Introdução à membrana apoiada sólida baseada Eletrofisiologia

Assim, a eletrofisiologia baseada em membranas suportadas, abreviada como eletrofisiologia baseada em SSM. É uma nova abordagem eletrofisiológica. Oferece, para diversas aplicações, uma melhoria significativa em comparação com os métodos convencionais.

A ferramenta principal da eletrofisiologia convencional é o eletrodo de micropartícula preenchido com eletrólito, enquanto a eletrofisiologia baseada em M detecta a translocação de carga por meio de um eletrodo de membrana suportada em sólido. É extremamente útil em casos nos quais a eletrofisiologia convencional não pode ser utilizada, como no caso de transportadores bacterianos, que, com raras exceções, não podem ser investigados pelos métodos de fixação de voltagem ou de fixação por eletrodo de patch. Nessas situações, a eletrofisiologia baseada em SSM tem se mostrado muito bem-sucedida.

Também pode ser empregado para investigar transportadores eucarióticos fisiologicamente relevantes em membranas intracelulares. Existem várias maneiras de realizar experimentos de eletrofisiologia baseados em SSM. Em pesquisa básica, pode ser aplicado para determinar parâmetros cinéticos e esclarecer o mecanismo de transporte, mas sua robustez e potencial para automação o tornam ideal para aplicações de triagem em descoberta de fármacos.

O eletrodo SSM possui um sistema de membrana composto, formado pela SSM subjacente e pelos proteassomos ou fragmentos de membrana que contêm a proteína transportadora de interesse. As propriedades elétricas da membrana composta podem ser descritas por um circuito equivalente no qual as membranas formam um sistema acoplado capacitivamente. Observe que o comportamento elétrico do sistema é essencialmente o mesmo, independentemente de serem usados fragmentos de membrana ou proteolipossomos.

O deslocamento de carga na proteína transportadora é transmitido ao circuito de medição por meio da capacitância da membrana da bexiga. Um princípio de detecção denominado acoplamento capacitivo. Em um experimento típico, a troca rápida de solução no VSSM fornece o substrato para a proteína transportadora V, cuja atividade transportadora eletrogênica subsequente gera uma corrente, que é acoplada ao sistema de medição por meio da capacitância do SSM.

Ao mesmo tempo, a atividade da proteína eletrogênica carrega gradualmente a membrana lipossomal, levando à inibição da proteína transportadora e à diminuição da corrente no circuito de registro. A corrente medida é resultado de reações de transporte simultâneas de milhões de lipossomos proteicos absorvidos ao Enzo, cada um contendo cerca de 100 transportadores. O sistema consiste em uma gaiola de Faraday com um percurso para solução, circuitos externos para controle de válvulas, amplificação de sinal, além de aquisição e análise de dados.

A gaiola EC inclui recipientes, válvulas e tubos necessários para o controle do fluxo de solução, bem como um cubito com um chip XOR. O chip XOR contém o eletrodo SSM e os lipossomos prot absorvidos. O vete está conectado ao amplificador e ao gerador de funções do circuito elétrico externo.

Medições de SSM, provocam fogo, duas soluções, uma ativadora e outra não ativadora, além do substrato, que está presente apenas na solução ativadora. Ambas as soluções têm a mesma composição na configuração de troca simples. Duas válvulas de dois caminhos controlam o fluxo das soluções não ativadora e ativadora.

A válvula terminal, uma válvula mecanicamente acoplada de três vias por três vias, é usada para alternar entre as soluções não ativadoras e ativadoras, direcionando uma das soluções para o recipiente de resíduos e a outra solução para a qve. Quando a válvula terminal é comutada, o fluxo da solução não ativadora é redirecionado para o resíduo e a solução ativadora flui para a qve. Essa configuração permite um fluxo contínuo simultâneo de ambas as soluções.

A qualquer momento durante o protocolo de fluxo, o trajeto do fluxo pode ser otimizado conforme necessário. No entanto, deve-se ter em mente que a distância entre a MME e a junção das soluções não ativadoras e ativadoras deve ser mantida tão curta quanto possível, já que isso determina o tempo da troca de solução.

O amplificador de corrente externo à gaiola do módulo de potência está conectado a um chip sensor. Normalmente, isso é ajustado para uma amplificação de 10 elevado à oitava potência até 10 elevado à nona potência volt por amper e tempo de repouso de um a 10 milissegundos. Um gerador de funções está conectado ao eletrodo de referência e um computador com software de controle de válvulas e aquisição de dados e uma caixa de interface completam o sistema.

A caixa de interface contém os acionadores de válvula, a aquisição de dados e a solução de hardware para saída digital; o fluxo da solução é mantido por ar pressurizado de 0,22 µm. Uma pressão de uma bar é monitorada usando um milímetro digital. Ela pode ser mantida enchendo um recipiente de aço instalado entre a fonte de ar e os recipientes de solução na EC Cage por meio de uma válvula de agulha.

O CVIC é composto por quatro partes. O chip zen é colocado entre a base vet e a cabeça vet. Um conector de saída cilíndrico é parafusado à cabeça vet e sustenta o conjunto do eletrodo de referência.

O eletrodo de referência consiste em um fio de prata clorada com um conector SMC miniatura e é isolado do percurso de fluxo por uma ponte salina de gel de acrílico polimerizado. Quando não estiver em uso, o conjunto da ponte de gel é armazenado em uma solução de fosfato de potássio 100 milimolar, pH 7, contendo 100 milimolar de cloreto de potássio. Primeiro, o eletrodo de referência deve ser montado no conjunto do eletrodo de referência que contém a ponte geo.

É importante evitar bolhas de ar ao instalar o eletrodo de referência. Agora, esta parte do vete é conectada ao conector de saída, que já foi previamente preenchido com solução tampão. Todas as conexões devem ser vedadas com anéis O.

Este SM é formado em um chip zor, um vidro estruturado revestido com cabra. Esta trilha semática tem um milímetro de comprimento e diâmetro e é conectada ao pad de contato por meio de uma trilha de contato branca de 0,2 milímetro. Um pino de contato de mola cria uma conexão com o amplificador.

O chip zen é armazenado no escuro em uma solução de etanol tiol 10 LAR Okta Deccan. Para manter sua camada de tiol arcano e remover as moléculas virais Okta Deccan que não foram absorvidas, o eletrodo é lavado com etanol puro e secado em gás nitrogênio. Agora, a monocamada de fosfocolina pode ser montada.

A solução lipídica contém 15 miligramas por mililitro de colina DFI e 250 microgramas por mililitro de Okta dois A mine em decaimento e é armazenada a menos 20 graus. O eletrodo é agora colocado com precisão na base do cúbito SA.

Um microlitro da solução é adicionado ao eletrodo SSM sem tocar a camada de ouro. Imediatamente após a adição da solução lipídica, o vete pode ser montado. O volume do vete selado por uma junta O ring é cilíndrico, com um volume interno de 17 microlitros quando montado.

O SSM deve ser centralizado sob o orifício de entrada. Antes de conectar o vet, o sistema de fluido precisa ser previamente preenchido com solução tampão de fosfato de potássio a 100 milimolar. É importante garantir que não haja bolhas de ar nas tubulações e nas válvulas.

Agora, o vet pode ser montado na gaiola de dia tireoide, conectando-se o amplificador, a entrada e saída do percurso de fluxo da solução e o gerador de funções. Por fim, o cubito pode ser lavado com um tampão de fosfato de potássio de 100 milimolares. Isso leva à formação espontânea de SSM para verificar a qualidade do SSM.

A capacitância e a condutância são medidas utilizando o gerador de funções para medir a condutância, sendo usada uma tensão contínua de 100 milivolts. A queda da corrente mostra o carregamento do capacitor da membrana após o capacitor estar completamente carregado. A corrente medida fornece a condutância da membrana utilizando a lei de M'S.

Aqui observamos uma condutância de 0,17 nano Siemens. A capacitância pode ser medida utilizando uma tensão CA triangular com amplitude de pico a pico de 50 milivolts e uma frequência de 0,5 hertz. A amplitude da corrente em onda quadrada resultante representa a corrente de julgamento do capacitor.

A capacitância é igual à carga transferida dividida pela tensão aplicada. Esta membrana apresenta uma capacitância de 2,3 nano; uma alta condutância e uma baixa capacitância indicam que o SSM não foi corretamente formado. Nesses casos, a membrana deve ser descartada e um novo SSM preparado utilizando um novo chip de eletrodo.

Normalmente, os protolipossomos são armazenados congelados a menos 80. É essencial manter a amostra em gelo durante a sonicação, porque uma amostra agregada absorve mal na membrana de suporte (SSM), dificultando a obtenção de uma suspensão homogênea de protolipossomos. São realizados três ciclos de sonicação de dez segundos, alternados com intervalos de resfriamento de dez segundos em gelo.

Lave o SSM com solução não ativadora. Em seguida, desparafuse o conector de saída juntamente com a amostra do eletrodo de referência. Usando uma pipeta, injete 30 microlitros da amostra proteica através da saída do vete no volume da ette.

Primeiro, acople a ponteira da pipeta ao orifício de saída. Em seguida, abra o manual acima no caminho não ativador e injete os lipossomos de proteína. Antes de remover a ponteira da pipeta.

Feche o manual acima para evitar o fluxo adicional de solução. Deixe as lipossomas de proteína absorverem na SSM por um tempo de incubação de uma a duas horas. Utilize a janela Protocolo de Fluxo do software de controle de válvula e aquisição de dados para definir o seu protocolo de fluxo.

Se desejar realizar medições sob condições simétricas, como para determinação da especificidade do substrato, valor de KM ou dependência de pH, escolha o protocolo de troca de solução única. Defina a duração do fluxo para cada solução entre 0,5 e um segundo. A corrente é registrada durante todo o protocolo de fluxo inteiro.

A amplificação é normalmente ajustada para 10 elevado à nona potência, e para a taxa de amostragem, escolhemos 2000 pontos de dados por segundo. Por fim, salve seu novo protocolo com o título NA a e a. Na segunda aba da janela do protocolo de fluxo, é possível definir o estado aberto ou fechado de válvulas específicas para controlar o fluxo de soluções não ativadoras ou ativadoras através do qubit.

Aqui demonstramos a medição de lipossomos de proteínas, com a importação de prótons ligada ao açúcar Y proveniente de E. coli. A solução ativadora contém o substrato transportado lactose, enquanto a solução não ativadora contém a mesma quantidade de glicose, que não é transportada, como composto compensatório. Além dos açúcares, as soluções contêm fosfato de potássio 100 milimolar em pH 7,6 e um milimolar de DTT.

Após trocar as soluções, use a válvula manual para garantir que as bolhas de ar sejam removidas. Antes de iniciar um protocolo de fluxo, ajuste a pressão logo antes de começar a medição. Usamos rotineiramente uma pressão de 0,6 bar, que, na nossa configuração específica de válvula e tubo, resulta em uma taxa de fluxo de aproximadamente um mililitro por segundo.

Em seguida, selecione aqui um protocolo de fluxo seguro, o protocolo NAA, e pressione o botão de início para iniciar cada medição. Durante as primeiras medições, lipossomos proteicos fracamente absorvidos são removidos e, portanto, a corrente de pico pode diminuir. Repita a medição até que a corrente de pico permaneça constante.

Durante a primeira fase do fluxo da solução não ativadora, a corrente é zero. A troca da solução não ativadora para a solução ativadora, que contém lactose, induz a atividade de transporte eletrogênico da membrana. Cargas positivas da proteína se acumulam no interior das proteolipossomas e o amplificador detecta uma corrente transitória positiva devido ao acoplamento positivo via SSM.

Essa corrente positiva e positivamente acoplada é chamada de sinal de ligação V de troca a partir da solução ativadora. A volta para a solução não ativadora induz o transporte de prótons e açúcares para fora dos lipossomos. Nesse caso, uma corrente negativa acoplada LY é exibida, o chamado sinal de desligamento para análise cinética de proteínas.

Apenas o sinal de ligado é utilizado, já que o sinal de desligado é mal definido devido aos artefatos mecânicos e elétricos gerados pela mudança no estado de carga da válvula da membrana. Felizmente, esses artefatos estão restritos a um intervalo de tempo anterior à observação dos sinais induzidos pela proteína. Observe que o atraso de 50 milissegundos entre os artefatos da comutação da válvula e os sinais do transportador corresponde ao tempo necessário para que a solução se propague da válvula terminal até a superfície do SSM. Troca Rápida de Solução, como a realizada no SSM, representa um experimento típico de relaxamento.

Em tais experimentos, a corrente relaxa através de uma fase dependente do tempo pré-estado estacionário até um estado estacionário constante. Detalhes cinéticos da corrente do ciclo de reação podem ser derivados da forma e magnitude da corrente pré-estado estacionário. Enquanto a corrente no estado estacionário fornece informações sobre a renovação contínua da proteína de membrana.

No sistema acoplado indiretamente, no qual lipossomos proteicos são absorvidos à sua membrana de suporte de selagem (SSM), as correntes no pré-estado estacionário são praticamente inalteradas. Embora uma corrente constante em estado estacionário nunca seja obtida, devido à carga dos lipossomos, a corrente medida diminui gradualmente. A corrente do transportador pode ser calculada a partir da corrente acoplada indiretamente medida por meio de análise de circuito.

Aqui demonstramos resultados representativos utilizando o cotransportador de prótons açúcar, como Y na faixa de PA entre 8,5 e 7,6. A corrente do transportador é dominada por uma reação eletrogênica tardia no ciclo de reação. Nessas condições, a fase pré-estacionária consiste em uma simples elevação da corrente até seu valor de estado estacionário.

Isso então decai devido ao acoplamento capacitivo. Estamos interessados na corrente de transporte em estado estacionário. Na ausência de um potencial de membrana, isso é representado, com boa aproximação, pela corrente de pico.

A cinética de Ali Mein pode, portanto, ser analisada por meio do gráfico das correntes máximas em diferentes concentrações de substrato, mas considere que as amplitudes das correntes máximas só podem ser comparadas rigorosamente se forem obtidas a partir de um único sensor em um único experimento. Um dos motivos é a variabilidade da eficiência de absorção. Quando o pH é reduzido ainda mais, o sinal monofásico torna-se bifásico.

E, finalmente, um transitório rápido permanece para o mutante lag Y deficiente em transporte. O transitório rápido é seguido por um componente negativo pequeno e mais lento. O componente negativo é característico de correntes de transitórios rápidos medidas em sistemas acoplados indiretamente e é causado pela descarga da capacitância da membrana.

Aqui, a corrente de pico não representa o transporte em estado estacionário, mas sim uma confirmação eletrogênica de uma transição inicial no ciclo iônico, o que se torna evidente porque um mutante la y não apresenta transporte em estado estacionário, e no caso do lag selvagem y, o transporte em estado estacionário é inibido por um pH baixo. A evidência experimental fornece uma interpretação mecanicista da translocação de carga no ciclo de reação do lag y, que é mostrado no modelo cinético. O transitório rápido observado para o mutante deficiente no transporte, ou no caso do lag selvagem Y em condições ácidas, deve-se a uma rápida reação eletrogênica semanal após a ligação da lactose em valores de pH mais altos; o sinal é dominado pela principal reação eletrogênica no final do ciclo de reação, a qual foi proposta para representar a liberação de prótons pseudoplásmica no sistema capacitivamente acoplado.

Isso leva a correntes transitórias que representam o transporte em estado estacionário de Lag y devido à forte interação dos Utes. Com o SSM, artefatos elétricos são gerados quando soluções de composição diferente são trocadas. Certifique-se de que as soluções não ativadoras e ativadoras sejam tão semelhantes quanto possível, especialmente em relação ao seu pH e forças iônicas.

O controle deve ser realizado porque os substratos também podem produzir artefatos. Sempre teste o seu sistema de tampão específico e protocolo de fluxo quanto a artefatos usando a MMS nua antes da adição da amostra proteica. Após a adição da amostra proteica, os controles podem ser realizados com soluções que contêm compostos não substratos, mas estruturalmente semelhantes ao substrato.

Além disso, há a possibilidade de testar o substrato quanto a artefatos utilizando lipossomos ou fragmentos de membrana sem a proteína de interesse. Você também pode adicionar inibidores às suas soluções ou pipetá-los. Após o experimento, diretamente na saída do vete, para medir a inibição do sinal do transportador, os sinais específicos da proteína desaparecerão, restando apenas os artefatos de troca de solução.

O sinal da proteína então pode ser facilmente corrigido. Certifique-se de que a perda de proteína absorvida, lipossomos ou degradação proteica não afete sua medição. Ao realizar medições-controle repetidas em condições idênticas, uma redução do sinal de até 20% é aceitável e pode ser corrigida assumindo-se uma dependência temporal linear da redução.

Esta configuração é o resultado de 20 anos de desenvolvimento técnico em nosso laboratório. Além disso, existem sistemas especializados com maior solução de temporização para análise cinética e menor consumo de solução para substratos caros. Para triagem de fármacos, utilizamos configurações totalmente automáticas com maior produtividade.

Até o momento, mais de 20 transportadores foram caracterizados utilizando este método. Entre eles estão transportadores APA, complexos da cadeia respiratória, transportadores de cool, trocadores e até canais de ferro. Assim, quando você não conseguir resolver seu problema por meio da eletrofisiologia padrão, considere utilizar a eletrofisiologia SS Mase.