Introdução à membrana apoiada sólida baseada Eletrofisiologia

Portanto, a eletrofisiologia baseada em membrana suportada abreviada para eletrofisiologia baseada em SSM. É uma nova abordagem eletrofisiológica. Ele oferece para uma série de aplicações uma melhoria significativa em comparação com os métodos convencionais.

A principal ferramenta da eletrofisiologia convencional é o eletrodo de micropartículas preenchido com eletrólito, enquanto sua eletrofisiologia baseada em M detecta a translocação de carga por meio de um eletrodo de membrana sólido suportado. É extremamente útil nos casos em que a eletrofisiologia convencional não pode ser usada, como no caso de transportadores bacterianos, que, salvo algumas raras exceções, não podem ser investigados pelos métodos de grampo de tensão ou patch cam. Nesses casos, a eletrofisiologia baseada em SSM provou ser muito bem-sucedida.

Também pode ser empregado para investigar transportadores eucarióticos fisiologicamente relevantes em membranas intracelulares. Existem muitas maneiras de realizar experimentos de eletrofisiologia baseados em SSM. Na pesquisa básica, pode ser aplicado para determinar parâmetros cinéticos e esclarecer o mecanismo de transporte, mas sua robustez e potencial de automação o tornam ideal para aplicações de triagem na descoberta de trilhas.

O eletrodo SSM carrega um sistema de membrana composto que consiste no SSM subjacente e nos proteassomas ou fragmentos de membrana contendo sua proteína de transporte de interesse. As propriedades elétricas da membrana composta podem ser descritas por um circuito equivalente no qual as membranas formam um sistema acoplado capacitivamente. Observe que o comportamento elétrico do sistema é essencialmente o mesmo, independentemente de serem usados fragmentos de membrana ou lipossomas de protea.

O deslocamento de carga na proteína de transporte é transmitido ao circuito de medição através da capacitância da membrana da bexiga. Um princípio de detecção chamado acoplamento capacitivo. Em um experimento típico, a troca rápida de solução no VSSM fornece o substrato para a proteína de transporte V que resulta na atividade de transporte eletrogênico da proteína gera uma corrente, que é acoplada ao sistema de medição por meio da capacitância SSM.

Ao mesmo tempo, a atividade eletrogênica da proteína carrega gradualmente a membrana lipossomal, levando a uma inibição da proteína de transporte e da corrente decrescente no circuito de registro, a corrente medida é resultado de reações simultâneas de transporte de milhões de lipossomas protea absorvidos pelo Enzo. Cada um contendo cerca de 100 transportadores. A configuração consiste em uma gaiola de Faraday com um caminho de solução, circuitos externos para controle de válvulas, amplificação de sinal, além de aquisição e análise de dados.

A gaiola EC inclui recipientes, válvulas e tubos necessários para o controle do fluxo da solução, bem como um côvado com um chip XOR. O chip XOR carrega o eletrodo SSM e os lipossomas de proteção absorvidos. O vete é conectado ao amplificador e gerador de funções do circuito elétrico externo.

Medições SSM, causar fogo, duas soluções, uma ativadora e outra não ativadora além do substrato, que está presente apenas na solução ativadora. Ambas as soluções têm a mesma composição na configuração de troca única. Duas válvulas bidirecionais controlam o fluxo das soluções não reativadoras e ativadoras.

A válvula terminal, uma válvula de três vias acoplada mecanicamente, é usada para alternar entre as soluções não ativadora e ativadora, direcionando uma das soluções para o recipiente de resíduos e a outra solução para o qve. Quando a válvula terminal é comutada, o fluxo da solução não ativadora é redirecionado para o resíduo e a solução ativadora flui para o qve. Essa configuração permite um fluxo contínuo simultâneo de ambas as soluções.

A qualquer momento durante o protocolo de fluxo, o caminho do fluxo pode ser otimizado de acordo com a necessidade. No entanto, deve-se ter em mente que a distância entre o SSM e a junção das soluções não ativadoras e ativadoras deve ser mantida o mais curta possível. Uma vez que determina a solução do temporizador da troca da solução.

O amplificador de corrente fora da gaiola do deck de energia é conectado a um chip sensor. Normalmente, isso é definido para uma amplificação de 10 elevado a oito a 10, para a potência de nove volts por ampere e tempo de repouso de um a 10 milissegundos. Um gerador de funções é conectado ao eletrodo de referência e um computador com controle de válvula e software de aquisição de dados e uma caixa de interface completam o sistema.

A caixa de interface contém a aquisição de dados dos drivers de válvula e o fluxo da solução de hardware de saída digital é mantido por ar pressurizado de oh 0,22. A pressão de uma barra é monitorada usando um milímetro digital. Ele pode ser mantido enchendo um recipiente de aço instalado entre o suprimento de ar e os recipientes de solução na gaiola EC por meio de uma válvula de agulha.

O CVIC consiste em quatro partes. O chip zen é imprensado entre a base do veterinário e a cabeça do veterinário. Um conector de saída cilíndrico é aparafusado à cabeça do veterinário e carrega o conjunto do eletrodo de referência.

O eletrodo de referência consiste em um fio de prata clorado com um conector SMC em miniatura e é isolado da via de fluxo por uma ponte salina de gel poliacry. Se não estiver em uso, o conjunto da ponte de gel é armazenado em uma solução de fosfato de potássio de pH sete de 100 milimolares contendo cloreto de potássio de 100 milimolares. Primeiro, o eletrodo de referência deve ser montado no conjunto do eletrodo de referência que contém a ponte geográfica.

É importante evitar bolhas de ar durante a instalação do eletrodo de referência. Agora, esta parte do vete está conectada ao conector de saída, que foi pré-preenchido com solução tampão. Todas as conexões devem ser vedadas com anéis de vedação.

Este SM é formado em um chip zor, uma luz de vidro revestida de cabra estruturada. Esta estrada semática tem um milímetro e diâmetro e é conectada à almofada de contato por meio de uma tira de contato branca de 0,2 milímetro. Um pino de contato de mola cria um contato com o amplificador.

O chip zen é armazenado no escuro em uma solução de etanol tiol 10 LAR Okta Deccan. Para manter sua camada arcana para remover as moléculas virais do octa deccan, que não foram absorvidas, o eletrodo é enxaguado com etanol puro e o eletrodo seco em gás nitrogênio. Agora a monocamada de fosfocolina pode ser montada.

A solução lipídica contém 15 miligramas por mililitro de colina DFI e 250 microgramas por mililitro. Okta dois A mina em decaimento e é armazenada a menos 20 graus. O eletrodo agora é colocado com precisão na base do côvado SA.

Um microlitro da solução é adicionado ao eletrodo SSM sem tocar na camada de ouro. Imediatamente após a adição da solução lipídica, o veterinário pode ser montado. O volume vete vedado por um anel O é cilíndrico com um volume interno de 17 microlitros quando montado.

O SSM deve ser centralizado sob o orifício de entrada. Antes de conectar o veterinário, o sistema de fluido deve ser pré-preenchido com solução tampão de fosfato de potássio 100 milimolar. É importante garantir que não haja bolhas de ar na tubulação e nas válvulas.

Agora o veterinário pode ser montado na gaiola diurna da tireoide, conectar o amplificador, a entrada e saída da via de fluxo da solução e o gerador de funções. Finalmente, o côvado pode ser enxaguado com um tampão de fosfato de potássio de 100 milímetros. Isso leva à formação espontânea do MUS para verificar a qualidade do MUS.

A capacitância e a condutância são medidas usando o gerador de função para medir a condutância de 100 milivolts DC voltage é usado. O decaimento da corrente mostra a carga do capacitor de membrana depois que o capacitor está totalmente carregado. A corrente medida produz a condutância da membrana usando a lei de M.

Aqui observamos uma condutância de oh 0,17 nano Siemens. A capacitância pode ser medida usando tensão CA triangular de 50 milivolts pico a amplitude de pico e uma frequência de oh 0,5 hertz. A amplitude da corrente de onda quadrada resultante representa a corrente de julgamento do capacitor.

A capacitância é igual à carga transferida dividida pela tensão imposta. Esta membrana apresenta uma capacitância de 2,3 nano, uma alta condutância e uma baixa capacitância indicam que o SSM não está formado corretamente. Nestes casos, a membrana deve ser descartada e outro SSM preparado Usando um novo chip de eletrodo.

Normalmente, os lipossomas prot são armazenados congelados a menos 80. TRE th a amostra na sonicação com gelo é essencial porque uma amostra agregada absorve a polia para o SSM para obter uma suspensão homogênea de lipossomas prot. Três ciclos de sonicação de dez segundos são alternados com intervalos de resfriamento de dez segundos no gelo.

Enxágue o SSM com solução não ativadora. Em seguida, desaparafuse o conector de saída junto com o sample eletrodo de referência. Usando uma pipeta, injete 30 microlitros da amostra de proteína através da saída do vete no volume ette.

Primeiro monte a ponta da pipeta no orifício de saída. Em seguida, abra o manual acima na via de não ativação e injete os lipossomas de protea. Antes de rebaixar a ponta da pipeta.

Feche o manual acima para evitar mais fluxo de solução. Permitir que os lipossomas proteicos sejam absorvidos pelo MES durante um período de incubação de uma a duas horas. Use a janela de protocolo de fluxo do software de controle de válvula e aquisição de dados para definir seu protocolo de fluxo.

Se você deseja medir em condições simétricas, como para determinação da especificidade do substrato, valor KM ou dependência de pH, escolha o protocolo de troca de solução única. Defina a duração do fluxo para cada solução para oh 0,5 a um segundo. A corrente é registrada em todo o protocolo de fluxo.

A amplificação é normalmente definida como 10 elevado a nove e, para a taxa de amostragem, escolhemos 2000 pontos de dados por segundo. Por fim, salve seu novo protocolo sob o título NA a e a. No segundo toque da janela do protocolo de fluxo, você pode definir o estado aberto ou fechado de válvulas específicas para controlar o fluxo de solução não ativadora ou ativadora por meio do qubit.

Aqui demonstramos a medição de lipossomas de protea, a importação de prótons de açúcar como Y de E coli. A solução de ativação contém o substrato transportado lactose, enquanto a solução não ativadora contém a mesma quantidade de glicose não transportada que um composto compensatório. Além dos açúcares, as soluções contêm 100 milimolares de fosfato de potássio a pH 7,6 e um milimolar de DTT.

Depois de trocar as soluções, use a válvula manual para certificar-se de que as bolhas de ar sejam removidas. Antes de iniciar um protocolo de fluxo, ajuste a pressão antes de iniciar a medição. Usamos rotineiramente a pressão de Ø 0,6 bar, que em nossa configuração específica de válvula e tubo produz uma vazão de aproximadamente um mililitro por segundo.

Em seguida, selecione um protocolo de fluxo seguro aqui, o protocolo NAA, e pressione o botão Iniciar Para iniciar cada medição. Durante as primeiras medições vagamente absorvidas, os lipossomas de protea são removidos e, portanto, a corrente de pico pode diminuir. Repita a medição até que a corrente de pico permaneça constante.

Durante a primeira fase do fluxo de solução não ativadora, a corrente é zero. A troca da solução não ativadora para a solução ativadora, que contém lactose, induz a atividade de transporte eletrogênico da membrana. A carga positiva da proteína se acumula dentro dos lipossomas prote e o amplificador detecta uma corrente transitória positiva devido ao acoplamento positivo através do SSM.

Essa corrente positiva acoplada positivamente é chamada de troca V do sinal da solução de ativação. De volta à solução não ativadora induz o transporte do código de açúcar de prótons para fora dos lipossomas. Nesse caso, uma corrente acoplada LY negativa é exibida o chamado sinal desligado para análise cinética de proteína.

Apenas o sinal de ativação é usado, pois o sinal de desligamento é mal definido devido ao estado de carga da comutação da válvula de membrana cria artefatos mecânicos e elétricos. Felizmente, eles são restritos a um intervalo de tempo antes que os sinais induzidos pela proteína sejam observados. Observe que o atraso de 50 milissegundos entre os artefatos de comutação da válvula e os sinais do transportador é o tempo que a solução precisa para se propagar da válvula terminal para a superfície do SSM Rapid Solution Exchange, como o realizado no SSM representa um experimento de relaxamento típico.

Em tais experimentos, a corrente relaxa através de uma fase de estado estacionário dependente do tempo para um estado estacionário constante. Os detalhes cinéticos atuais do ciclo de reação podem ser derivados da forma e magnitude da corrente de estado estacionário anterior. Enquanto a corrente de estado estacionário fornece informações sobre a renovação contínua da proteína da membrana.

No sistema ly acoplado, onde os lipossomas de protea são absorvidos por seu SSM, as correntes de estado pré-estacionário são praticamente inalteradas. Embora uma corrente de estado estacionário constante nunca seja obtida, em vez disso, devido ao carregamento dos lipossomas, a corrente medida diminui gradualmente. A corrente do transportador pode ser calculada a partir da corrente medida acoplada por meio da análise do circuito.

Aqui demonstramos resultados representativos usando o co-transportador de prótons de açúcar, como Y na faixa de PA entre 8,5 e 7,6. A corrente do transportador é dominada por uma reação eletrogênica no final do ciclo de reação. Nessas condições, a face do estado estacionário consiste em um simples aumento de corrente para seu valor de estado estacionário.

Isso então decai devido ao acoplamento capacitivo. Estamos interessados na corrente de transporte em estado estacionário. Na ausência de um potencial de membrana, isso é representado para uma boa aproximação pela corrente de pico.

A cinética de Ali Mein pode, portanto, ser analisada borrando as correntes de pico para diferentes concentrações de substrato, mas considere que as amplitudes da corrente de pico só podem ser comparadas rigorosamente se forem obtidas de um único sensor em um experimento. Uma razão é a variabilidade da eficiência de absorção. Quando o pH é ainda mais reduzido, o sinal monofásico torna-se bifásico.

E, finalmente, um transiente rápido permanece para o mutante Y lag deficiente em transporte. O transiente rápido é seguido por um componente negativo pequeno e mais lento. O componente negativo é característico para correntes transitórias rápidas medidas em sistemas ly acoplados e é causado pela descarga de capacitância da membrana.

Aqui, a corrente de pico não representa o transporte em estado estacionário, mas sim uma confirmação eletrogênica de transição no início do ciclo iônico, que se torna aparente porque um mutante la y não mostra transporte em estado estacionário e, para lag do tipo selvagem, o transporte em estado estacionário é inibido por um pH baixo. A evidência experimental fornece uma interpretação mecanicista da translocação de carga no ciclo de reação de lag y, que é mostrada no modelo cinético. O transiente rápido observado para o mutante deficiente em transporte, ou no caso de lag Y do tipo selvagem em condições ácidas, é devido a uma rápida reação eletrogênica semanal após a ligação da lactose em valores de pH mais altos, o sinal é dominado pela reação eletrogênica principal no final do ciclo de reação, que foi proposto para representar a liberação de prótons pseudoplasmáticos no sistema capacitivamente acoplado.

Isso leva a correntes transitórias que representam o transporte em estado estacionário de Lag y devido à forte interação dos Utes. Com o SSM, artefatos elétricos são gerados quando soluções de composição diferente são trocadas. Certifique-se de que as soluções não ativadoras e ativadoras sejam o mais semelhantes possível, especialmente no que diz respeito ao pH e às forças iônicas.

O controle deve ser realizado porque os substratos também podem produzir artefatos. Sempre teste seu sistema tampão específico e protocolo de fluxo para artefatos usando o SSM simples antes que a amostra de proteína seja adicionada. Após a adição da proteína, as medições de controle da amostra podem ser feitas com soluções que contêm não substratos, que são estruturalmente semelhantes ao substrato.

Além disso, existe a possibilidade de testar o substrato para artefatos usando lipossomas ou fragmentos de membrana sem a proteína de interesse. Você também pode adicionar inibidores às suas soluções ou pipetá-las. Após o experimento diretamente na saída do vete para medir a inibição do sinal do transportador, os sinais específicos da proteína desaparecerão, deixando apenas artefatos de troca de solução.

O sinal da proteína pode ser facilmente corrigido. Certifique-se de que a perda de proteína absorvida, lipossomas ou degradação de proteínas não afete sua medição. Ao realizar medições de controle repetidas sob condições idênticas, um rundown de sinal de até 20% é aceitável e pode ser corrigido assumindo uma dependência de tempo linear do rundown.

Essa configuração é o resultado de 20 anos de desenvolvimento técnico em nosso laboratório. Além disso, estão disponíveis sistemas especializados com solução de temporizador mais alto para análise cinética e menor consumo de solução para substratos caros. Para triagem de drogas, usamos configurações totalmente automáticas com maior rendimento.

Até o momento, mais de 20 transportadores foram caracterizados usando esse método. Isso inclui APAs de transporte, complexos de cadeia respiratória, transportadores frios, trocadores e até canais de ferro. Portanto, quando você não conseguir resolver seu problema por eletrofisiologia padrão, considere usar a eletrofisiologia SS Mase.