias para o isolamento de mitocôndrias, MAMs e pedras preciosas O fracionamento de obter preparação mitocondrial crua: Solução A: 0,32 M de sacarose, 1 mM de NaHCO 3, 1 mM de MgCl2, 0,5 mM de CaCl 2 + inibidores de protease (adicionar fresco, conforme necessário) Solução B: 0,32 M de sacarose, 1 mM de NaHCO 3 Inibidores da Protease + (adicionar fresco, conforme necessário) Isolamento MAMs: Meio de isolamento: 250 mM de manitol, 5 mM de HEPES pH 7,4, 0,5 mM de EGTA, 0,1% BSA Gradiente de tampão: 225 mM de manitol, 25 mM HEPES pH 7,5, 1 mM de EGTA, 0,1% BSA (concentração final) Isolamento GEMs: conteúdo &quot;&gt; Tampão de Extracção GEM: 25 mM HEPES pH 7,5, 0,15 M NaCl, 1% Triton X-100 Os inibidores de protease + (adicionar fresco, conforme necessário) Tampão GEM solubilizante: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, EDTA 5 mM, SDS a 1% + inibidores da protease (adicionar fresco, conforme necessário). 1. Fracionamento subcelular Primeiro Passo: Remoção de Núcleos, células não lisadas e restos celulares <ol><li> Euthanize do mouse em câmara de gás 2. </li><li> Remover imediatamente cérebro, reduzir pela metade, coloque em tubos de 2 ml em gelo e pesar. </li></ol> Nota: Mantenha as metades do cérebro separado durante todo o procedimento. O seguinte aplica-se ao tratamento de um meio único cérebro. <ol start="3"><li> Cérebro lugar metade em um 2 ml de pré-refrigerados de vidro moedor de tecido Dounce contendo 1 ml de solução A. frio Misturar com 15 tacadas no total de um pilão grande folga. </li><li> Transferir para um tubo Falcon de 15 ml, em gelo, e diluahomogeneizados até 10 volumes w / v, por exemplo 0,225 g a 2,25 ml. </li><li> Centrifugar a 1.400 xg amostra durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante e transferir para um tubo de centrífuga de 30 ml de fundo redondo de vidro, em gelo. Certifique-se de não perturbar o sedimento. </li><li> Ressuspender o sedimento em 10 volumes dos mesmos de uma solução. Homogeneizar no mesmo moinho, com 3-6 movimentos de um pilão de pequena folga, 1 ml de cada vez. </li><li> Transferir para um tubo de 15 ml fresco falcon e centrifugar a 710 xg durante 10 min a 4 ° C. Isso resulta em um pellet de núcleos e restos celulares. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante e piscina com o sobrenadante guardado no passo 1.6. </li></ol> 2. Segunda Etapa: Isolamento mitocôndrias bruto <ol><li> Centrifugar os sobrenadantes a 13.800 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga Ultra-Clear Beckman, em gelo </li><li> Ressuspender o sedimento em 10 volumes de solução A. Homogeneizar no mesmo moinho, com 3-6 movimentos de um pilão de pequena folga, 1 ml de cada vez. </li><li> Centrifugar o passo 2.1. </li><li> Repita os passos 2,2-2,4. </li><li> O sedimento resultante é uma fracção enriquecida mitocondrial. Piscina os sobrenadantes (citosol e ER), cubra com parafilme e manter em gelo. </li><li> Ressuspender o sedimento com 6 golpes de um pilão de pequena folga, em 4,8 ml / g (g é referida ao peso do cérebro original) de solução B, em um homogeneizador de fresco. </li><li> Utilizando pipetas de Pasteur de vidro, preparar um gradiente de sacarose descontínuo de um tubo de centrífuga Ultra-Clear Beckman, adicionando subsequentemente a parte inferior do tubo, como se segue, com cuidado, assegurando que nenhum bolhas formam-se: Resupended Pellet (0,32 M de sacarose) 3 ml de sacarose mM 850 (em 1 mM de NaHCO3) 3 ml de sacarose 1 M (em 1 mM de NaHCO3) 3 ml de sacarose 1,2 M (em 1 mM NaHCO3) </li><li> Centrifugar a 82.500 xg durante 2 horas a 4 ° C. A separação resultante, no final do gradiente irá produzir três bandas e uma pelota: 1) de mielina e de contaminantes de membrana outros (0,32 M - 0,85 M de interface), 2) ER, Golgi, as membranas plasmáticas (0,85 M - 1 M de interface); 3) sinaptossomas (1 M - 1,2 M de interface), 4) bruto mitocôndrias (pellet), que é utilizada para os passos de purificação subsequentes </li></ol> 3. Isolamento de mitocôndrias associada membrana ER, MAMs <ol><li> Ressuspender o bruto fresco mitocôndrias isoladas a partir de uma metade do cérebro, em 2 ml de meio de isolamento contendo inibidores de protease recentemente adicionados. </li><li> Prepare um gradiente de Percoll 30% com Gradiente ml de buffer de 8 por metade do cérebro, e colocar em um tubo de centrífuga Ultra-Clear Beckman. </li></ol> * Nota: Certifique-tampão gradiente mais concentrado (1,43 vezes) para alcançar a concentração final correta depois diluting Percoll a 30%. <ol start="3"><li> Suspensão mitocondrial camada em cima do gradiente preparado lentamente para evitar bolhas. </li><li> Centrifugar a 95.000 xg durante 30 min, 4 ° C. </li><li><ol class="lroman"><li> Remover a fracção pesada (banda inferior) PRIMEIRO com uma pipeta de Pasteur de vidro e transferir para um tubo de vidro de fundo redondo de fresco, em gelo. </li><li> Remova a fracção leve (banda superior) SEGUNDA com outra pipeta de Pasteur de vidro e transferir para um tubo de vidro separado de fundo redondo, fresco, em gelo. </li></ol></li><li> Diluir ambas as fracções recolhidas no passo 3.5 com 10 ml meio de isolamento e centrifugar a 6300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Descartar o sobrenadante a partir da fracção pesada obtida no passo 3.6, ressuspender o sedimento com um outro meio de isolamento de 10 ml e centrifugar de novo, como no passo 3.6. O sedimento resultante será a fracção pura mitocondrial. </li><li> Transferir o sobrenadante do Frac Luzção obtida no passo 3.6 para um tubo de centrífuga Ultra-Clear Beckman, em gelo. Descartar o sedimento. </li><li> Adicionar meio de isolamento suficientes para o sobrenadante obtido no passo 3.8 para encher o tubo e centrifuga-se a 100.000 xg durante 1 h, 4 ° C. O sedimento resultante será a fracção MAMs. Remova cuidadosamente e elimine o sobrenadante. </li></ol> Nota: Nesta etapa, você também pode centrifugar a 100.000 xg durante 1 hora, 4 ° C, o sobrenadante salvo no passo 2.6. O sedimento será a fracção sobrenadante ER e a fracção citosólica. 4. Extração de glicoesfingolipídeos enriquecidas microdomínios, Gemas <ol><li> Lisar as fracções puras mitocôndrias e / ou MAM em 500 ml-1 ul de tampão de extracção durante 20 minutos em gelo. </li><li> Centrifugar os lisados ​​a 15300 xg durante 2 min a 4 ° C. </li><li> Recolher os sobrenadantes (Triton X-100 o material solúvel) e re-centrifugação de pelotasdurante 2 minutos para remover o restante material solúvel. (Triton X-100 As mitocôndrias extraído e / ou Triton X-100 MAMs extraídos). </li><li> Solubilizar pelotas em solubilizantes Buffer. Este material solubilizado representa as fracções de gema e pode ser usado para análise posterior. </li></ol>

<ol><li>Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organellar+junctions+promote+targeted+Ca2%2B+signaling+in+smooth+muscle%3A+why+two+membranes+are+better+than+one%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one.</a> Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).</li>
<li>Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts+determine+clustering+of+STIM1+in+endoplasmic+reticulum-plasma+membrane+junctions+and+regulation+of+store-operated+Ca2%2B+entry+%28SOCE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE.</a> J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).</li>
<li>Levine, T., Rabouille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum%3A+one+continuous+network+compartmentalized+by+extrinsic+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).</li>
<li>Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM1-ganglioside+accumulation+at+the+mitochondria-associated+ER+membranes+links+ER+stress+to+Ca%282%2B%29-dependent+mitochondrial+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis.</a> Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).</li>
<li>Raturi, A., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Where+the+endoplasmic+reticulum+and+the+mitochondrion+tie+the+knot%3A+The+mitochondria-associated+membrane+%28MAM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM).</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2012).</li>
<li>Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+link+between+the+mitochondrial+network+and+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).</li>
<li>d'Azzo, A., Tessitore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sano+Gangliosides+as+apoptotic+signals+in+ER+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response.</a> Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).</li>
<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+permeabilization+in+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane permeabilization in cell death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li>
<li>Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdomains+with+high+Ca2%2B+close+to+IP3-sensitive+channels+that+are+sensed+by+neighboring+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria.</a> Science. 262, 744-747 (1993).</li>
<li>Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylated+TMX+and+calnexin+target+to+the+mitochondria-associated+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane.</a> EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).</li>
<li>Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cholesterol+in+the+association+of+endoplasmic+reticulum+membranes+with+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).</li>
<li>Grimm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ER-mitochondria+interface%3A+the+social+network+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The ER-mitochondria interface: the social network of cell death.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).</li>
<li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+synthesis+in+a+membrane+fraction+associated+with+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).</li>
<li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).</li>
<li>Pizzo, P., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+lipid+rafts%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte lipid rafts: structure and function.</a> Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).</li>
</ol>

Nenhum dos autores tem quaisquer conflitos de interesse a declarar.

Os locais de contacto entre as membranas intracelulares ou entre organelas e da membrana plasmática de células representam dinâmicas plataformas de sinalização para os processos celulares básicos. A caracterização exata de sua função e composição em ambas as condições fisiológicas e patológicas requer protocolos de purificação confiáveis ​​e reprodutíveis. Os métodos descritos aqui foram especificamente optimizados pelo nosso laboratório para o isolamento e purificação dos MAMs e as suas gemas correspondentes a partir d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENTES </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Fracionamento </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Fisher Scientific </td><td> S5-500 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-5761 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio, hexa-hidratada </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> O cloreto de cálcio hidratado, </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C-5080 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> MAM </td></tr><tr><td> D-Manitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9546-250G </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E4378-250G </td><td></td></tr><tr><td> BSA, Fracção V, de choque de calor, liofilizado </td><td> Roche </td><td> 03-116-964-001 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> GEM </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-500 ml </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de Sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Roche </td><td> 03-118-142-001 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144S-500 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dodecil sulfato de sódio (SDS) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP166-500 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Comum </td></tr><tr><td> Inibidores de protease Tablets, completa EDTA-livres </td><td> Roche </td><td> 11-873-580-001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPAMENTOS </td></tr><tr><td> 2 ml Douce todo em vidro Grinders Tecido </td><td> Kimble perseguição </td><td> 885300-0002 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml de polipropileno cónicas Tubos Centrífuga, BD Falcon </td><td> BD </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml de fundo redondo tubos de centrífuga de vidro </td><td> Kimble perseguição </td><td> 45500-30 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml de fundo redondo de vidro CentriTubos Fuge </td><td> Kimble perseguição </td><td> 45500-15 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de ultracentrifugação, ultra-claro, Thinwall, mm 14x89 </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Cole-Parmer </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> Descartável vidro borosilicato Pasteur Pipetas, 9 &quot; </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678 20C- </td><td></td></tr></tbody></table>

mitocôndrias associadas membranas er (mams) e glicoesfingolipídeos microdomínios enriquecidos (gems): isolamento de cérebro de rato

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

Organelas intracelulares são estruturas altamente dinâmicas com diferentes forma e composição, que estão sujeitos a células específicas sinais intrínsecos e extrínsecos. As membranas são freqüentemente justapostas em locais de contato definidas, que se tornam centros de troca de moléculas de sinalização e componentes de membrana 1,2,3,4. As inter-organellar microdomínios de membrana que são formados entre o retículo endoplasmático (ER) e das mitocôndrias durante a abertura do IP3-sensitive Ca 2 + canal são conhecidos como as mitocôndrias associado-ER membranas ou mams 4,5,6. A composição de proteína / lípido e propriedades bioquímicas dos sítios de contacto de membrana têm sido extensivamente estudadas em particular em relação ao seu papel na regulação da Ca 2 + intracelular 4,5,6. O ER serve como o armazenamento primário do Ca 2 + intracelular, e, nessa qualidade regula uma variedade de processos celulares a jusante de sinalização de Ca 2 +, including pós-traducional de dobragem de proteína e proteína maturation7. As mitocôndrias, por outro lado, manter a homeostase de Ca2 +, por tamponação citosólica concentração de Ca2 + que impede a abertura de vias apoptóticas jusante de Ca 2 + 4,8 desequilíbrio. A natureza dinâmica das MAMs torna locais ideais para dissecar mecanismos básicos celulares, incluindo Ca 2 + de sinalização e regulação da mitocondrial Ca 2 + sobrevivência concentração biossíntese de lipídios e transporte, metabolismo energético celular e 4,9,10,11,12. Vários protocolos têm sido descritas para a purificação dessas microdomínios de tecido do fígado e células de cultura 13,14. Tomando métodos anteriormente publicados em consideração, nós adaptamos um protocolo para o isolamento de mitocôndrias e MAMs a partir do cérebro de rato adulto. Para este procedimento, nós adicionamos uma etapa de purificação extra, ou seja, uma extração de Triton X100, que enables o isolamento da fracção microdomínio enriquecido glicosfingolípidos (GEM) dos MAMs. Estas preparações GEM partes componentes de proteínas com várias cavéolas e lipídico jangadas, derivadas a partir da membrana plasmática ou outras membranas intracelulares, e são propostos para funcionar como pontos de recolha para a agregação de proteínas receptoras e de interacções proteína-proteína 4,15.

Com base em nossa experiência com o uso deste protocolo podemos seguramente recomendar para o isolamento e purificação de MAMs, Gemas e frações mitocondriais de cérebro de rato. O processo como descrito é altamente reprodutível e consistente. Na Figura 1 mostra uma imagem representativa da camada de forma pura e mitocôndrias MAMs em um gradiente de Percoll (passo 3.4). Uma banda, definida leitoso contendo purificado mitocôndrias (Mito-P) segrega na parte inferior do tubo de ultracentrífuga, enquanto que...

Este procedimento ilustra como isolar a partir do cérebro do rato adulto membranas mitocôndrias associadas ER ou mams e as fracções enriquecidas glicoesfingolipídeos-microdomínio de MAMs e preparações mitocondriais.

Mitocôndrias associadas Membranas ER (MAMs) e glicoesfingolipídeos microdomínios enriquecidos (GEMS): Isolamento de cérebro de rato

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar a mitocôndria, a membrana do retículo endoplasm�tico, microdomínios ou MAMs (microdomínios associados à mitocôndria) do cérebro de camundongo. Os MAMs purificados são posteriormente extraídos para obter frações de microdomínios enriquecidas em lipídios do tipo glicofíngere, também chamadas de gems. Isso é realizado primeiramente por meio da dissecção do cérebro de camundongo, que é então homogeneizado em um tampão específico utilizando um homogeneizador de Dounce. O homogeneizado resultante é centrifugado em baixa velocidade para remoção de núcleos, células intactas e debris mortos.O segundo passo é preparar uma fração mitocondrial crua. Por meio de uma centrifugação adicional do sobrenadante, o precipitado resultante é ressuspenso e separado adicionalmente utilizando um gradiente de sacarose descontínuo. Em seguida, a fração mitocondrial crua é aplicada a um gradiente Percoll.Após a centrifugação e várias etapas de lavagem, obtém-se a fração mitocondrial pura e as MAMs. O passo final consiste em tratar as MAMs com uma solução contendo TRITON X-100 para extrair a fração de microdomínio enriquecida em lipídio glicofosfatidilinositol (GPI). Por fim, a pureza das frações é validada por análises de western blot, utilizando anticorpos contra marcadores proteicos característicos das diversas frações de organelas.A principal vantagem deste procedimento em relação aos métodos existentes é que ele foi adaptado para o isolamento das frações mitocondriais mam e gem a partir do cérebro de camundongos adultos, utilizando uma quantidade relativamente pequena de material de estudo. Este procedimento otimizado é altamente reprodutível e permite o isolamento de quantidades suficientes das diferentes frações organelares para serem utilizadas por pesquisadores, especialmente aqueles da área de neurobiologia. Para a análise de suas proteínas de interesse, a demonstração do procedimento será realizada por um técnico de meu laboratório.Após remover o cérebro de um camundongo eutanasiado com dióxido de carbono, inicie este procedimento cortando o cérebro ao meio. Coloque cada metade em um tubo separado de dois mililitros sobre gelo. Pese os tubos utilizando um tubo de dois mililitros pré-resfriado e vazio para zerar a balança e armazene-os sobre gelo.Transfira metade do cérebro para um homogeneizador de tecidos de vidro de dois mililitros previamente refrigerado, contendo um mililitro de solução de fracionamento fria. Homogeneíze com um total de 15 movimentos completos usando um pistilo com folga grande. Coloque o homogeneizado em um tubo Falcon estéril de 15 mililitros sobre gelo e dilua até 10 volumes da solução de fracionamento fria A, com base no peso da amostra.Em seguida, centrifugue a amostra a 1.400 ×g por 10 minutos a quatro graus. SIUs removem cuidadosamente o sobrenadante tomando cuidado para não perturbar o precipitado e transfiram para um tubo de centrífuga de vidro com fundo redondo de 30 mililitros sobre gelo. A seguir, re-suspenda o precipitado no mesmo volume de 10 vezes da solução de fracionamento.Homogeneíze o pellet ressuspenso no mesmo homogeneizador, um mililitro por vez. Desta vez, utilize três a seis movimentos de um pistilo de pequena folga. Combine o homogeneizado em um tubo Falcon de 15 mililitros e centrifugue a 710 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius.Isso resulta em núcleos apelativos e debris celular. Remova cuidadosamente o sobrenadante e combine-o com o sobrenadante anteriormente reservado da centrifugação anterior para iniciar o isolamento de mitocôndrias: centrifugue os sobrenadantes S a 13.800 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira o sedimento para um tubo de centrífuga UltraClear Beckman em gelo.Re-suspenda os pellets contendo a fração de mitocôndrias em 10 volumes da solução de fracionamento A e homogeneíze um mililitro de cada vez. Desta vez, utilize três a seis movimentos de um pistilo com pequeno ajuste, combinando os homogeneizados em um novo tubo de centrífuga de vidro com fundo redondo de 30 mililitros sobre gelo. Purifique ainda mais a amostra repetindo esses passos mais uma vez.Centrifugue o homogenato. Retire os sobrenatantes S e rehomogenize o pellet celular, um mililitro por vez, após suspender em 10 volumes da solução A. O próximo passo é ressuspender o pellet contendo a fração mitocondrial enriquecida em 4,8 mililitros da solução de fracionamento B por grama do peso original do cérebro, homogeneizando com seis movimentos de um pistilo de pequena folga em um homogeneizador novo, e armazenar este homogenato no gelo. Em seguida, prepare um gradiente descontínuo de sacarose em um tubo de centrífuga UltraClear Beckman.Primeiro, adicione a paleta ressuspendida seguida por três mililitros de sacarose 850 milimolar, três mililitros de sacarose um molar e, finalmente, três mililitros de sacarose 1,2 molar. Certifique-se de adicionar a solução lentamente a partir da parte inferior para garantir que não se formem bolhas. Por fim, centrifugue a 82.500 ×g por duas horas a quatro graus Celsius.A separação resultante produzirá três bandas e a fração apical. A fração apical contém as mitocôndrias brutas que serão utilizadas nas etapas subsequentes de purificação. Re-suspenda as mitocôndrias brutas recém-isoladas de uma metade do cérebro com dois mililitros de meio de isolamento.Em seguida, adicione oito mililitros de um gradiente de 30 % por núcleo a um tubo novo de centrífuga UltraClear Beckman. Deite lentamente a suspensão mitocondrial sobre o gradiente preparado, com cuidado para evitar a formação de bolhas. Em seguida, centrifugue a 95.000 × g durante 30 minutos a quatro graus Celsius, após a separação do gradiente.Primeiro, remova a fração pesada, que é a banda inferior, com uma pipeta de vidro tipo espaguete e transfira-a para um tubo de vidro novo com fundo redondo. Guarde o tubo no gelo. Em seguida, remova a fração leve, que é a banda superior, com uma nova pipeta de vidro tipo espaguete e transfira para um tubo de vidro com fundo redondo separado e novo.Coloque este tubo também sobre gelo. Dilua ambas as frações com 10 mililitros de meio de isolamento e centrifugue a 6.300 ×g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante da fração pesada e re-suspenda o pellet com mais 10 mililitros de meio de isolamento.Centrifugue a amostra novamente nas mesmas condições. O pellet resultante será a fração mitocondrial pura. Em seguida, transfira o sobrenadante da fração leve para um tubo de centrífuga UltraClear Beckman sobre gelo.O pellet desta fração é descartado, pois contém mitocôndrias contaminantes. Adicione meio de isolamento suficiente ao sobrenadante da fração leve para preencher o tubo e centrifugue a 100.000 ×g por uma hora a quatro graus Celsius. O pellet resultante conterá as membranas do retículo endoplasmatico associadas a mitocôndrias, ou MAMs.Remova e descarte cuidadosamente o supinato. Inicie a extração dos microdomínios enriquecidos com lipídeos de glicofíngers ou gems, homogeneizando a fração de MAM em 500 microlitros a um mililitro de tampão de extração em gelo durante 20 minutos. Em seguida, centrifugue o lisado a 15.300 ×g durante dois minutos a quatro graus Celsius.Colete o sobrenadante e centrifugue o pellet por dois minutos para remover todo o material solúvel em Triton X-100 restante, e finalmente re-suspenda o pellet com o tampão solubilizante. Esse material solubilizado representa as frações geminadas e pode ser usado para análises adicionais. Foram realizados western blots para verificar a pureza e distribuição de marcadores do retículo endoplasmatico, proteínas citosólicas e marcadores mitocondriais na fração citosólica.A fração do retículo endoplasmático, a fração mitocondrial pura e a fração de MAMs. Os blots ocidentais também mostraram que as gemas foram positivas para cavi em um, um marcador de cli, e negativas para proteínas do retículo endoplasmático e mitocondriais. Por outro lado, as MAMs extraídas com Triton X 100 foram positivas para marcadores do retículo endoplasmático e mitocondriais e apresentaram pouco cavi em um durante a tentativa deste procedimento.É importante lembrar de usar tecido cerebral recém-dissecado e manter subsequentemente todas as soluções, amostras e tubos em gelo. Além disso, recomenda-se guardar uma pequena quantidade da amostra de cada etapa da fracionamento para poder determinar, por meio de Western blot, o sucesso geral do procedimento de purificação.

mitochondria-associated-er-membranes-mams-glycosphingolipid-enriched

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A visualização e análise mitocondrial do tecido cerebral de mamíferos é uma tarefa desafiadora. Aqui, descrevemos como a análise de reconstrução tridimensional (3D) da microscopia eletrônica de varredura serial (SBFSEM) pode ser usada para obter insights sobre a análise morfológica e volumétrica dessa organela geradora de energia crítica.

Análise do Cérebro mitocôndrias Usando Serial Block-cara Scanning Electron Microscopy

Aqui, descrevemos um procedimento para visualizar e quantificar com alta sensibilidade as interações endógenos entre o retículo endoplasmático e mitocôndrias nas células fixas. O protocolo apresenta um otimizado no ensaio de ligação de proximidade situ visando o inositol 1,4,5-trifosfato de receptor / proteína regulada por glucose 75 / complexo D canal de ânions / ciclofilina dependente da tensão na interface membrana associada à mitocôndria.

Estudo do retículo endoplasmático e mitocôndrias Interações por<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidade Ligadura Ensaio em células fixas

Nós apresentamos um protocolo para estudar a distribuição das mitocôndria e do retículo endoplasmático em pilhas inteiras após a modificação genética usando a luz correlativa e a microscopia de elétron do volume que incluem a peroxidase 2 do ascorbato e a mancha do peroxidase do rábano, seccionamento serial de células com e sem o gene alvo na mesma seção, e imagens seriadas via microscopia eletrônica.

Mitocôndria e Reticulum endoplasmático por microscopia eletrônica de luz e volume correlativo

Nós fornecemos um protocolo para o isolamento da microglia de diferentes regiões dissecadas de um hemisfério cerebral de camundongo adulto, seguido de preparação de biblioteca semi-automatizada para sequenciamento profundo de RNA unicelular de transcrições completas. Este método ajudará a elucidar a heterogeneidade funcional da microglia na saúde e na doença.

Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

Descrevemos um protocolo detalhado para a geração de organoides cerebrais pluripotentes induzidos por células-tronco induzidos pelo homem e seu uso na modelagem de doenças mitocondriais.

Geração de Organoides cerebrais humanos para modelagem de doenças mitocondriais

A preparação intensiva de "tubos" endoteliais cerebrais intactos de arteriolas parenchímicas cerebrais é ilustrada para o estudo da regulação do fluxo sanguíneo cerebral. Além disso, demonstramos os pontos fortes experimentais deste modelo de estudo endotelial para a medição de imagens de fluorescência e eletrofisiologia das principais vias de sinalização celular, incluindo alterações no potencial intracelular [Ca2+] e membrana.

Isolamento e Análise Funcional do Endotélio Arteriolar do Cérebro do Rato Parenchyma

Apresentamos um protocolo em duas etapas para isolamento de mitocôndrias de alta qualidade que é compatível com a descoberta e quantificação de proteínas em escala de proteoma. Nosso protocolo não requer engenharia genética e, portanto, é adequado para estudar mitocôndrias de quaisquer células e tecidos primários.

Isolamento sem etiquetas em duas etapas de mitocôndrias para melhor descoberta e quantificação de proteínas

Aqui, descrevemos a medição da taxa de transporte axonal de estabilizadores constitutivos de membranas do retículo endoplasmático (ER) associadas às mitocôndrias (MAMs), aumentando ou mantendo a geração de β-amilóide (Aβ) neurotóxico a partir de neurônios da doença de Alzheimer (DA) em tempo real para servir como uma métrica direta e quantitativa para medir a estabilização do MAM e auxiliar no desenvolvimento da terapêutica da DA.

Análise quantitativa da estabilização da membrana do retículo endoplasmático (MAM) associada às mitocôndrias em um modelo neural da doença de Alzheimer (DA) 

Este protocolo descreve uma técnica para a análise de supercomplexos respiratórios quando apenas pequenas quantidades de amostras estão disponíveis.

Isolamento de mitocôndrias para análise de supercomplexos mitocondriais a partir de pequenas amostras de cultura de tecidos e células 

Um protocolo foi desenvolvido para a preparação de mitocôndrias purificadas a partir de células microgliais, isolamento de proteínas mitocondriais para liberação de N-glicanos e detecção rápida de glicanos mitocondriais subcelulares usando ionização por eletrospray de dessorção a laser assistida por matriz infravermelha acoplada a espectrometria de massa de analisador de massa precisa de alta resolução.

Preparação mitocondrial de microglia para análise de glicanos

Aprenda a isolar MAMs e frações GEMS de cérebro de rato adulto usando dissecação, homogeneização e centrifugação em gradiente de sacarose. Este método reprodutível permite estudar metabolismo celular em neurociência.

Mitocôndrias associadas Membranas ER (MAMs) e glicoesfingolipídeos microdomínios enriquecidos (GEMS): Isolamento de cérebro de rato (Vídeo) | JoVE Journal

Mitocôndrias associadas Membranas ER (MAMs) e glicoesfingolipídeos microdomínios enriquecidos (GEMS): Isolamento de cérebro de rato

Explorar mais vídeos