Análise do Ciclo de células vivas de

O objetivo geral deste procedimento é medir a fase relativa do ciclo celular e o tamanho celular de tecidos com populações de células geneticamente manipuladas e marcadas com GFP ou RFP em Drosophila. Primeiro, configure cruzamentos genéticos para gerar progênie contendo células marcadas com as proteínas fluorescentes desejadas e com as manipulações genéticas desejadas em um tecido ou população específica de células. Em estudo, isole de forma limpa o tecido desejado da progênie do estágio de desenvolvimento adequado, depois dissocie o tecido em uma única suspensão celular e comente com um corante de DNA viável para medir o conteúdo de DNA.

Analisar as amostras dissociadas coradas por citometria de fluxo. Em última análise, os resultados in vivo medem as mudanças no tamanho da célula e na fase do ciclo celular causadas pelas manipulações genéticas em estudo. A principal vantagem desta técnica sobre o método existente de citometria de fluxo em tecidos vivos de drosófila usando corantes ultravioleta é que o corante violeta do ciclo do corante é compatível com citômetros de bancada mais baratos contendo um laser violeta 4 0 5, que pode ser adquirido com um orçamento pequeno e mantido em uma única escala de laboratório.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do ciclo celular, fornecendo informações sobre a fase do ciclo celular e o tamanho da célula que são mais detalhadas do que apenas medir o tamanho geral do tecido e a taxa de proliferação. Demonstrando o procedimento estarão Kagel e Dan Sun, alunos de pós-graduação do meu laboratório e Olga Guko. Nosso técnico coleta larvas maduras no terceiro ínstar larval cerca de 110 a 120 horas após a postura dos ovos para as dissecações das larvas.

O estadiamento preciso da pupila é essencial para estudos durante a metamorfose para esta colheita pré-pupa branca no início da metamorfose, se necessário, eu mesa selou placa de Petri de pupi ou um frasco de larvas em banho-maria de 37 graus Celsius Para ativar o calor. Base flip de mandril para clones de rastreamento de linhagem. Depois de abrir a placa de Petri, coloque-a em uma incubadora para envelhecer até o estágio de desenvolvimento desejado para a dissecção da pupila.

Segure suavemente uma pupa pela ponta anterior da caixa da pupila, onde há uma bolha de ar, para evitar danificar a pupa dentro, posicione a pupa flutuante para agarrar adequadamente. Em seguida, com uma microtesoura, corte a ponta posterior da pupa em um pequeno ângulo em direção à parte dorsal do animal para liberar a pressão interna sem forçar a gordura hist nos tecidos desejados no tórax e na cabeça, corte cuidadosamente ao longo da mediana dorsal, evitando danificar as asas e o complexo cerebral do olho anterior para remover sua gordura. Em seguida, remova a pupila do estojo da pupila segurando a borda posterior da epiderme da pupila com uma pinça e puxando-a para fora do estojo da pupila.

Transfira a pupa dissecada para uma placa de dissecação limpa. Faça um pequeno orifício na cutícula anterior ao complexo cerebral do olho com uma pinça. Usando uma pipeta de pasti de vidro com um bulbo de borracha.

Lave suavemente a solução de dissecção PBS através da pupa parcialmente dissecada para remover qualquer gordura restante e tecido intestinal. Para obter as asas da pupila, segure a pupa pela cabeça com uma pinça usando uma segunda pinça. Segure a ponta mais posterior da cutícula da asa, puxe-a e desaloje-a do lado da carcaça.

Em seguida, corte ou puxe a asa na dobradiça para removê-la do corpo e coloque-a em uma pilha longe das carcaças e outros materiais para obter os olhos da pupila ou o cérebro. Lave a pupa até que o complexo olho-cérebro se desloque e se solte da pupa. Usando uma pinça, puxe suavemente o olho da pupila para longe do cérebro e salve o tecido desejado Usando uma pipeta lubrificada, transfira cuidadosamente os tecidos dissecados.

Incube os tubos com agitação a 23 graus Celsius a 500 RPM por 70 minutos. Em seguida, vórtice suavemente por cinco segundos a uma velocidade média e retorne as amostras ao agitador por mais 15 a 20 minutos. O vórtice coleta amostras mais uma vez por cinco segundos em velocidade média para cérebros e olhos da pupila.

Mais de 36 horas. Um PF dissocia os tecidos em solução de coloração de DNA a 23 graus Celsius a 500 RPM por 45 a 60 minutos. Em seguida, um por um, dissocie manualmente grandes pedaços de tecido, transferindo-os para uma placa de dissecação junto com cerca de 50 microlitros de solução de coloração de DNA.

Pipete rapidamente para cima e para baixo com uma pipeta passada manualmente com uma abertura de aproximadamente 100 a 150 micrômetros. Agrupar os espécimes dissociados num tubo de cinco mililitros. Incube por mais 30 minutos a 23 graus Celsius com agitação a 500 RPM.

Verifique visualmente se as amostras estão totalmente dissociadas. Ciente de que a cutícula transparente acelular da asa da pupila não se associará. Comece a análise por fax carregando a amostra no citômetro.

Em seguida, selecione os canais para detectar a dispersão direta e lateral, indicando o tamanho da célula e a complexidade da membrana. Para detectar a coloração violeta do ciclo D do DNA, você precisará medir VL uma altura, largura e área da excitação do laser violeta. Selecione também a área do canal de laser azul uma para medir a fluorescência GFP.

Para análise de RFP, usamos o canal de laser azul três. Esse canal na sintonia é otimizado para detecção de RFP. Defina as portas para restringir a análise à população selecionada e limitar os detritos e vender aglomerados da análise que gera gráficos de parada com a porta um, excluir detritos e aglomerados no gráfico de SSC versus FSC no gráfico de VL uma área versus VL um com uso GA dois para excluir células não coradas sub G uma células apoptóticas e aglomerados de células com base na identificação de singletos.

GA três engloba células dentro das portas um e dois que são GFP negativas no gráfico de fluorescência versus conteúdo de DNA com base em VE L uma altura. A próxima marcha quatro engloba células dentro das portas um e dois que são GFP positivas no gráfico de fluorescência versus conteúdo de DNA. Também é possível gerar as portas cinco e seis a partir de gráficos de pontos do tamanho da célula, medido por GFP versus dispersão direta.

Para examinar a fase do ciclo celular, use os dois histogramas que traçam o conteúdo de DNA no eixo x e a contagem de células no Y ais para as populações definidas pela porta três e porta quatro. Para o tamanho da célula, os histogramas definem as populações para as portas cinco e seis e plotam o FSC no eixo x e as contagens no eixo Y quando as amostras em execução definem a gravação para parar em 10.000. Os eventos positivos da GFP também definem o volume de aquisição de 300 microlitros.

As configurações apropriadas de limite e tensão estão contidas nos modelos fornecidos. Execute as amostras com sensibilidade padrão ou alta de 100 microlitros por minuto e registre. Os arquivos de dados gravados gerados pelo software Attune estão no formato FCS, que é compatível com a maioria dos softwares de modelagem de ciclo celular.

Este espaço de trabalho representativo contendo quatro gráficos de pontos e dois histogramas mostra uma amostra de asa de larva expressando GFP e Ciclina D na asa posterior, impulsionada por um transgene Grailed gal four. O primeiro gráfico de pontos do tamanho da célula com marcha um exclui detritos e aglomerados. O segundo gráfico de pontos discrimina singlets com marcha dois para excluir células não coradas sub G 1D NA conteúdo e aglomerados no gráfico de GFP versus conteúdo de DNA.

As células GFP negativas e positivas podem ser distinguidas e o conteúdo de dois N e quatro NDNA é evidente com base na posição ao longo do eixo x. Este gráfico de tamanho da célula medido por GFP versus dispersão direta é usado para gerar as portas cinco e seis. As análises resultantes levam a histogramas de conteúdo de DNA versus contagens para a população negativa para GFP ou RFP, bem como células positivas para GFP ou RFP.

Usando o modelo de RFP fornecido. Resultados semelhantes são obtidos com o mesmo tipo de tecido e padrão de expressão. Para RFP, os modelos e voltagens fornecidos são adequados para análise de olhos, cérebros e asas larvais, bem como olhos, cérebros e asas da pupila.

No software sintonizado. O uso do recurso de dimensionamento automático para o ciclo celular ou histogramas de tamanho de célula permite a determinação do máximo global para cada população. Esses perfis do ciclo celular representam células positivas e negativas para GFP em olhos de larvas que expressam GFP na parte posterior.

Usando os quatro transgenes U-A-S-G-F-P do GMR GAL, a sobreposição revela as diferenças na fase do ciclo celular das células que expressam GFP posterior. A mudança relativa no tamanho da célula entre células GFP positivas e negativas também pode ser plotada. Este perfil do ciclo celular foi derivado do cérebro da pupila em 46 horas A PF. As células GFP positivas são clones de rastreamento de linhagem que expressam o regulador G one S, ciclina D e E two F, que interrompem a quiescência e levam à entrada na fase S.

Isso contrasta com as células negativas para GFP que não expressam, que nesta fase são normalmente interrompidas. Em G um, o software de sintonia gera regiões definidas pelo usuário nos histogramas, delineando G um s e G duas fases. Uma tabela de estatísticas para cada execução determina as contagens absolutas de células dentro das regiões e porcentagens definidas pelo usuário.

Alternativamente, um software de modelagem como o mod fit pode ser usado para estimar porcentagens em cada fase, bem como células apoptóticas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e rotular vários tecidos de Drosophila para análise do ciclo celular.