Isolamento de miócitos atriais humanos para Medições Simultâneas de Ca

O objetivo geral deste procedimento é isolar miócitos atriais humanos adequados para medições simultâneas de cálcio, transientes e correntes de membrana. O espécime do átrio direito é obtido de pacientes submetidos a cirurgia cardíaca aberta e é rapidamente transportado para iniciar o procedimento. O primeiro passo do procedimento é limpar o tecido e cortá-lo em pequenos fragmentos.

O segundo passo consiste em uma digestão enzimática dupla do tecido com enzimas proteolíticas, resultando em miócitos atriais isolados. O passo final compreende a carga dos miócitos com um corante fluorescente sensível ao cálcio. Em última instância, o uso combinado da microscopia de fluorescência por epiluminescência e da técnica de patch clamp permite registros simultâneos de transientes de cálcio com correntes de membrana ou potenciais de ação.

Este método pode ajudar a compreender a base molecular das anormalidades no manuseio celular de cálcio que estão na origem de doenças cardíacas, como a fibrilação atrial, demonstrando o método será Claudia Lira, a técnica sênior do nosso laboratório. O tecido atrial humano obtido de pacientes submetidos a cirurgia cardíaca aberta para revascularização miocárdica ou substituição da válvula mitral deve ser rapidamente transportado para o laboratório em solução de transporte. Uma vez no laboratório, transfira a amostra de tecido e a solução para uma placa de 10 centímetros. Em seguida, remova aproximadamente o tecido adiposo utilizando tesoura.

Em seguida, agite a amostra de tecido. Mantenha entre 200 e 600 miligramas para o isolamento celular e congele o restante em nitrogênio líquido para análise bioquímica. Transfira o tecido destinado ao isolamento celular para uma placa com solução fria livre de cálcio e pique o tecido em fragmentos de um milímetro cúbico para lavar o tecido.

Transfira-o junto com a solução livre de cálcio para o béquer com jaqueta. Aqueça a 37 graus. Forneça oxigênio a partir de uma linha com ponta de pipeta acoplada para evitar bolhas intensas.

Agite cuidadosamente o tecido por cerca de três minutos com um bastão de agitação magnético. Em seguida, deixe o tecido sedimentar. Agora, filtre cuidadosamente o sobrenadante por uma malha de náilon de 200 mícrons.

A maior parte do tecido deve permanecer no béquer. Reabasteça o béquer com solução aquecida, livre de cálcio, a 37 graus. Em seguida, retorne os fragmentos de tecido retidos na malha para o béquer usando pinça e repita o procedimento de lavagem duas vezes.

Inicie esta etapa do procedimento preparando 20 mililitros da solução enzimática E um aquecida a 37 graus Celsius, contendo colagenase e protease. Filtre cuidadosamente a solução livre de cálcio após a etapa final de lavagem e re-suspenda o tecido lavado na solução E um. Devolva o tecido coletado na malha ao béquer.

Agite cuidadosamente a suspensão por 10 minutos. Em seguida, adicione 40 microlitros de cloreto de cálcio 10 milimolar e continue agitando por 35 minutos. A seguir, filtre cuidadosamente o sobrenadante através de uma malha de náilon.

A maior parte do tecido deve permanecer no béquer. Prepare 20 mililitros da solução enzimática E dois contendo apenas colagenase um e use-a para reabastecer o béquer. Devolva o tecido coletado na malha para o béquer.

Em seguida, adicione imediatamente 40 microlitros de solução de cloreto de cálcio 10 milimolar durante a segunda digestão, utilizando ocasionalmente tesoura para fragmentar coágulos de tecido. Após cinco minutos, retire uma amostra da suspensão para verificar a dissociação das células em microscópio. Continue retirando amostras a cada dois a três minutos até que cardiomiócitos estriados com formato alongado sejam claramente visíveis.

Em seguida, interrompa a agitação, permitindo que o tecido sedimente. Após a sedimentação, filtre cuidadosamente o sobrenadante através de uma malha de náilon e recolha em um tubo plástico de 50 mililitros. A seguir, suspenda o tecido em 20 mililitros de solução de armazenamento e devolva os fragmentos de tecido filtrados da malha ao béquer.

Dissocie ainda mais as células por meio de agitação mecânica suave. Com uma pipeta de 20 mililitros, tente evitar a formação de bolhas. Em seguida, filtre cuidadosamente o sobrenadante através de uma malha de náilon após a centrifugação de filtração, coletando ambos os sobrenadantes a 90 5G durante 10 minutos.

Para pelotizar as células, descarte os sobrenadantes por aspiração sem perturbar o pellet resus. Suspenda cada pellet em 1,5 mililitros de solução de armazenamento à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 7,5 microlitros de solução de cloreto de cálcio 10 milimolar a cada tubo e aguarde 10 minutos.

Em seguida, adicione mais 7,5 microlitros de cloreto de cálcio e aguarde mais 10 minutos. Após esse período, adicione um terceiro volume de 15 microlitros de cloreto de cálcio 10 milimolar para elevar a concentração final de cloreto de cálcio na solução a 0,2 milimolar. O objetivo deste isolamento é obter células adequadas para medições intracelulares de cálcio.

Portanto, é um requisito crítico omitir quaisquer tampões de cálcio, como EGTA, da solução de armazenamento. Transfira 1,5 mililitro da suspensão celular para um tubo microcentrífugo de dois mililitros. Os seguintes passos devem ser executados considerando a sensibilidade à luz do indicador fluorescente de cálcio.

Flu O três. Primeiro, prepare uma solução estoque de um milimolar de flu O 3. Essa solução pode ser armazenada a menos 20 graus Celsius por até uma semana.

Em seguida, adicione 15 microlitros da solução estoque de flu oh 3:00 AM à suspensão celular de 1,5 mililitro. Agite a mistura cuidadosamente e incube a suspensão por 10 minutos à temperatura ambiente em uma caixa opaca. Após a incubação, centrifugue brevemente o tecido a aproximadamente 6.000 RPM.

Em seguida, despreze o sobrenatante e ressuspenda o pellet em 1,5 mililitros de solução de banho. Deixe a suspensão celular por cerca de 30 minutos para desesterificação antes de iniciar os experimentos. Em seguida, prossiga com o registro simultâneo por patch clamp e medidas de cálcio fluorescentes por epifluorescência usando o protocolo descrito.

Os miócitos foram isolados de tecido atrial e quantificados em uma lâmina de microscópio com contador de células. Os rendimentos médios de células indicam claramente uma tendência de menores rendimentos em amostras de pacientes com fibrilação atrial crônica. Miócitos carregados com fluo-3 foram estimulados a 0,5 hertz na configuração de fixação de corrente para provocar potenciais de ação; cerca de 90% das células analisadas apresentaram contrações regulares.

Em resposta a essa estimulação, a comutação para microscopia de fluorescência permite visualizar a liberação de cálcio desencadeada pelo potencial de ação do retículo sarcoplasmático, o que inicia a contração celular. Gravações representativas de pacientes com ritmo sinusal e fibrilação atrial mostram que os potenciais de ação dos pacientes geralmente apresentam formato de pico e cúpula, enquanto a triangulação e o encurtamento do potencial de ação são características típicas da remodelação atrial.

Em pacientes com fibrilação atrial, os transientes intracelulares de cálcio registrados simultaneamente revelaram níveis diastólicos aumentados de cálcio e amplitude reduzida dos transientes de cálcio em miócitos de pacientes com fibrilação atrial para o registro de correntes de cálcio do tipo L. As correntes de potássio foram bloqueadas usando tetraaminopiridina e cloreto de bário. As células foram estimuladas a 0,5 hertz na configuração de fixação de voltagem, utilizando um potencial de retenção de menos 80 milivolts, com uma rampa de 100 milissegundos até menos 40 milivolts e um pulso de teste de 100 milissegundos até 10 milivolts.

Gravações representativas mostram que a fibrilação atrial está associada a uma corrente reduzida de cálcio do tipo L. Novamente, o nível diastólico de cálcio estava aumentado, enquanto a amplitude do transiente de cálcio era menor. Na fibrilação atrial.

A aplicação do agonista não seletivo de receptores adrenérgicos beta, isopreno, aumentou as amplitudes das correntes de cálcio do tipo L e dos transientes de cálcio citosólico. Em ambos os grupos, isso sugere que as células possuem uma cascata de transdução de sinal adrenérgica beta intacta. Os resultados mostram que este método fornece miócitos de alta qualidade tolerantes ao cálcio, adequados para medidas simultâneas de patch clamp e transientes de cálcio.

Além disso, os miócitos obtidos podem ser úteis para medições de encurtamento celular, coloração imunológica ou coloração de TTU.