Um modelo Zebrafish de Diabetes Mellitus e Memória Metabólica

Memória metabólica é o fenômeno pelo qual complicações diabéticas persistir e progredir sem obstáculos, mesmo depois de euglicemia é alcançado farmacêutico. Descrevemos aqui um modelo de diabetes mellitus do peixe-zebra que é único na medida em que permite que o exame dos componentes mitoticamente transmissíveis epigenéticos de memória metabólica

O objetivo geral deste procedimento é gerar um modelo de peixe-zebra com diabetes mellitus tipo um, que pode ser usado para descobrir a base molecular das complicações do diabetes mellitus e, mais importante, determinar a base genética para sua persistência. Isso é feito primeiro induzindo a hiperglicemia com uma série de injeções do medicamento diabetogênico STZ e incubação dos peixes a uma temperatura reduzida. Em seguida, após três semanas, os níveis de glicose no sangue em jejum são determinados para garantir que o estado hiperglicêmico foi induzido e o medicamento é interrompido para iniciar a recuperação das células beta.

Em seguida, a barbatana do caudel é amputada e regenerada para isolar componentes geneticamente transmissíveis da memória metabólica e remover fatores potencialmente complicadores do ambiente hiperglicêmico anterior. Finalmente, um ensaio de regeneração da barbatana é realizado para documentar uma redução persistente na regeneração da barbatana e identificar alterações induzidas no tecido seccionado por meio de um ensaio de interesse. A principal vantagem do modelo de peixe-zebra diabético sobre os existentes é que a memória metabólica pode ser estudada em um verdadeiro ambiente glicêmico U no verão para o que seria visto em pacientes após um transplante de pâncreas.

Espera-se que o modelo seja utilizado para a descoberta das modificações epigenéticas subjacentes à memória metabólica e à persistência de complicações diabéticas Para gerar peixes-zebra com diabetes mellitus, prepare um tanque de recuperação com água normal de peixes e um tanque anestésico de água de peixes com uma diluição de um a 1000 de dois fenoxietanol sob uma capela de exaustão. Prepare uma solução a 0,3% de STREPTOZOTOCIN ou STZ adicionando seis miligramas de STZ a dois mililitros de cloreto de sódio a 0,09% e coloque imediatamente a solução no gelo em um tubo separado. Alíquota suficiente para controle.

Os peixes enchem uma seringa de meio CC equipada com uma agulha de calibre 27 e meio com a STZ ou soluções de controle, garantindo que nenhuma bolha de ar fique presa. Anestesie um único peixe colocando-o em água anestésica e esperando até que o movimento de natação cesse, cerca de um a dois minutos. Uma vez anestesiado brevemente colocado o peixe em uma toalha de papel para absorver qualquer excesso de água, em seguida, colocar o peixe em um barco caminho e pesá-lo.

Em seguida, coloque o peixe em uma superfície firme. Em seguida, insira a agulha além do chanfro na face posterior do peritônio ventral e injete 0,35 miligramas por grama de TZ ou um volume equivalente de solução de controle na cavidade peritoneal do peixe após a injeção. Coloque o peixe no tanque de água de recuperação e monitore-o quanto à atividade normal de natação.

Depois de injetar peixes suficientes para o experimento, transfira-os para tanques vivos normais e mantenha-os a uma temperatura de 22 a 24 graus Celsius. A temperatura reduzida é fundamental para a indução eficiente da hiperglicemia para induzir um estado prolongado de hiperglicemia muito alta, siga um cronograma de injeções frequentes durante a fase de indução, seguidas de injeções semanais de manutenção, conforme mostrado aqui para coletar sangue. Para determinar o FBGL, prepare um tubo de PCR marcado para cada amostra de sangue contendo cinco microlitros de solução salina normal.

Depois de anestesiar o peixe, seque o excesso de água, coloque o peixe em uma lâmina de microscópio e, usando um bisturi, remova a cabeça na base do opérculo, colete o sangue que é liberado na lâmina e adicione-o rapidamente ao tubo de PCR de pipetagem salina normal estéril para cima e para baixo para garantir que o sangue não coagule, coloque imediatamente a amostra no gelo. Determine o volume da amostra de sangue medindo o volume total do líquido no tubo e subtraindo os cinco microlitros de solução salina. Transfira cinco microlitros do sangue diluído de cada tubo de PCR para um tubo de microfuga de 1,5 mililitro e use o kit de ensaio de glicose de cromo quântico de acordo com as instruções do fabricante para determinar a concentração de glicose no sangue.

Depois de anestesiar um peixe, coloque-o em uma placa de Petri e, sob um escopo de dissecação, use um bisturi estéril tamanho 10 para amputar a barbatana de mimo, cortando uma linha reta proximal ao primeiro ponto de ramificação da traqueia lipídica para a fase de crescimento regenerativo do ensaio. Coloque os peixes em um tanque de recuperação a 33 graus Celsius para fazer a imagem das barbatanas regeneradoras. Depois de anestesiar um peixe, espalhe a barbatana para que fique totalmente estendida e use uma luneta de dissecação equipada com uma câmera e um software de elemento NIS.

Colete imagens com ampliação de um x para medir o crescimento regenerativo. Imprima as imagens e use o software de imagem J e um bloco de desenho para traçar toda a área de novo crescimento para precisão do traçado. Certifique-se de que não haja sombras ou gotículas de água e faça cada medição cinco vezes para calcular a média.

Para normalizar as medições, meça o comprimento do local da amputação ao longo do eixo dorsal ventral e divida a área previamente determinada por esta medição. Depois de gerar um grupo de MS FISH e seus controles aos 21 dias, determinar o FBGL para um subconjunto do grupo e dividir o MS fish em dois subgrupos durante o experimento. Continue as injeções semanais de STZ para um dos grupos, pois os controles de DM para o segundo grupo interrompem as injeções de STZ e incubam os peixes em temperatura normal.

Dentro de 14 dias, esses peixes-zebra restaurarão o controle normal da insulina e da glicose no sangue por meio da regeneração do pâncreas. Esses peixes agora são chamados de memória metabólica ou MM, peixes no dia 30 após a remoção da droga amputam as barbatanas de algodão de controle DM e MM Retorne os peixes às condições normais de água para regeneração das barbatanas por 30 dias no dia 60.

Realizar uma segunda amputação dentro do tecido que foi regenerado no período de 30 a 60 dias e realizar um ensaio de regeneração da nadadeira de mimo, isolar o tecido e realizar um ensaio de interesse. O peixe-zebra diabético tipo um não apenas exibe as complicações secundárias conhecidas de retinopatia e nefropatia, mas também exibe uma complicação adicional prejudicada na regeneração da nadadeira, como pode ser visto aqui 72 horas após a amputação. Esta complicação persiste devido à memória metabólica em peixes que restauraram o controle normal da glicose após um período hiperglicêmico, como mostrado aqui, o peixe-zebra mm exibe um déficit na regeneração das nadadeiras de aproximadamente 40% quando comparado ao peixe controle, e o comprometimento foi observado até 150 dias após a amputação.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como iniciar o estado hiperglicêmico no peixe-zebra, medir os níveis de glicose no sangue em jejum, realizar estudos de regeneração de barbatanas e, finalmente, gerar peixes com memória metabólica.