Introdução ao Leitor de Microplacas
O leitor de microplacões é um instrumento multimodal que permite que uma variedade de experimentos sejam realizados e medidos simultaneamente. Os leit…
O leitor de microplaca é um instrumento amplamente utilizado que permite que muitas amostras sejam medidas simultaneamente, como se muitos experimentos minúsculos estivessem sendo realizados ao mesmo tempo.
Este aparelho é usado em conjunto com placas multiwell, como a placa 96 bem.
Independentemente do tipo de experimento executado com o leitor de microplacões, as curvas padrão são frequentemente usadas para determinar o valor das amostras experimentais, bem como controles positivos e negativos.
Os leitores de microplacar vêm em diferentes formas, tamanhos e configurações. Muitos leitores de microplapes têm capacidades multimodais permitindo que muitos ensaios diferentes sejam realizados. Essas modalidades incluem a capacidade de realizar diferentes tipos de medições, como absorção, medidas fluorescentes e luminescentes.
As placas multiwell são componentes integrais do leitor de microplacas e são usadas para conter as amostras que são medidas pela máquina. Essas placas podem ter tamanhos diferentes, ter diferentes tipos de fundos de poços e diferentes números de poços. O tipo de placa utilizada depende do ensaio.
A bandeja de carregamento é usada para trazer a placa de 96 poços para dentro da máquina.
Uma interface de computador é normalmente usada para operar o leitor de placas e controlar suas configurações e parâmetros, como o comprimento de onda e o modo. O software do leitor de placas tem uma interface gráfica de usuário da placa que permite selecionar quais poços são carregados com amostras.
Pipetas multicanais são frequentemente usadas para carregar placas multi-poços. Os reservatórios possuem as soluções para a pipeta multicanal.
Poços às vezes podem ser carregados usando uma pipeta padrão de canal único.
As amostras e as normas são carregadas em duplicata ou triplicada para responder por quaisquer erros de pipetação. Aqui você vê uma placa carregada em triplicado.
A curva padrão utiliza amostras com concentrações conhecidas, que produzem diferentes valores de absorção. Esses dados são então usados para criar um gráfico onde uma linha de melhor ajuste é gerada.
O espaço em branco é usado para determinar a extensão da sua medição que não é experimentalmente relevante e é devido aos buffers em que sua amostra é diluída ou reagentes aos quais sua amostra é exposta. Os valores obtidos a partir dessas medidas são chamados de "fundo". O branco não contém nenhuma amostra.
O controle positivo indica se o ensaio funcionou corretamente ou não. Dá um bom resultado. O controle negativo é uma variável de controle onde não se espera que não seja observado nenhum efeito/medição. Não deve dar nenhum resultado..
Uma vez que a placa está configurada, é hora de carregar as amostras. Para evitar medir as amostras erradas ou carregar a placa da maneira errada, é fundamental orientar a placa corretamente na bandeja de carregamento. Lembre-se de ter cuidado ao carregar amostras na bandeja, para não forçar a bandeja para dentro do instrumento ou capturar as extremidades dentro do instrumento.
Uma vez que a bandeja esteja carregada, parâmetros como o modo, comprimento de onda e ordem de carregamento de poços são definidos no software antes que a placa seja lida.
Depois que os parâmetros são definidos, a placa é lida, e o leitor gera uma leitura dos valores dentro do software.
Uma vez que a placa seja lida, use o valor médio das amostras em branco para subtrair o fundo de todas as amostras, incluindo a curva padrão.
Após a leitura, os valores de concentração conhecidos para as normas são traçados em relação aos seus respectivos valores medidos, absorção neste caso.
Quando os valores foram plotados, a linha de melhor ajuste pode ser calculada usando uma regressão linear. Isso pode ser facilmente feito usando um programa de planilha.
O coeficiente de determinação, uma medida estatística de quão bem a linha prevê pontos de dados reais, deve estar entre 0,90-0,99, sendo 0,99 considerado o melhor valor e significa que a linha se encaixa perfeitamente nos dados.
Usando a linha de melhor ajuste, podemos calcular os valores de concentração de amostras experimentais ou controles em cada poço, conectando o valor de absorção para Y e, em seguida, resolvendo a equação para X. Valores de concentração também podem ser estimados desenhando uma linha do valor de absorção no eixo Y para a linha de ajuste melhor e, em seguida, até o eixo X.
Muitos tipos de leitores de microplacãs medem a absorção, que é definida como a razão logarítmica da luz caindo sobre um objeto à luz transmitida através de um objeto.
O ensaio de Bradford é um exemplo de um ensaio de leitor de microplacência à base de absorvência, onde amostras de proteína são adicionadas à placa com o reagente "Bradford". Este composto se liga às proteínas da amostra, e causa uma mudança em sua absorção.
Em ensaios baseados em fluorescentes, um fluorocromo é ativado por um certo comprimento de onda de luz e, por sua vez, causa excitação do fluorocromo, que emite luz em um comprimento de onda diferente.
Ao trabalhar com reagentes sensíveis à luz, certifique-se de mantê-los cobertos para evitar fotobleaching e arruinar o experimento.
Ensaios luminescentes emitem luz através de uma reação química e muitas vezes usam luciferase. A luciferase vem de várias fontes, como vagalumes. Em uma reação de luciferase, a luz é emitida quando a luciferase encontra oxigênio, ATP e magnésio em uma série de reações.
Ensaios luminescentes têm muitas aplicações diferentes. Um exemplo dessa aplicação é medir a produção e detecção de espécies reativas de oxigênio em cânceres.
Outros aplicativos, que usam leitores de microplatos, incluem ensaios de alta produtividade usando 384 e 1536 poços. Nestes ensaios, as placas são carregadas por um robô. Não, não esse tipo de robô. Um robô programável que automatiza o manuseio de amostras extremamente preciso.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE ao leitor de microplatos. Neste vídeo, mostramos o que é um leitor de microlatos(A), como ele é usado(B), como operar este instrumento(C), como interpretar dados do leitor de microplatos e alguns aplicativos usando um leitor de microplato(D). Obrigado por assistir.
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O leitor de microplaca é um instrumento amplamente utilizado que permite que muitas amostras sejam medidas simultaneamente, como se muitos experimentos minúsculos estivessem sendo realizados ao mesmo tempo.
Este aparelho é usado em conjunto com placas multiwell, como a placa 96 bem.
Independentemente do tipo de experimento executado com o leitor de microplacões, as curvas padrão são frequentemente usadas para determinar o valor das amostras experimentais, bem como controles positivos e negativos.
Os leitores de microplacar vêm em diferentes formas, tamanhos e configurações. Muitos leitores de microplapes têm capacidades multimodais permitindo que muitos ensaios diferentes sejam realizados. Essas modalidades incluem a capacidade de realizar diferentes tipos de medições, como absorção, medidas fluorescentes e luminescentes.
As placas multiwell são componentes integrais do leitor de microplacas e são usadas para conter as amostras que são medidas pela máquina. Essas placas podem ter tamanhos diferentes, ter diferentes tipos de fundos de poços e diferentes números de poços. O tipo de placa utilizada depende do ensaio.
A bandeja de carregamento é usada para trazer a placa de 96 poços para dentro da máquina.
Uma interface de computador é normalmente usada para operar o leitor de placas e controlar suas configurações e parâmetros, como o comprimento de onda e o modo. O software do leitor de placas tem uma interface gráfica de usuário da placa que permite selecionar quais poços são carregados com amostras.
Pipetas multicanais são frequentemente usadas para carregar placas multi-poços. Os reservatórios possuem as soluções para a pipeta multicanal.
Poços às vezes podem ser carregados usando uma pipeta padrão de canal único.
As amostras e as normas são carregadas em duplicata ou triplicada para responder por quaisquer erros de pipetação. Aqui você vê uma placa carregada em triplicado.
A curva padrão utiliza amostras com concentrações conhecidas, que produzem diferentes valores de absorção. Esses dados são então usados para criar um gráfico onde uma linha de melhor ajuste é gerada.
O espaço em branco é usado para determinar a extensão da sua medição que não é experimentalmente relevante e é devido aos buffers em que sua amostra é diluída ou reagentes aos quais sua amostra é exposta. Os valores obtidos a partir dessas medidas são chamados de "fundo". O branco não contém nenhuma amostra.
O controle positivo indica se o ensaio funcionou corretamente ou não. Dá um bom resultado. O controle negativo é uma variável de controle onde não se espera que não seja observado nenhum efeito/medição. Não deve dar nenhum resultado..
Uma vez que a placa está configurada, é hora de carregar as amostras. Para evitar medir as amostras erradas ou carregar a placa da maneira errada, é fundamental orientar a placa corretamente na bandeja de carregamento. Lembre-se de ter cuidado ao carregar amostras na bandeja, para não forçar a bandeja para dentro do instrumento ou capturar as extremidades dentro do instrumento.
Uma vez que a bandeja esteja carregada, parâmetros como o modo, comprimento de onda e ordem de carregamento de poços são definidos no software antes que a placa seja lida.
Depois que os parâmetros são definidos, a placa é lida, e o leitor gera uma leitura dos valores dentro do software.
Uma vez que a placa seja lida, use o valor médio das amostras em branco para subtrair o fundo de todas as amostras, incluindo a curva padrão.
Após a leitura, os valores de concentração conhecidos para as normas são traçados em relação aos seus respectivos valores medidos, absorção neste caso.
Quando os valores foram plotados, a linha de melhor ajuste pode ser calculada usando uma regressão linear. Isso pode ser facilmente feito usando um programa de planilha.
O coeficiente de determinação, uma medida estatística de quão bem a linha prevê pontos de dados reais, deve estar entre 0,90-0,99, sendo 0,99 considerado o melhor valor e significa que a linha se encaixa perfeitamente nos dados.
Usando a linha de melhor ajuste, podemos calcular os valores de concentração de amostras experimentais ou controles em cada poço, conectando o valor de absorção para Y e, em seguida, resolvendo a equação para X. Valores de concentração também podem ser estimados desenhando uma linha do valor de absorção no eixo Y para a linha de ajuste melhor e, em seguida, até o eixo X.
Muitos tipos de leitores de microplacãs medem a absorção, que é definida como a razão logarítmica da luz caindo sobre um objeto à luz transmitida através de um objeto.
O ensaio de Bradford é um exemplo de um ensaio de leitor de microplacência à base de absorvência, onde amostras de proteína são adicionadas à placa com o reagente "Bradford". Este composto se liga às proteínas da amostra, e causa uma mudança em sua absorção.
Em ensaios baseados em fluorescentes, um fluorocromo é ativado por um certo comprimento de onda de luz e, por sua vez, causa excitação do fluorocromo, que emite luz em um comprimento de onda diferente.
Ao trabalhar com reagentes sensíveis à luz, certifique-se de mantê-los cobertos para evitar fotobleaching e arruinar o experimento.
Ensaios luminescentes emitem luz através de uma reação química e muitas vezes usam luciferase. A luciferase vem de várias fontes, como vagalumes. Em uma reação de luciferase, a luz é emitida quando a luciferase encontra oxigênio, ATP e magnésio em uma série de reações.
Ensaios luminescentes têm muitas aplicações diferentes. Um exemplo dessa aplicação é medir a produção e detecção de espécies reativas de oxigênio em cânceres.
Outros aplicativos, que usam leitores de microplatos, incluem ensaios de alta produtividade usando 384 e 1536 poços. Nestes ensaios, as placas são carregadas por um robô. Não, não esse tipo de robô. Um robô programável que automatiza o manuseio de amostras extremamente preciso.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE ao leitor de microplatos. Neste vídeo, mostramos o que é um leitor de microlatos(A), como ele é usado(B), como operar este instrumento(C), como interpretar dados do leitor de microplatos e alguns aplicativos usando um leitor de microplato(D). Obrigado por assistir.
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Q1: What is a microplate reader and how does it work?
A microplate reader is an instrument that simultaneously measures many samples using multiwell plates, such as 96-well plates. It performs multiple miniature experiments at once by detecting different types of measurements including absorbance, fluorescence, and luminescence. The computer interface controls settings like wavelength and mode to automate sample analysis across all wells.
Q2: Why are standard curves used in microplate reader assays?
Standard curves determine experimental sample values by using samples with known concentrations that yield different absorbance values. A line of best fit is generated from this data, allowing unknown sample concentrations to be calculated or estimated. The coefficient of determination should be between 0.90-0.99 to ensure the line accurately predicts actual data points.
Q3: What role do controls play in microplate reader experiments?
Blanks determine background measurement not related to the experiment, using buffers or reagents without samples. Positive controls confirm the assay worked properly by yielding expected results. Negative controls show no measurement or effect should occur. Together, these controls validate assay accuracy and identify any experimental errors or contamination.
Q4: How should samples be loaded into a microplate for accurate results?
Samples and standards are loaded in duplicate or triplicate to account for pipetting errors. Multichannel pipettes are often used for efficient loading, though single-channel pipettes work for individual wells. Proper plate orientation in the loading tray is critical to prevent measuring wrong samples. Exercise caution when loading to avoid forcing the tray or catching extremities in the instrument.
Q5: What are the different measurement types available on multimodal microplate readers?
Multimodal microplate readers can perform absorbance measurements, which detect light transmitted through samples; fluorescence measurements, where a fluorochrome is excited by light and emits at a different wavelength; and luminescence measurements, which detect light from chemical reactions like luciferase. Light-sensitive reagents must be kept covered to prevent photobleaching and preserve experiment integrity.
Q6: How is background subtraction performed after reading a microplate?
After the plate is read, the average value of blank samples is calculated and subtracted from all sample measurements, including the standard curve. This removes background noise caused by buffers or reagents not related to the experiment. Background subtraction ensures that measured values reflect only the experimental signal of interest.
Q7: What are common applications of microplate readers in research?
Microplate readers quantify protein levels, measure gene expression, and detect metabolic processes such as reactive oxygen species production in cancer research and calcium flux. High-throughput assays using 384- and 1536-well plates employ programmable robots for automated, precise sample handling. These applications enable rapid analysis of thousands of samples simultaneously.