Name: Isolamento de miócitos atriais humanos para Medições Simultâneas de Ca 2 + Transitórios e correntes de membrana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprenda a isolar miócitos atriais humanos para medições simultâneas de Ca²⁺ e correntes de membrana. Este método utiliza digestão enzimática e patch clamp para estudar fisiologia cardíaca e doenças como fibrilação atrial.

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Além disso, agradecemos aos cirurgiões cardíacos da Universidade de Heidelberg para a prestação de tecido atrial humano e Claudia Liebetrau, Katrin Kupser e Ramona Nagel por sua excelente suporte técnico. Um agradecimento especial também para Andy W. Trafford para suas sugestões e conselhos durante o estabelecimento dos Ca 2 + medidas transitórias. Os autores desejam expressar sua profunda gratidão aos membros do Departamento de Farmacologia e Toxicologia (cabeça: Ursula Ravens), da Universidade de Tecnologia de Dresden pela oportunidade que nos ofereceram para aprender técnicas e habilidades básicas em eletrofisiologia celular e isolamento dos cardiomiócitos. Pesquisa dos autores é apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (Do769/1-1-3), o Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa, através da Rede de Competência Fibrilação Atrial (01Gi0204) e do Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular, a União Europeia através de o EuRede ropeia para Pesquisa Translacional em Fibrilação Atrial (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, o projeto de integração em larga escala, Proposta n º 261057) ea Aliança de Investigação Europeia-América do Norte fibrilação atrial (ENAFRA) concessão de Fondation Leducq (07CVD03). A visão geral do esquema mostrado no arquivo de vídeo foi produzido usando Servier arte médica.

Protocolos experimentais precisa ser aprovado pelo comitê de ética local e todos os pacientes precisam dar consentimento informado por escrito. Nossa pesquisa foi aprovado pelo comitê de ética da Faculdade de Medicina de Mannheim, da Universidade de Heidelberg (# 2011-216N-MA) e foi realizado em conformidade com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano. Todos os pacientes assinaram termo de consentimento. 0. A obtenção de tecido atrial humano Durante os procedimentos de rotina de punção, em pacientes submetidos a cirurgia de coração aberto de circulação extracorpórea, a ponta da aurícula direita é normalmente removida e pode ser usada para o isolamento dos cardiomiócitos atriais. Após a excisão da amostra de tecido é transferido imediatamente para um tubo Falcon de 50 ml estéril com Ca2 + livre transporte solução contendo 2,3-butanodiona monoxime (Tabela I; BDM, inibidor contráctil, impedindo miócitos contracture). Com o tempo de transporte entre 30 e 45 min, que não reconhecemos uma clara vantagem de arrefecimento ou oxigenação em relação ao número e qualidade dos cardiomiócitos atriais isoladas. Nos transportes em geral para o laboratório deve ser tão rápido quanto possível. No entanto, se for mais longo o tempo de transporte não pode ser evitada, o transporte, a 4 ° C em solução oxigenada pode ser vantajosa. 1. Prearrangements <ol><li> Ligue o thermocirculator, que controla a temperatura do recipiente encamisado (Tabela II). Certifique-se de que a temperatura dentro do recipiente é igual a 37 ° C. Cobrir a proveta com uma tampa de vidro para manter uma temperatura constante no interior da taça ao longo de todo o processo de isolamento. </li><li> Pesa-se a colagenase I e protease XXIV em três copos de vidro e armazená-lo a temperatura ambiente. As enzimas serão diluídos imediatamente antes da utilização. </li><li> Loja 20 ml de uma solução de Ca2 + livre numa placa de Petri, a 4 ° C. </li><li>Loja 250 ml de Ca2 + livre em solução num banho de água a 37 ° C. </li></ol> 2. Limpeza do Tecido <ol><li> Transfira a amostra de tecido em conjunto com a solução de transporte numa placa de Petri (~ 10 cm de diâmetro) e remover o tecido adiposo aproximadamente usando uma tesoura. </li><li> Pesa-se a amostra de tecido. Entre 200 e 600 mg são utilizados para isolamento de células. O tecido restante pode ser congelada em azoto líquido para posterior análise bioquímica. </li><li> Transfira a amostra de tecido para a placa de Petri contendo 20 ml de uma solução de Ca2 + livre, a 4 ° C (ver passo 1.3) e cortar a amostra de tecido em pequenos pedaços de aproximadamente 1 mm 3 de tamanho. </li><li> Os passos seguintes devem ser executadas a 37 ° C e sob gaseificação contínua com 100% de O 2. Uma ponta de pipeta pode ser colocado no tubo de oxigénio para evitar a forte ebulição e gerar um fluxo de ar contínuo. </li><li> Transfira os pedaços de tecido juntamente com a solução de 2 Ca + livre emao béquer com camisa e agitou-se cuidadosamente durante cerca de 3 min, com uma barra de agitação magnética. </li><li> Pare de mexer e deixe os pedaços de tecido para se acalmar por alguns segundos. Estirpe cuidadosamente o sobrenadante através de uma malha de nylon (200 um, Tabela II). Retorne os pedaços de tecido contido da malha no copo usando uma pinça. </li><li> Encher o copo com Ca 2 + solução gratuita e repita a etapa de lavagem 2.4 e 2.5, duas vezes. </li></ol> 3. Primeiro digestão enzimática <ol><li> Re-suspender os pedaços de tecidos com 20 ml de solução de enzima E1 (Quadro I) contendo colagenase e protease e agita-se cuidadosamente durante 10 min. </li><li> Adicionar 40 ul de 10 mM de CaCl 2-solução para obter uma concentração final de 20 mM de Ca 2 +. </li><li> Após 35 min coe o sobrenadante cuidadosamente através de uma malha de nylon (200 um, Tabela II) de uma maneira que a maioria dos pedaços de tecido permanecem no copo. Resto retornarchover pedaços de tecido a partir da malha para o copo. </li></ol> 4. Segundo digestão enzimática <ol><li> Ressuspender os pedaços de tecido de novo com 20 ml de solução de enzima E2 colagenase I contendo apenas (Tabela I). Adicionar 40 ul de 10 mM de CaCl 2-solução imediatamente para se obter uma concentração final de 20 mM de Ca 2 +. </li><li> Durante o segundo tesoura para cortar o uso de digestão mais coágulos tecido ocasionalmente. </li><li> Após 5 min tomar uma amostra, utilizando uma pipeta de Pasteur, para procurar a dissociação de células. Repita isso a cada 2-3 min até em forma de bastonete, cardiomiócitos estriados aparecer. </li><li> Pare de mexer e deixe os pedaços de tecido para estabelecer-se para cerca de 20-30 segundos. </li><li> Coe o sobrenadante cuidadosamente através de uma malha de nylon (200 um, Tabela II) num tubo Falcon de 50 ml (um tubo). Retorne os pedaços de tecido contido da malha para o copo. </li><li> Re-suspender os pedaços de tecido no copo com 20 ml storasolução ge (Tabela I) e após 10 dissociar as células por trituração mecânica suave usando uma pipeta de 20 ml serológica com doseador. Tente evitar a formação de bolhas, desde bolhas são prejudiciais para a sobrevivência e qualidade celular. </li><li> Coe o sobrenadante cuidadosamente através de uma malha de nylon (200 mM, Tabela II) em um Falcon 50 ml (tubo B). </li></ol> 5. Preparação final e Ajuste de Final Ca 2 + Concentração <ol><li> Centrifugar os tubos Falcon ambos A e B (ver passo 4.5 e 4.7) a 95 xg durante 10 min. </li><li> Remove-se o sobrenadante de ambos os tubos cuidadosamente por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento. Descartar o sobrenadante. </li><li> Re-suspender em ambos os peletes de 1,5 ml de solução de armazenamento (Tabela I), cada uma (temperatura ambiente). </li><li> Adicione duas vezes 7,5 mL de solução 10 mM CaCl 2 para cada Falcon e mexa com cuidado. Incubar durante 10 minutos depois de cada passo. </li><li>Adicionar 15 ul de solução de CaCl2 10 mM para se obter uma última concentração de Ca2 + de 0,2 mM. </li></ol> 6. O carregamento dos miócitos com o fluorescente de Ca 2 + Fluo-indicador-3 AM (Figura 1) <ol><li> Transferir 1,5 ml de suspensão de células (tubo A e / ou o tubo B) para um tubo de microcentrifugação de 2 ml (tubo Eppendorf). </li><li> Os seguintes passos devem ser executados tendo em consideração a sensibilidade à luz fluorescente do Ca 2 + Indicador de Fluo-3. </li><li> Dissolve-se 50 mg do derivado do éster de acetoximetilo permeável membrana de Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tabela III), em 44 mL do Pluronic F-127 (Tabela III), solução de reserva (20% w / v em DMSO anidro) para obter de 1 mm de Fluo-03:00 solução de stock, o que pode ser armazenada a -20 ° C durante, no máximo, de 1 semana. </li><li> Adicionam-se 15 ul do Fluo-03:00 solução estoque para o tubo de microcentrífuga contendo 1,5 ml de suspensão de células (ver passo 6.1) e agitecuidado. </li><li> Incubar a suspensão de células durante 10 minutos numa caixa opticamente opaca. </li><li> Resumidamente, centrifugar a cerca de 6.000 rpm. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1,5 ml de solução de banho (Tabela IV). </li><li> Deixe a suspensão celular por cerca de 30 min para de-esterificação, antes de iniciar os experimentos. </li></ol> 7. Simultâneas de patch-clamp e epifluorescência Ca 2 + Medições Desde que as medições de patch-clamp não são o principal tema desta revisão, referem-se ao leitor interessado em outras publicações fornecendo uma descrição mais aprofundada desta técnica. 11-14 Por uma questão de exaustividade nós fornecemos um breve resumo de um protocolo para medir potenciais de ação ou L-tipo Ca 2 + correntes, ambos com gravações simultâneas Ca 2 +-transitória. Durante as experiências de miócitos são superfused a 37 ° C com banho de solução quena (Tabela IV), utilizando um sistema de perfusão rápida (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Para as experiências de tensão-grampo, as correntes de K + são bloqueados pela adição de 4-aminopiridina (5 mmol / L) e BaCl 2 (0,1 mmol / L) à solução de banho. Microeléctrodos de vidro de borosilicato e são utilizados devem ter resistências de ponta de 2-5 mohms quando cheio com a solução da pipeta (Tabela V). Além do Fluo-3 AM carregando dos miócitos (ver passo 6), Fluo-3 também está incluído na solução de pipeta (Tabela V). Fluorescência está animado a 488 nm e luz emitida (&lt;520 nm) convertido em [Ca 2 +] i assumindo <img alt="Equação 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> d, em que k = constante de dissociação de Fluo-3 (864 nM), F = fluorescência de Fluo-3,. Fmax = fluorescência de Ca2 +-saturada obtida no final de cada experiência de 12 Ambos os sinais eléctricos e Ca 2 + sinais epifluorescência são gravados simultaneamente. Os potenciais de ação são estimulados a 0,5 Hz no modo atual-clamp usando um ms pulsos de corrente de força limiar 1.2x. Tipo-L de Ca 2 +-correntes são medidas no modo de voltagem-grampo com um potencial de manutenção de -80 mV e 100 mseg de rampa de pulso para -40 mV para inactivar o jejum de Na +-corrente, seguido por uma de 100 mseg ensaio de pulso para 10 mV a 0,5 Hz.

<ol><li>Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+molecular+pathophysiology+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation.</a> J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).</li>
<li>Margaret, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsation%2C+migration+and+division+in+dissociated+chick+embryo+heart+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro.</a> Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).</li>
<li>Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+single+atrial+and+ventricular+cells+from+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+Med.+Assoc.+J%22%5BJournal%5D)">Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart.</a> Can. Med. Assoc. J. 126, 791-793 (1982).</li>
<li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-Protein+%CE%B23-subunit+825T+allele+is+associated+with+enhanced+human+atrial+inward+rectifier+potassium+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">G-Protein β3-subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents.</a> Circulation. 102, 692-697 (2000).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phosphorylation-dependent+regulation+of+constitutively+active+and+muscarinic+receptor-activated+IK%2CACh+channels+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Cardiovasc. Res. 74, 426-437 (2007).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+IK%2CACh+current+may+contribute+to+clinical+efficacy+of+class+I+and+class+III+antiarrhythmic+drugs+in+patients+with+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn.+Schmiedebergs+Arch.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation.</a> Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 381, 251-259 (2010).</li>
<li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G+protein-gated+potassium+current+IK%2CACh+is+constitutively+active+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">The G protein-gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 112, 3697-3706 (2005).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-to-right+atrial+inward+rectifier+potassium+current+gradients+in+patients+with+paroxysmal+versus+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Arrhythm.+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation.</a> Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 3, 472-480 (2010).</li>
<li>Amos, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+outward+currents+of+human+atrial+and+subepicardial+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differences between outward currents of human atrial and subepicardial ventricular myocytes.</a> J. Physiol. 491 (Pt. 1), 31-50 (1996).</li>
<li>Feng, J., Xu, D., Wang, Z., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrarapid+delayed+rectifier+current+inactivation+in+human+atrial+myocytes%3A+properties+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences.</a> Am. J. Physiol. 275, H1717-H1725 (1998).</li>
<li>Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-clamp-based+methods+for+the+detection+of+constitutively+active+acetylcholine-gated+IK%2CACh+channels+in+the+diseased+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated IK,ACh channels in the diseased heart.</a> Methods Enzymol. 484, 653-675 (2010).</li>
<li>Trafford, A. W., Diaz, M. E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca2%2B+buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+content+in+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A novel, rapid and reversible method to measure Ca2+ buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 437, 501-503 (1999).</li>
<li>Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proarrhythmic+atrial+calcium+cycling+in+the+diseased+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 740, 1175-1191 (2012).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+leak+and+increased+Na%2B-Ca2%2B+exchanger+function+underlie+delayed+afterdepolarizations+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 125, 2059-2070 (2012).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+metabolism+of+intact+muscle+cells+isolated+from+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart.</a> Circ Res. 26, 679-687 (1970).</li>
<li>Farmer, B. B., Mancina, M., Williams, E. S., Watanabe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+calcium+tolerant+myocytes+from+adult+rat+hearts%3A+review+of+the+literature+and+description+of+a+method%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description of a method.</a> Life Sci. 33, 1-18 (1983).</li>
<li>Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211, 646-647 (1966).</li>
<li>Bielecki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+changes+in+pH+of+the+perfusion+fluid+on+the+occurrence+of+the+calcium+paradox+in+the+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">The influence of changes in pH of the perfusion fluid on the occurrence of the calcium paradox in the isolated rat heart.</a> Cardiovasc. Res. 3, 268-271 (1969).</li>
<li>Kramer, J. H., Chovan, J. P., Schaffer, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+taurine+on+calcium+paradox+and+ischemic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of taurine on calcium paradox and ischemic heart failure.</a> Am. J. Physiol. 240, H238-H246 (1981).</li>
<li>Rich, T. L., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+depletion+in+rabbit+myocardium.+Calcium+paradox+protection+by+hypothermia+and+cation+substitution%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium depletion in rabbit myocardium. Calcium paradox protection by hypothermia and cation substitution.</a> Circ. Res. 51, 131-141 (1982).</li>
<li>Isenberg, G., Klockner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+tolerant+ventricular+myocytes+prepared+by+preincubation+in+a+%22KB+medium%22%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium".</a> Pflugers Arch. 395, 6-18 (1982).</li>
<li>Diaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+exogenous+calcium+buffers+on+the+systolic+calcium+transient+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes.</a> Biophys. J. 80 (01), 1915-1925 (2001).</li>
<li>Worthington, K., Worthington, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWorthington%2C+K+%22Worthington+Enzyme+Manual%22">Worthington Enzyme Manual</a>. , (1993).</li>
<li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology-specific+effects+of+the+IKur%2FIto%2FIK%2CACh+blocker+AVE0118+on+ion+channels+in+human+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pathology-specific effects of the IKur/Ito/IK,ACh blocker AVE0118 on ion channels in human chronic atrial fibrillation.</a> Br. J. Pharmacol. 154, 1619-1630 (2008).</li>
<li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+downregulation+of+G-protein-coupled+inward+rectifying+K%2B+current+IK%2CACh+in+chronic+human+atrial+fibrillation%3A+decrease+in+GIRK4+mRNA+correlates+with+reduced+IK%2CACh+and+muscarinic+receptor-mediated+shortening+of+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current IK,ACh in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials.</a> Circulation. 104, 2551-2557 (2001).</li>
<li>Hatem, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+compartments+of+sarcoplasmic+reticulum+participate+in+the+excitation-contraction+coupling+process+in+human+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Different compartments of sarcoplasmic reticulum participate in the excitation-contraction coupling process in human atrial myocytes.</a> Circ. Res. 80, 345-353 (1997).</li>
<li>Heidbuchel, H., Vereecke, J., Carmeliet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+different+potassium+channels+in+human+atrium.+Contribution+to+the+basal+potassium+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance.</a> Circ. Res. 66, 1277-1286 (1990).</li>
<li>Hove-Madsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation+is+associated+with+increased+spontaneous+calcium+release+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+human+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes.</a> Circulation. 110, 1358-1363 (2004).</li>
<li>Molina, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+adenosine+monophosphate+phosphodiesterase+type+4+protects+against+atrial+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).</li>
</ol>

Worthington Biochemical Corp apoiaram esta publicação, cobrindo os custos de produção do arquivo de vídeo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Aqui, nós descrevemos um método para o isolamento de miócitos atriais humanos de apêndices atriais direito obtidas de pacientes submetidos a cirurgia de coração aberto. De forma a utilizar estas miócitos para medições de Ca 2 + citosólico que adaptado com um método previamente descrito 4-11 omitindo EGTA a partir da solução de armazenamento. Já em 1970, verificou-se que, embora os miócitos dissociar na presença de Ca2 + durante a digestão, todos eles foram em contractura e não viáveis. 16,17 Assim, o isolamento de células é realizada em solução de Ca2 + livre. Contudo, a re-introdução de concentrações fisiológicas de Ca 2 + resultou numa rápida influxo de Ca2 + e na morte celular. Isto foi descrito como o 2 + Ca paradoxo fenómeno que foi inicialmente observada em corações perfundidos por Zimmerman e Hulsman. 18 modificações dos meios de isolamento, incluindo a redução do pH para 7,0, &lt;sup&gt; 19 20 adição de taurina ou de pequenas quantidades de Ca 2 + (veja passo 3.2 e 4.1), 21, bem como o armazenamento de miócitos isolados em EGTA, contendo solução de armazenagem-22, têm sido sugeridos para impedir o paradoxo de Ca 2 + 17. No entanto, é bem conhecido que o Ca 2 + tamponamento através EGTA reduz a amplitude de tipo-L de Ca 2 + corrente induzida por Ca 2 + amplitudes transientes e resulta numa deterioração bifásica dos transientes de Ca 2 + 23. Portanto, é omitida EGTA ao longo de todo o processo de isolamento, a fim de obter os transientes de Ca 2 + com propriedades típicas e decai monofásicas. Para proteger as células do Ca 2 + paradoxo que aumentou a última concentração de Ca2 + da solução de armazenamento de uma forma gradual até 0,2 mM. A escolha da colagenase é provavelmente o passo mais crítico para o sucesso do isolamento dos miócitos. Coll convencionalagenases são preparações brutas obtidas a partir de Clostridium histolyticum e contêm colagenase, além de uma série de outras proteases, polissacaridases e lipases. Com base nas suas colagenases composição geral são subdivididas em tipos diferentes. Worthington 24 Tipos colagenase I e II têm sido utilizados com sucesso no isolamento de miócitos atriais humanos 4-10,15,25-30. Em nosso protocolo atualmente descrito recomendamos o uso de colagenase O tipo I, apesar de, também foram capazes de obter quantidades aceitáveis ​​de células viáveis ​​utilizando colagenase de Tipo II. No entanto, mesmo dentro de um único tipo de colagenase há uma variação significativa de lote para lote em relação às actividades enzimáticas. Estas variações exigir a selecção cuidadosa e lote de teste de vários lotes para optimizar procedimento de isolamento. A ferramenta disponível batch-seleção on-line a partir de Worthington Biochemical Corp ( <a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / cls / match.php) pode ser usada para encontrar os lotes disponíveis com uma composição que tem sido mostrado para ser adequado para o isolamento de miócitos atriais humanos. Atualmente nós usamos colagenase tipo I com 250 U / mg atividade da colagenase, 345 U / mg atividade caseinase, 2,16 U / mg atividade clostripaína e 0,48 U / mg atividade tríptica (lote # 49H11338). As células obtidas utilizando o processo descrito neste manuscrito podem ser utilizadas dentro de 8 horas para os estudos de patch-clamp, Ca 2 + medições transientes e uma combinação de ambos. 15 Além disso, estas células permitem a medição de contracção celular, em resposta à estimulação do campo eléctrico ou estimulação elétrica usando a pipeta de patch-clamp (observações não publicadas).

Estudar propriedades eletrofisiológicas de canais iônicos cardíacos com a técnica de patch-clamp ea exploração de celular Ca 2 + anormalidades manuseio requer cardiomiócitos isolados. Estes são geralmente obtidos após a exposição in vitro de amostras de tecidos cardíacos de enzimas digestivas (colagenase, hialuronidase, peptidase, etc.) Desde o primeiro relato de isolamento de miócitos cardíacos viáveis ​​em 1955 2 uma grande quantidade de protocolos foi desenvolvido a fim de colher cardiomiócitos atriais e ventriculares individuais a partir de diferentes espécies, incluindo ratinho, rato, coelho, cão, cobaia e humano. Nesta revisão, vamos nos concentrar no isolamento de miócitos atriais humanos. Em relação aos procedimentos para o isolamento de miócitos de outras espécies que se referem ao &quot;Worthington Tissue dissociação guia&quot; fornecido pelo Worthington Biochemical Corp, EUA ( <a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">www.tissuedissociation.com</a> ). et ai. 3 Aqui nós fornecemos uma descrição passo a passo de uma técnica, que é adaptado de um método previamente publicado, a fim de obter miócitos atriais adequadas não só para os experimentos de patch-clamp, mas também para Ca 2 + intracelular medições simultâneas 4-11.

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Solução de transporte&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>&lt;em&gt;Solução de armazenamento&lt;/em&gt;: 1%</td></tr><tr><td>BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31550</td><td>&lt;em&gt;Solução de transporte&lt;/em&gt;: 30</td></tr><tr><td>DL-b-Hidróxi-b-butírico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6501</td><td>&lt;em&gt;Solução de armazenamento&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Solução de transporte&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução livre de Ca2+&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução enzimática E1 e E2&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução de armazenamento&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Ácido L-glutâmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td>&lt;em&gt;Solução de armazenamento&lt;/em&gt;: 70</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Solução de transporte&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução livre de Ca2+&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução enzimática E1 e E2&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução de armazenamento&lt;/em&gt;: 20</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>&lt;em&gt;Solução de transporte&lt;/em&gt;: 1,2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução livre de Ca2+&lt;/em&gt;: 1,2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução enzimática E1 e E2&lt;/em&gt;: 1,2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução de armazenamento&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td>&lt;em&gt;Solução de transporte&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução livre de Ca2+&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução enzimática E1 e E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>&lt;em&gt;Solução de transporte&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução livre de Ca2+&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução enzimática E1 e E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Solução de transporte&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução livre de Ca2+&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução enzimática E1 e E2&lt;/em&gt;: 100</td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86330</td><td>&lt;em&gt;Solução de transporte&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução livre de Ca2+&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução enzimática E1 e E2&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução de armazenamento&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Colagenase I</td><td><a href="http://www.worthington-biochem.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Worthington</a></td><td>4196</td><td>&lt;em&gt;Solução enzimática E1 e E2&lt;/em&gt;: 286 U/mL</td></tr><tr><td>Protease XXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td>&lt;em&gt;Solução enzimática E1 e E2&lt;/em&gt;: 5 U/mL*</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Solução de transporte&lt;/em&gt;: 7,00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução livre de Ca2+&lt;/em&gt;: 7,00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução enzimática E1 e E2&lt;/em&gt;: 7,00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução de armazenamento&lt;/em&gt;: 7,40</td></tr><tr><td>ajustado com</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Solução de transporte&lt;/em&gt;: NaOH 1 M&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução livre de Ca2+&lt;/em&gt;: NaOH 1 M&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução enzimática E1 e E2&lt;/em&gt;: NaOH 1 M&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Solução de armazenamento&lt;/em&gt;: KOH 1 M</td></tr><tr><td colspan="4">Concentrações em mM, salvo indicação em contrário. BDM, monoxima de 2,3-butanodiona. *A Protease XXIV está incluída apenas na solução enzimática E1.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela I. Soluções.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Malha de náilon (200 &amp;#956;m)</td><td>VWR-Alemanha</td><td>510-9527</td><td></td></tr><tr><td>Béquer de reação com jaqueta</td><td>VWR</td><td>KT317000-0050</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela II. Equipamentos específicos.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetil-sulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM (embalagem especial)</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela III. Substâncias para carregamento de miócitos com Fluo-3 AM.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-aminopiridina*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A78403</td><td>&lt;em&gt;Solução de banho&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>BaCl2*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342920</td><td>&lt;em&gt;Solução de banho&lt;/em&gt;: 0,1</td></tr><tr><td>CaCl2 &amp;#215; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>&lt;em&gt;Solução de banho&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Solução de banho&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Solução de banho&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Solução de banho&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>MgCl &amp;#215; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td>&lt;em&gt;Solução de banho&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Solução de banho&lt;/em&gt;: 140</td></tr><tr><td>Probenecida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td>&lt;em&gt;Solução de banho&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Solução de banho&lt;/em&gt;: 7,35</td></tr><tr><td>ajustado com</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Solução de banho&lt;/em&gt;: HCl 1 M</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela IV. Solução de banho para patch-clamp.&lt;/strong&gt; *4-aminopiridina e BaCl foram incluídos apenas para experimentos de clamp de tensão.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sal de potássio do DL-aspartato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2025</td><td>&lt;em&gt;Solução da pipeta&lt;/em&gt;: 92</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>&lt;em&gt;Solução da pipeta&lt;/em&gt;: 0,02</td></tr><tr><td>GTP-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td>&lt;em&gt;Solução da pipeta&lt;/em&gt;: 0,1</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Solução da pipeta&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Solução da pipeta&lt;/em&gt;: 48</td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&lt;em&gt;Solução da pipeta&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>&lt;em&gt;Solução da pipeta&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>Fluo-3**</td><td>Invitrogen</td><td>F3715</td><td>&lt;em&gt;Solução da pipeta&lt;/em&gt;: 0,1</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>7,20</td></tr><tr><td>ajustado com</td><td></td><td></td><td>KOH 1 M</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela V. Solução da pipeta para patch-clamp*. &lt;/strong&gt;*Nos dias experimentais, a solução da pipeta é mantida em gelo até o uso. **Fluo-3 é adicionado a partir de uma solução estoque de 1 mM nos dias experimentais.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de miócitos atriais humanos para medições simultâneas de ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; transitórios e correntes de membrana

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

O estudo das propriedades eletrofisiológicas de canais iônicos cardíacos com a técnica de patch-clamp ea exploração de celular cardíaca Ca 2 + anormalidades manuseio requer cardiomiócitos isolados. Além disso, a possibilidade de investigar miócitos de pacientes que utilizam estas técnicas é um requisito de valor inestimável para elucidar a base molecular das doenças cardíacas, tais como fibrilação atrial (FA). Uma Descrevemos aqui um método para o isolamento de miócitos atriais humanos, que são apropriados tanto estudos de patch-clamp e medições simultâneas de Ca 2 + concentrações intracelulares. Primeiro, apêndices atriais direita obtidas de pacientes submetidos a cirurgia de coração aberto são cortadas em pedaços pequenos de tecido (&quot;método pedaço&quot;) e lavados em solução de Ca 2 +-free. Em seguida, os pedaços de tecido são digeridos em colagenase e protease contendo soluções com 20 mM de Ca 2 +. Posteriormente, os miócitos isolados são harvested por filtração e centrifugação da suspensão de tecido. Finalmente, a concentração de Ca2 + na solução de armazenamento de células é ajustada gradualmente para 0,2 mM. Brevemente discutidos o significado de Ca 2 + e Ca 2 + tamponamento durante o processo de isolamento e também proporcionar gravações representativos de potenciais de acção e as correntes de membrana, juntamente com a simultânea tanto de Ca 2 + medições transientes, realizada nesses miócitos isolados.

Figura 2A mostra três exemplos representativos de miócitos atriais direitos humanos isolados. Para quantificar o rendimento das células que pipetar com 10 ul de suspensão de células (passo 5.5) numa lâmina de microscópio CellFinder ( <a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html</a> ). Colheitas de células em média, na Figura 2B indicam claramente que há uma tendência para os rendimentos mais baixos em células crónica AF (CAF) de amostras do doente (tubo A: 16,5 ± 3,1 células/10 ul (n = 29) versus 5,1 ± 2,3 células/10 ul (n = 10), em SR e CAF, respectivamente, p &lt;0,05; tubo B: 17,9 ± 3,9 células/10 mL (n = 29) versus 5,9 ± 2,0 células/10 mL (n = 9) em SR e CAF, respectivamente, p = 0,107). Os exemplos representativos de acção potenciais medições simultâneas e gravações de Ca 2 + citosólico transientes são apresentados na Figura 3. Em cerca de 90% das células estudadas, tele acção potencial disparado Ca 2 + liberação provoca contrações de células claras e regular. Como relatado anteriormente, o potencial de repouso da membrana, que é um indicador aceite para a integridade das células, em média, cerca de -73,9 ± 2,7 mV (n = 23/10 / miócitos pacientes) e -77,7 ± 1,8 mV (n = 19/8 / miócitos pacientes ) em SR e CAF, respectivamente (p&gt; 0,05). 15 A Figura 4 mostra registos representativos de simultâneas por voltagem tipo-L de Ca 2 + e de correntes de Ca 2 + citosólico transientes. Aplicação da isoprenalina agonista β-adrenérgico não selectivos (1 uM), aumenta as amplitudes de ambos I Ca, L e citosólica de Ca 2 + transientes, sugerindo cascata de transdução de sinal β-adrenérgico intacta. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxograma dos miócitos Fluo-03:00 carregamento protocolo (veja o passo 6,1-6,5). m / v, massa / volume. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> Figura 2. A, miócitos atriais direito humano isolado depois de uma hora em solução de armazenamento. B, média ± SEM de rendimento celular contados em 10 ul de células em solução de armazenamento (ver passo 5.5). n significa o número de preparações em cada grupo. * P &lt;0,05. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> Figura 3. Gravações representativas de ação e potencial acionado Ca 2 + transientes (CAT), em um dos miócitos atrial do ritmo sinusal e um chronic paciente fibrilação atrial. Top: Injetado atual membrana (I M), usado para a estimulação (0,5 Hz). Abaixo: gravação simultânea do potencial de membrana (V M), e gato acionado (baixo). (Traçado de novo com a permissão de Voigt et al. 2.012) 15 <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> Figura 4. Gravações representativos da (1 uM) no efeito isoprenalina tipo L de Ca 2 + desencadeada corrente Ca2 +-transientes (CAT), em um dos miócitos atrial de um ritmo sinusal e um doente de fibrilação atrial crónica. Top: Voltage-clamp protocolo (0,5 Hz). Abaixo: gravação simultânea de membrana líquida total de corrente (I M), reflectindo predominantemente do tipo L Ca 2 + atual (meio) e provocou Gato (baixo). (Traçado de novo com a permissão de Voigt,et ai. de 2012) 15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="Tabela 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> Tabela I. Solutions. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="Tabela 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> Tabela II. Equipamento específico. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="Tabela 3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> Tabela III. Substâncias para o carregamento de miócitos com Fluo-3 AM. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="Tabela 4" fo:content-width = &quot;2.5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot; /&gt; Tabela IV. Solução do banho de patch-clamp. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="Tabela 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> Tabela solução Pipeta V. de patch-clamp *.

Descrevemos o isolamento de miócitos atriais humanos, que podem ser utilizados para a intracelular de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Medidas, em combinação com estudos de patch-clamp eletrofisiológico.

Isolamento de miócitos atriais humanos para Medições Simultâneas de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitórios e correntes de membrana

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar miócitos atriais humanos adequados para medições simultâneas de cálcio, transientes e correntes de membrana. O espécime do átrio direito é obtido de pacientes submetidos a cirurgia cardíaca aberta e é rapidamente transportado para iniciar o procedimento. O primeiro passo do procedimento é limpar o tecido e cortá-lo em pequenos fragmentos.O segundo passo consiste em uma digestão enzimática dupla do tecido com enzimas proteolíticas, resultando em miócitos atriais isolados. O passo final compreende a carga dos miócitos com um corante fluorescente sensível ao cálcio. Em última instância, o uso combinado da microscopia de fluorescência por epiluminescência e da técnica de patch clamp permite registros simultâneos de transientes de cálcio com correntes de membrana ou potenciais de ação.Este método pode ajudar a compreender a base molecular das anormalidades no manuseio celular de cálcio que estão na origem de doenças cardíacas, como a fibrilação atrial, demonstrando o método será Claudia Lira, a técnica sênior do nosso laboratório. O tecido atrial humano obtido de pacientes submetidos a cirurgia cardíaca aberta para revascularização miocárdica ou substituição da válvula mitral deve ser rapidamente transportado para o laboratório em solução de transporte. Uma vez no laboratório, transfira a amostra de tecido e a solução para uma placa de 10 centímetros. Em seguida, remova aproximadamente o tecido adiposo utilizando tesoura.Em seguida, agite a amostra de tecido. Mantenha entre 200 e 600 miligramas para o isolamento celular e congele o restante em nitrogênio líquido para análise bioquímica. Transfira o tecido destinado ao isolamento celular para uma placa com solução fria livre de cálcio e pique o tecido em fragmentos de um milímetro cúbico para lavar o tecido.Transfira-o junto com a solução livre de cálcio para o béquer com jaqueta. Aqueça a 37 graus. Forneça oxigênio a partir de uma linha com ponta de pipeta acoplada para evitar bolhas intensas.Agite cuidadosamente o tecido por cerca de três minutos com um bastão de agitação magnético. Em seguida, deixe o tecido sedimentar. Agora, filtre cuidadosamente o sobrenadante por uma malha de náilon de 200 mícrons.A maior parte do tecido deve permanecer no béquer. Reabasteça o béquer com solução aquecida, livre de cálcio, a 37 graus. Em seguida, retorne os fragmentos de tecido retidos na malha para o béquer usando pinça e repita o procedimento de lavagem duas vezes.Inicie esta etapa do procedimento preparando 20 mililitros da solução enzimática E um aquecida a 37 graus Celsius, contendo colagenase e protease. Filtre cuidadosamente a solução livre de cálcio após a etapa final de lavagem e re-suspenda o tecido lavado na solução E um. Devolva o tecido coletado na malha ao béquer.Agite cuidadosamente a suspensão por 10 minutos. Em seguida, adicione 40 microlitros de cloreto de cálcio 10 milimolar e continue agitando por 35 minutos. A seguir, filtre cuidadosamente o sobrenadante através de uma malha de náilon.A maior parte do tecido deve permanecer no béquer. Prepare 20 mililitros da solução enzimática E dois contendo apenas colagenase um e use-a para reabastecer o béquer. Devolva o tecido coletado na malha para o béquer.Em seguida, adicione imediatamente 40 microlitros de solução de cloreto de cálcio 10 milimolar durante a segunda digestão, utilizando ocasionalmente tesoura para fragmentar coágulos de tecido. Após cinco minutos, retire uma amostra da suspensão para verificar a dissociação das células em microscópio. Continue retirando amostras a cada dois a três minutos até que cardiomiócitos estriados com formato alongado sejam claramente visíveis.Em seguida, interrompa a agitação, permitindo que o tecido sedimente. Após a sedimentação, filtre cuidadosamente o sobrenadante através de uma malha de náilon e recolha em um tubo plástico de 50 mililitros. A seguir, suspenda o tecido em 20 mililitros de solução de armazenamento e devolva os fragmentos de tecido filtrados da malha ao béquer.Dissocie ainda mais as células por meio de agitação mecânica suave. Com uma pipeta de 20 mililitros, tente evitar a formação de bolhas. Em seguida, filtre cuidadosamente o sobrenadante através de uma malha de náilon após a centrifugação de filtração, coletando ambos os sobrenadantes a 90 5G durante 10 minutos.Para pelotizar as células, descarte os sobrenadantes por aspiração sem perturbar o pellet resus. Suspenda cada pellet em 1,5 mililitros de solução de armazenamento à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 7,5 microlitros de solução de cloreto de cálcio 10 milimolar a cada tubo e aguarde 10 minutos.Em seguida, adicione mais 7,5 microlitros de cloreto de cálcio e aguarde mais 10 minutos. Após esse período, adicione um terceiro volume de 15 microlitros de cloreto de cálcio 10 milimolar para elevar a concentração final de cloreto de cálcio na solução a 0,2 milimolar. O objetivo deste isolamento é obter células adequadas para medições intracelulares de cálcio.Portanto, é um requisito crítico omitir quaisquer tampões de cálcio, como EGTA, da solução de armazenamento. Transfira 1,5 mililitro da suspensão celular para um tubo microcentrífugo de dois mililitros. Os seguintes passos devem ser executados considerando a sensibilidade à luz do indicador fluorescente de cálcio.Flu O três. Primeiro, prepare uma solução estoque de um milimolar de flu O 3. Essa solução pode ser armazenada a menos 20 graus Celsius por até uma semana.Em seguida, adicione 15 microlitros da solução estoque de flu oh 3:00 AM à suspensão celular de 1,5 mililitro. Agite a mistura cuidadosamente e incube a suspensão por 10 minutos à temperatura ambiente em uma caixa opaca. Após a incubação, centrifugue brevemente o tecido a aproximadamente 6.000 RPM.Em seguida, despreze o sobrenatante e ressuspenda o pellet em 1,5 mililitros de solução de banho. Deixe a suspensão celular por cerca de 30 minutos para desesterificação antes de iniciar os experimentos. Em seguida, prossiga com o registro simultâneo por patch clamp e medidas de cálcio fluorescentes por epifluorescência usando o protocolo descrito.Os miócitos foram isolados de tecido atrial e quantificados em uma lâmina de microscópio com contador de células. Os rendimentos médios de células indicam claramente uma tendência de menores rendimentos em amostras de pacientes com fibrilação atrial crônica. Miócitos carregados com fluo-3 foram estimulados a 0,5 hertz na configuração de fixação de corrente para provocar potenciais de ação; cerca de 90% das células analisadas apresentaram contrações regulares.Em resposta a essa estimulação, a comutação para microscopia de fluorescência permite visualizar a liberação de cálcio desencadeada pelo potencial de ação do retículo sarcoplasmático, o que inicia a contração celular. Gravações representativas de pacientes com ritmo sinusal e fibrilação atrial mostram que os potenciais de ação dos pacientes geralmente apresentam formato de pico e cúpula, enquanto a triangulação e o encurtamento do potencial de ação são características típicas da remodelação atrial.Em pacientes com fibrilação atrial, os transientes intracelulares de cálcio registrados simultaneamente revelaram níveis diastólicos aumentados de cálcio e amplitude reduzida dos transientes de cálcio em miócitos de pacientes com fibrilação atrial para o registro de correntes de cálcio do tipo L. As correntes de potássio foram bloqueadas usando tetraaminopiridina e cloreto de bário. As células foram estimuladas a 0,5 hertz na configuração de fixação de voltagem, utilizando um potencial de retenção de menos 80 milivolts, com uma rampa de 100 milissegundos até menos 40 milivolts e um pulso de teste de 100 milissegundos até 10 milivolts.Gravações representativas mostram que a fibrilação atrial está associada a uma corrente reduzida de cálcio do tipo L. Novamente, o nível diastólico de cálcio estava aumentado, enquanto a amplitude do transiente de cálcio era menor. Na fibrilação atrial.A aplicação do agonista não seletivo de receptores adrenérgicos beta, isopreno, aumentou as amplitudes das correntes de cálcio do tipo L e dos transientes de cálcio citosólico. Em ambos os grupos, isso sugere que as células possuem uma cascata de transdução de sinal adrenérgica beta intacta. Os resultados mostram que este método fornece miócitos de alta qualidade tolerantes ao cálcio, adequados para medidas simultâneas de patch clamp e transientes de cálcio.Além disso, os miócitos obtidos podem ser úteis para medições de encurtamento celular, coloração imunológica ou coloração de TTU.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kv canal disfunção está associada a arritmias cardíacas. Para estudar os mecanismos moleculares que conduzem à ocorrência de arritmias tais que utilizam um protocolo sistemático para o isolamento dos cardiomiócitos atriais e ventriculares do canal Kv auxiliares ratinhos knockout de subunidade. Cardiomiócitos isolados podem então ser imediatamente utilizados para celulares estudos eletrofisiológicos, bioquímicos ou imunofluorescência (IF) ensaios.

Isolamento e gravações de canais Kv em Murino cardiomiócitos atriais e ventriculares

O conhecimento atual sobre a base celular de doenças cardíacas se baseia principalmente em estudos em modelos animais. Aqui nós descrevemos e validar um novo método para obter simples cardiomiócitos viáveis ​​a partir de pequenas amostras cirúrgicas do miocárdio ventricular humano. Miócitos ventriculares humanos podem ser usados ​​para estudos eletrofisiológicos e testes de drogas.

Isolamento e caracterização funcional de Ventricular Humano cardiomiócitos a partir de amostras cirúrgicas frescos

Métodos são demonstradas para o isolamento de miócitos do nó sinoatrial (SAM) a partir de ratinhos adultos por patch-clamp electrofisiologia ou imagiologia estudos. As células isoladas podem ser utilizadas directamente ou podem ser mantidas em cultura que permita a expressão de proteínas de interesse, tais como repórteres geneticamente codificados.

Métodos para o isolamento, Cultura e caracterização funcional de SINOATRIAL Nó miócitos de ratos adultos

Este protocolo descreve a avaliação eletrofisiológica dos átrios murino utilizando um sistema óptico de mapeamento com alta resolução temporal e espacial, incluindo gravações duas da tensão da membrana e Ca2 + transitória sob programado estimulação através de um cateter eletrodo especializados.

Avaliação eletrofisiológica de murino átrios com mapeamento óptico de alta resolução

Aqui, descrevemos um procedimento otimizado, Langendorff-baseado para o isolamento de célula única cardiomyocytes atrial de um modelo do rato de metabólica relacionadas com síndrome de insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada. Uma regulação manual da pressão intraluminal de cavidades cardíacas é implementada para render funcionalmente intactos miócitos apropriados para estudos de acoplamento excitação-contração.

Isolamento dos Cardiomyocytes Atrial de um modelo do rato de metabólicas relacionadas com síndrome de insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada

Este protocolo é usado para isolar cardiomiócitos atriais únicos do coração do rato adulto usando uma abordagem de digestão do pedaço. Esta aproximação é usada para isolar os miócitos atrial direito ou esquerdos que podem ser usados para caracterizar a electrofisiologia atrial do miócitos em estudos da remendo-braçadeira.

Isolamento de miócitos atriais de camundongos adultos

Apresentado é um protocolo para o isolamento de cardiomiócitos ventriculares humanos e animais de fatias miocárrias cortadas por vibratome. Altos rendimentos de células tolerantes ao cálcio (até 200 células/mg) podem ser obtidos a partir de pequenas quantidades de tecido (&lt;50 mgs). O protocolo é aplicável ao miocárdio exposto à isquemia fria por até 36 h.

Isolamento de Cardiomiócitos Ventriculares Humanos de fatias de miocárdio cortadas por vibratome

Um método é descrito para o isolamento simultâneo de miócitos e não miócitos tanto da atria quanto dos ventrículos de um único coração de rato adulto. Este protocolo resulta em rendimentos consistentes de miócitos cardíacos altamente viáveis e não miócitos e detalha condições ideais de cultura específica celular para fenotipagem e análise in vitro.

Isolamento simultâneo e cultura de miócitos atrial, miócitos ventriculares e não-miócitos de um coração de rato adulto

Modelos murinos permitem estudar os principais mecanismos da arritmogênese. Para isso, cardiomiócitos de alta qualidade são necessários para a realização de medidas de patch-clamp. Aqui, é descrito um método para isolar miócitos murinos atriais e ventriculares via perfusão retrógrada de Langendorff baseada em enzimas, que permite medidas simultâneas de transientes de cálcio e corrente de cálcio tipo L.

Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

Este protocolo descreve modificações do método Langendorff, incluindo a profundidade da cannulação de aorta para isolamento simultâneo de miócitos atrial e ventricular de camundongos adultos.

Modificações do Método Langendorff para Isolamento Simultâneo de Miócitos Atrial e Ventricular de Camundongos Adultos

Aprenda a isolar miócitos atriais humanos para medições simultâneas de Ca²⁺ e correntes de membrana. Este método utiliza digestão enzimática e patch clamp para estudar fisiologia cardíaca e doenças como fibrilação atrial.

Isolamento de miócitos atriais humanos para Medições Simultâneas de Ca

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