Rápidas de teste colorimétrico para Qualitativamente Distinguir RNA e DNA em amostras biomoleculares

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar se uma amostra potencialmente heterogênea de biomoléculas contém ácido nucléico e/ou açúcares redutores. E se assim for, distinguir entre RNA e DNA com base na reatividade diferente de suas porções de açúcar. Isso é conseguido aplicando primeiro o ensaio Benedict para determinar se a mistura biomolecular contém açúcares redutores livres.

Como segunda etapa, é usado arsen ou ensaio, que estabelece se algum componente de açúcar contém ou não anéis de pênis. Em seguida, o reagente de difenil amina é usado para determinar se o açúcar pento é uma desoxirribose como no DNA ou não como no RNA. Os resultados mostram o tipo de biopolímero baseado em produtos de cor facilmente distinguíveis formados pelas reatividades diferenciais de componentes à base de açúcar na amostra, que podem ser analisados contra curvas padrão usando medições espectrofotométricas.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como eletroforese usando corantes fluorescentes, pico verde ou ouro cibernético, é que não há limitação com base no tamanho, carga ou componente de açúcar, e é eficiente em tempo e custo para testar a redução de açúcares. Prepare um volume adequado de seis x reagente de Benedict composto de 940 milimolares anidros, carbonato de sódio 588 milimolar, citrato de sódio di-hidratado e 68 milimolares de cobre. Dois sulfato penta hidrato.

Para cada amostra a ser analisada, adicione 100 microlitros dos seis reagentes Benedict ao tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione entre 10 a 500 microlitros de amostra a cada tubo e adicione água destilada dupla para trazer o volume final para 600 microlitros de vórtice ou pipeta. Para misturar a solução.

Incubar as amostras em banho-maria a ferver durante 20 minutos e depois deixá-las arrefecer durante 10 minutos antes da centrização a cerca de 10 000 RPM durante cinco minutos. Para sedimentar qualquer material particulado, transfira o supinato para um veterinário limpo após anular o UV vs. espectrofotômetro com água a 475 nanômetros.

Meça a absorvência da amostra para dosear os açúcares pento. Preparar dois reagentes BALs frescos com cloreto de hidrogénio 24,2 milimolares, seis molares e cloreto férrico 0,025 em peso por volume hexa-hidratado, de acordo com o protocolo de texto. Para cada amostra, adicione 500 microlitros de reagente de biles a um tubo de microcentrífuga.

Adicione entre 10 e 500 microlitros de amostra a cada tubo e adicione água bidestilada para trazer o volume final para um mililitro. Uma mistura. Ferva as amostras por 20 minutos, depois resfrie em temperatura ambiente por 10 minutos depois de girar a amostra para sedimentar o material particulado, meça a absorbância em 660 nanômetros usando água como branco.

Prepare dois x pratos de reagente de difenil amina composto por 60 milimolares de difenil amina, sete molares de ácido acético glacial, 179 milimolares de ácido sulfúrico e 62% de volume por volume. Etanol. Para cada reação, combine 500 microlitros de reagente, a amostra e água bidestilada para trazer o volume total para um mililitro. Depois de ferver as amostras por 20 minutos, resfriar a temperatura ambiente e girar, meça a absorbância em 600 nanômetros.

Mostrados aqui seus dados qualitativos representativos para o arsenal e pratos de Benedicts Biles, ensaios de difenil amina para compostos de referência conhecidos. Os painéis esquerdos mostram os controles positivos e negativos, e os painéis direitos exibem a faixa de detecção visível dos ensaios. Este painel ilustra a robustez dos ensaios, mostrando a reação do prato com amostras de heterogeneidade variável.

Por exemplo, DNA com RNA ou DNA com proteína. Observe que os resultados positivos do ensaio do prato são preservados para amostras contendo DNA, mesmo na presença de RNA ou proteína contaminante. As faixas de diluição nas amostras anteriores variam porque cada reação tem um limite de detecção visual distinto.

Dependendo do tipo de açúcar que está sendo analisado, espectros fotométricos, em vez de detecção visual, podem ser usados para melhorar as faixas de medição, conforme mostrado nesta curva padrão. Para o ensaio Benedict, uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de 30 minutos se executada corretamente.