Name: Grande Escala Profiling não-alvo metabolômica de soro por cromatografia líquida de ultra-espectrometria de massa (UPLC-MS) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Aprenda a realizar perfilamento metabolômico não-alvo de soro em larga escala usando UPLC-MS. Este método permite extrair metabolitos, estabelecer controles de qualidade e identificar biomarcadores moleculares com estabilidade analítica robusta.

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O tutorial apresentado foi realizado e desenvolvido dentro da Instalação de Proteômica e Metabolômica da Colorado State University, que é parcialmente financiada pelos Recursos de Administração de Pesquisa da CSU para Projetos Acadêmicos.

1. Organização da amostra
<ol>
	<li>Para criar um mapa de placas para preparação de amostras em uma planilha, na primeira coluna, insira uma lista de amostras em ordem de carregamento. Em uma segunda coluna, insira os locais das placas de 96 poços usando a nomenclatura correta para o software do amostrador automático.</li>
	<li>Guarde um poço em cada placa para amostras de controle de qualidade.</li>
	<li>Se o seu amostrador automático LC puder lidar com duas placas por vez, separe a lista de amostras em lotes de 190 e salve essas informações em uma segunda planilha.</li>
	<li>Dentro de cada um desses lotes, use a função randomize [nota: "=rand()"no Excel] para randomizar a ordem de injeção. Agora copie e cole seu pedido de injeção no sistema de software de fila de amostras LC-MS. A randomização deve ocorrer entre lotes, dentro de lotes, e ser única entre as réplicas de injeção.</li>
</ol>
2. Procedimentos de preparação de amostras de soro e controle de qualidade (CQ)
<ol>
	<li>Preparar uma amostra de 10 ml de CQ contendo, no mínimo, quatro compostos de massa e tempo de retenção conhecidos que abranjam a eluição cromatográfica da experiência. (Nota: cafeína, reserpina, sulfadimetoxina e terfenadina na concentração de 2 μg/ml cada).</li>
	<li>Descongele as amostras de soro no gelo e bata suavemente por ~ 5 segundos.</li>
	<li>Umedeça previamente as pontas de um pipetador de 12 canais com metanol para ajudar a evitar o gotejamento da ponta durante a distribuição da amostra. Em seguida, adicione 370 μl de metanol frio a cada poço de uma placa de 96 poços.</li>
	<li>Transfira 100 μl de cada amostra para o local da placa correspondente a partir dos mapas da placa. Cubra as placas e incube a -80 °C por 30 min para precipitar as proteínas.</li>
	<li>Girar as placas em uma centrífuga a 4 °C a 3.200 x g por 30 min. Transferir 250 μl de sobrenadante para um novo poço de 96 poços e repetir a centrifugação.</li>
	<li>Agora transfira alíquotas de 60 μl do sobrenadante para três placas de 96 poços adequadas para o amostrador automático UPLC ou LC.</li>
	<li>Adicione 100 μl de mistura de amostras de CQ à posição reservada do poço na placa.</li>
	<li>Sele cada placa com filme adesivo. O solvente pode evaporar rapidamente após a perfuração do poço e, portanto, as injeções devem ser realizadas apenas uma vez em cada placa. As placas na fila de amostras podem ser armazenadas a curto prazo a -20 °C.</li>
</ol>
3. Aquisição de dados UPLC-MS
<ol>
	<li>Defina o amostrador automático para 4 °C e coloque as duas primeiras placas no amostrador automático.</li>
	<li>Configure o método de aquisição usando um dos dois gradientes de fase reversos alternativos. O gradiente A é tendencioso para moléculas apolares, enquanto o gradiente B fornecerá cobertura aprimorada de moléculas moderadamente polares.
	<ol>
		<li>Gradiente A: 
		<borda da tabela = "1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>Tempo (min)</td>
					<td>%A</td>
					<td>%B</td>
					<td>curva</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,0</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,1</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1.0</td>
					<td>60</td>
					<td>40</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>3.0</td>
					<td>30</td>
					<td>70</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>11.0</td>
					<td>0</td>
					<td>100</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17.0</td>
					<td>0</td>
					<td>100</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17.1</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>23,0</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
		<li>Gradiente B 
		<borda da tabela = "1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>Tempo (min)</td>
					<td>%A</td>
					<td>%B</td>
					<td>curva</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,0</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>13</td>
					<td>5</td>
					<td>95</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>16</td>
					<td>5</td>
					<td>95</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>16.05</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>20</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Configure o espectrômetro de massa para coletar dados em varredura de modo positivo de 50 a 1.200 m/z. Condições específicas adicionais do instrumento variam de acordo com o sistema usado. O seguinte representa as condições de uso em nosso espectrômetro de massa Waters Xevo G2 Q-TOF: Energia de colisão = 6V; Tempo de varredura = 0,2 seg por varredura; Tensão capilar = 2.200 V; Temperatura da fonte = 150 ° C Temperatura de dessolvatação = 350 ° C Fluxo de gás de dessolvatação (N2) = 800 L / h).</li>
	<li>Injete as amostras de CQ cinco vezes no início de cada lote de amostras de 2 placas. Depois de condicionar o sistema UPLC-MS com as duas primeiras injeções, monitore a área de pico (<25% RSD), o tempo de retenção (+/- 0,05 min) e a precisão da massa (+/- 3 ppm) da terceira à quinta injeção. Esses parâmetros podem precisar ser ajustados para se adequar às especificações do instrumento que está sendo usado para aquisição de dados.</li>
	<li>Se as amostras de CQ forem aprovadas, adquira dados sobre amostras de soro para essas duas placas. Se as amostras de CQ falharem, os dados da amostra não serão coletados até que o problema seja resolvido e as amostras de CQ sejam aprovadas. Em nosso laboratório, descobrimos que esses parâmetros são consistentemente estáveis ao longo de três dias de injeções (ou seja, a injeção de 2 placas de 96 poços). Se o seu sistema estiver instável durante esse período de tempo, injeções de CQ mais frequentes podem ser apropriadas. A amostra de CQ é usada não para corrigir dados de baixa qualidade, mas para evitar que dados de baixa qualidade sejam coletados.</li>
</ol>
4. Detecção, integração, alinhamento e normalização de pico
Há uma variedade de opções para executar essas etapas, incluindo freeware e ferramentas específicas do fornecedor. Esta etapa foi ignorada no tutorial em vídeo, mas nossa abordagem é descrita abaixo como um exemplo.
Para cada amostra, os dados analíticos gerados a partir desse tipo de experimento são um perfil de íons conforme descrito por um tempo de retenção, valor m/z e uma intensidade espectral. Um experimento de perfil de metabólito não direcionado será composto por muitas amostras e, portanto, a detecção de pico, o alinhamento do tempo de retenção e a normalização devem ser realizados para permitir a análise estatística subsequente do conjunto de dados.
<ol>
	<li>Exporte dados brutos para o formato .cdf usando o software Waters DataBridge. Execute a detecção de pico e o alinhamento do tempo de retenção usando o pacote de software XCMS 10 (freeware disponível em <a href="http://metlin.scripps.edu/xcms/" target="_blank">http://metlin.scripps.edu/xcms/</a>) e é executado no ambiente estatístico R11). O site contém documentação sobre como baixar e executar o software.</li>
	<li>Use o método "matchedfilter" dentro do XCMS com os seguintes parâmetros: largura total na metade máxima = 8 seg, relação S/N = 3, máximo de 100 picos para cada cromatograma de íons extraído. Execute as etapas de agrupamento de recursos, correção do tempo de retenção, reagrupamento e fillPeaks. A saída do software XCMS é uma matriz de dados com todos os recursos detectáveis listados como linhas, cada amostra experimental como uma coluna e as células são preenchidas com a área de pico de cada recurso em cada amostra. A transposição deste conjunto de dados pode ser necessária para incorporação em fluxos de trabalho estatísticos a jusante.</li>
	<li>Normalize a matriz de dados em R dividindo a área de pico de cada recurso em uma determinada amostra pela soma da área de pico de íons extraída (chamada de corrente de íons total ou TIC para essa amostra (multiplicada por 100.000 para tornar os números mais receptivos à interpretação visual de dados).</li>
	<li>Remova outliers. Valores discrepantes nos dados podem resultar de uma injeção incorreta de uma boa amostra ou de uma boa injeção de uma amostra ruim.
	<ol>
		<li>Execute a detecção de outliers no R usando o pacote de outliers com os seguintes parâmetros: (1) valores de TIC e (2) pontuações de PC com 99,9% de confiança.</li>
		<li>Se houver exceções, os arquivos de dados correspondentes serão removidos e os procedimentos de detecção, alinhamento e normalização de pico serão executados novamente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Calcule a média das áreas de pico normalizadas por identificador de amostra (para calcular a média de várias injeções). Isso deve ser feito antes de realizar a análise estatística (observe que as réplicas de injeção são responsáveis pela variação analítica, mas não podem ser usadas como réplicas biológicas verdadeiras).</li>
</ol>
5. Análise estatística
Para experimentos metabolômicos, técnicas estatísticas multivariadas e univariadas são necessárias para a interpretação dos dados. Duas técnicas comumente usadas incluem Análise de Componentes Principais e Análise de Variância (ANOVA). Existem várias maneiras de abordar a análise estatística dos dados e ferramentas de software de código aberto e comerciais estão disponíveis. Esta etapa foi ignorada no tutorial em vídeo, mas nossa abordagem é descrita abaixo como um exemplo.
<ol>
	<li>Execute a ANOVA aplicando uma função aov ao conjunto de dados em R.</li>
	<li>Considere os falsos positivos usando um ajuste de Benjamini-Hochberg (função p.adjust em R).</li>
	<li>Conduza o PCA com o conjunto de dados em escala de Pareto (variância unitária também pode ser aplicada) e centrado na média. As pontuações e carregamentos do PC são calculados usando o pacote pcaMethods em R.</li>
	<li>Use valores de p ANOVA, pontuações de carga e parâmetros de mudança de dobra para determinar as características moleculares que melhor descrevem a variação associada ao tratamento experimental.</li>
	<li>Interrogue manualmente cada característica molecular de interesse para determinar se ela corresponde a um íon molecular, aduto (por exemplo, sódio, potássio ou dímero) ou perda neutra.</li>
</ol>
6. Identificação de metabólitos
O fluxo de trabalho apresentado aqui é muito geral e pode ser aplicado aos resultados de qualquer plataforma de instrumento. Uma estratégia alternativa é apresentada na seção Discussão.
<ol>
	<li>Para todos os recursos estatisticamente significativos (conforme determinado a partir da análise na Etapa 6), revise os dados brutos e confirme se os íons-mãe, adutos de sódio, isótopos e fragmentos seguem tendências semelhantes em todo o conjunto de dados. Por exemplo, o valor p derivado da ANOVA para um íon pai deve ser semelhante ao seu isótopo. Isso indica que ambas as características moleculares correspondem ao mesmo metabólito.</li>
	<li>Pesquise medições de massa precisas e/ou perdas neutras de características moleculares estatisticamente significativas (escolha o isótopo C12 se vários isótopos forem significativos) em bancos de dados de metabólitos internos (se disponíveis) ou disponíveis publicamente, como:
	<ol class="lroman">
		<li>Banco de dados de metaboloma humano (<a href="http://www.hmdb.ca/" target="_blank">http://www.hmdb.ca/</a>)</li>
		<li>Metlin (<a href="http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php" target="_blank">http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php</a>)</li>
		<li>Banco de massa (<a href="http://www.massbank.jp/?lang=en" target="_blank">http://www.massbank.jp/?lang=en</a>)</li>
		<li>Mapas lipídicos (<a href="http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html" target="_blank">http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html</a>)</li>
		<li>Pesquisa MS do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (<a href="http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/" target="_blank">http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/</a>)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Use um software para prever uma fórmula molecular a partir da massa precisa e da distribuição isotópica de suas características moleculares significativas. No software Waters, isso é feito usando a ferramenta Elemental Comp no pacote MassLynx.</li>
	<li>Filtre as identificações de metabólitos candidatos por: erro de massa (conforme adequado para a plataforma do seu instrumento), fórmula molecular prevista, relevância biológica nas tendências observadas em relação ao projeto experimental e tempo de retenção (por exemplo, lipídios e outros compostos não polares terão tempos de retenção mais longos ao empregar cromatografia de fase reversa).</li>
	<li>Realize experimentos subsequentes para adquirir a fragmentação MS / MS para características moleculares estatisticamente significativas. Sempre que possível, a identificação dos metabolitos deve basear-se na correspondência dos picos de fragmentação experimentais e do tempo de retenção com os de um padrão autêntico adquirido no mesmo instrumento. Alternativamente, a fragmentação experimental pode ser combinada com um banco de dados espectral.</li>
	<li>A confiança na identificação deve ser atribuída a todas as identificações de metabólitos relatadas com base nas recomendações da iniciativa de padrões metabolômicos12. 
	Nível 1: identificação molecular confiável com base em parâmetros analíticos ortogonais (massa precisa, tempo de retenção e fragmentação de MS/MS) em relação a um composto autêntico. 
	O nível 2 refere-se a uma suposta base de identificação em propriedades físico-químicas e/ou similaridade espectral com a literatura ou bibliotecas espectrais. 
	O nível 3 refere-se à identificação putativa de uma classe de compostos com base em propriedades físico-químicas ou similaridade espectral. 
	O nível 4 refere-se a um composto desconhecido.</li>
</ol>

<ol><li>Theodoridis, G., Gika, H. G., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Holistic+Analytical+Approaches+for+Metabolite+Profiling+in+Systems+Biology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Holistic Analytical Approaches for Metabolite Profiling in Systems Biology Studies.</a> Mass Spectrom. Rev. 30, 884-906 (2011).</li>
<li>Zelena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+robust+and+repeatable+UPLC-MS+method+for+the+long-term+metabolomic+study+of+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a robust and repeatable UPLC-MS method for the long-term metabolomic study of human serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 1357-1364 (2009).</li>
<li>Michopoulos, F., Lai, L., Gika, H., Theodoridis, G., Wilson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UPLC-MS-based+analysis+of+human+plasma+for+metabonomics+using+solvent+precipitation+or+solid+phase+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">UPLC-MS-based analysis of human plasma for metabonomics using solvent precipitation or solid phase extraction.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2114-2121 (2009).</li>
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<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetPA%3A+a+web-based+metabolomics+tool+for+pathway+analysis+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MetPA: a web-based metabolomics tool for pathway analysis and visualization.</a> Bioinformatics. 26, 2342-2344 (2010).</li>
<li>Johnson, C. H., Gonzalez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+of+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities of metabolomics.</a> J. Cell. Physiol. 227, 2975-2981 (2012).</li>
<li>Issaq, H. J., Waybright, T. J., Veenstra, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+biomarker+discovery%3A+Opportunities+and+pitfalls+in+analytical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Cancer biomarker discovery: Opportunities and pitfalls in analytical methods.</a> Electrophoresis. 32, 967-975 (2011).</li>
<li>Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">LC-MS-based metabolomics.</a> Mol. Biosyst. 8, 470-481 (2012).</li>
<li>Weckwerth, W., Morgenthal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics%3A+from+pattern+recognition+to+biological+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Metabolomics: from pattern recognition to biological interpretation.</a> Drug Discov. Today. 10, 1551-1558 (2005).</li>
<li>Smith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METLIN+-+A+metabolite+mass+spectral+database%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Drug+Monit%22%5BJournal%5D)">METLIN - A metabolite mass spectral database.</a> Ther. Drug Monit. 27, 747-751 (2005).</li>
<li>Culpepper, S. A., Aguinis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R+is+for+Revolution%3A+A+Cutting-Edge%2C+Free%2C+Open+Source+Statistical+Package%5BTitle%5D)+AND+%22Organ+Res.+Methods%22%5BJournal%5D)">R is for Revolution: A Cutting-Edge, Free, Open Source Statistical Package.</a> Organ Res. Methods. 14, 735-740 (2011).</li>
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<li>Garcia-Canaveras, J. C., Donato, M. T., Castell, J. V., Lahoz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+untargeted+metabonomic+analysis+of+human+steatotic+liver+tissue+by+RP+and+HILIC+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+reveals+important+metabolic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">A comprehensive untargeted metabonomic analysis of human steatotic liver tissue by RP and HILIC chromatography coupled to mass spectrometry reveals important metabolic alterations.</a> Journal of Proteome Research. 10, 4825-4834 (2011).</li>
<li>Nordstrom, A., Want, E., Northen, T., Lehtio, J., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+ionization+mass+spectrometry+strategy+used+to+reveal+the+complexity+of+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple ionization mass spectrometry strategy used to reveal the complexity of metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 80, 421-429 (2008).</li>
<li>Horai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassBank%3A+a+public+repository+for+sharing+mass+spectral+data+for+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">MassBank: a public repository for sharing mass spectral data for life sciences.</a> J. Mass Spectrom. 45, 703-714 (2010).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+metabolite+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Advances in metabolite identification.</a> Bioanalysis. 3, 1769-1782 (2011).</li>
<li>Broeckling, C., Heuberger, A., Prince, J., Ingelsson, E., Prenni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assigning+precursor-product+ion+relationships+in+indiscriminant+MS%2FMS+data+from+non-targeted+metabolite+profiling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Assigning precursor-product ion relationships in indiscriminant MS/MS data from non-targeted metabolite profiling studies.</a> Metabolomics. , 1-11 (2012).</li>
<li>Kangas, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+identification+software+%28ISIS%29%3A+a+machine+learning+approach+to+tandem+mass+spectral+identification+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">In silico identification software (ISIS): a machine learning approach to tandem mass spectral identification of lipids.</a> Bioinformatics. 28, 1705-1713 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este tutorial destina-se a servir como ponto de partida para a realização de perfis de metabólitos não direcionados em larga escala por UPLC-MS. O fluxo de trabalho é focado em metabólitos que podem ser extraídos com um solvente aquoso de metanol, retidos em uma coluna C8 ou C18 UPLC e detectados como íons positivos. Na situação em que não existe um enviesamento pré-determinado para uma classe específica de metabolitos e se pretende uma hipótese geradora de perfil global, este protocolo é valioso, uma vez que resultará n...

O termo "metabolômica" pode abranger muitas coisas. Por exemplo, um experimento metabolômico pode ser realizado usando uma variedade de plataformas analíticas, como RMN e cromatografia gasosa e/ou líquida acoplada à espectrometria de massa. Além disso, os experimentos metabolômicos podem ser realizados de maneira direcionada ou não direcionada, ou uma combinação de ambos. Um experimento metabolômico direcionado envolverá a análise direcionada de um painel de moléculas importantes para a questão biológica em questão (por exemplo, pequenas moléculas envolvidas no ciclo do TCA permitirão a quantificação precisa dessa via). Nessa situação, a hipótese biológica está ditando a escolha dos metabólitos a serem direcionados na análise e as etapas analíticas são otimizadas para a detecção dessas moléculas. Alternativamente, um experimento metabolômico não direcionado é a geração de hipóteses. Neste caso, o experimento é realizado de maneira ampla e imparcial para permitir a detecção do maior número possível de metabólitos. Os resultados de um experimento não direcionado conduzirão a próxima etapa da pesquisa (que em muitos casos pode envolver um fluxo de trabalho metabolômico direcionado). Também é possível combinar as duas abordagens, caso em que um experimento é realizado de maneira não direcionada e, ao mesmo tempo, um painel de moléculas conhecidas é monitorado nos dados. 
O tutorial apresentado aqui é focado especificamente no perfil de metabólitos não direcionados do soro. Conforme descrito acima, a abordagem não direcionada fornece uma visão imparcial dos metabólitos detectáveis, pode gerar grandes quantidades de informações e, em última análise, permitir novas descobertas. O uso dessa abordagem, empregando especificamente cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massa (UPLC-MS), está se tornando difundido 1, 2, 3 e envolve as seguintes etapas: (1) desenho experimental (2) coleta de amostras (3) preparação de amostras (4) aquisição de dados por UPLC-MS (5) pré-processamento de dados (detecção de picos, integração, alinhamento e normalização) (6) análise estatística de dados (uni e multivariada) (7) identificação de metabólitos e (8) biológico interpretação. 
Atualmente, não há métodos padrão estabelecidos para o perfil de metabólitos não direcionados baseados em UPLC-MS e etapas subsequentes de pré-processamento de dados. Essa falta de padronização se deve em parte a um dos principais desafios analíticos do perfil de metabólitos; a diversidade química do metaboloma. Devido a essa diversidade, é impossível para um único método de extração ou método de aquisição por espectrometria de massa fornecer cobertura abrangente de todos os metabólitos em uma única análise. Em conceito, a cobertura de metabólitos pode ser maximizada usando múltiplas extrações (por exemplo, aquosa, metanol, clorofórmio: metanol, etc.) juntamente com várias condições cromatográficas (por exemplo, fase reversa, HILIC, etc.) e vários modos de ionização (por exemplo, íon positivo, íon negativo, ionização química, etc.). Muitas vezes, no entanto, os pesquisadores não têm um viés pré-determinado para uma classe química específica e, portanto, a despesa de realizar várias extrações e aquisições de instrumentos não é justificada, especialmente para experimentos em larga escala. Assim, o tutorial em vídeo apresentado aqui foi projetado para fornecer um procedimento geral para o perfil de metabólitos não direcionados em larga escala do soro por UPLC-MS. Isso permitirá que laboratórios novos e estabelecidos realizem esses tipos de experimentos e os blocos de construção sobre os quais eles podem expandir a abordagem para vários tipos de amostras, classes químicas específicas ou análises direcionadas. Especificamente, este protocolo incluirá as etapas de: preparação da amostra de soro, organização da amostra para estudos em larga escala, aquisição de dados UPLC-MS, procedimentos de controle de qualidade (CQ) e identificação de metabólitos. Estratégias para pré-processamento de dados e análise estatística também são apresentadas.
O protocolo não se concentrará nas etapas de projeto experimental, coleta de amostras ou interpretação de dados biológicos, pois está fora do escopo deste tutorial. No entanto, existem muitos recursos na literatura para esses tópicos e os autores incentivam os pesquisadores novos na metabolômica a explorá-los minuciosamente 4, 5, 6, 7, 8, 9. Em particular, o planejamento experimental é extremamente importante e é fundamental para o sucesso de um experimento metabolômico não direcionado. Devem ser tidos em conta factores como a replicação biológica adequada e a coerência do procedimento de colheita de amostras (por exemplo, tempo em banco, temperatura de armazenamento, tempo de armazenamento, congelamento-descongelamento, etc.) para garantir um estudo viável e facilitar a interpretação biológica adequada dos dados.

<table><tbody><tr><td>Placas de 96 poços - 500 &mu; l poços</td><td>VWR</td><td>40002-020</td><td>Estes são usados para preparação de amostras</td></tr><tr><td>Tapetes de placa de 96 poços</td><td>VWR</td><td>89026-514</td><td>Estes são usados para preparação de amostras</td></tr><tr><td>Placas de 96 poços - 350 &mu; l poços</td><td>Waters Corporation</td><td>WAT058943</td><td>Estes são usados para injeção de amostra</td></tr><tr><td>96 esteiras de placa de poço</td><td>Waters Corporation</td><td>186000857</td><td>Estes são usados para injeção de amostra</td></tr><tr><td>96 selos térmicos de placa de poço</td><td>Waters</td><td>Corporation 186002789</td><td>Estes podem ser usados para injeção de amostra ou armazenamento de longo prazo</td></tr><tr><td>96 selador térmico de placa de poço </td><td>Waters Corporation</td><td>186002786</td><td></td></tr><tr><td>Metanol de grau LC-MS</td><td>Fluka</td><td>34966</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila de grau LC-MS</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Ativador de grau LC-MS</td><td>Fluka</td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico de grau LC-MS</td><td>Fluka</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>Pipetador eletrônico multicanal</td><td>VWR</td><td>89000-674</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta</td><td>Eclipse (adquirido através da Light Labs)</td><td>B-5061/B-4061</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga resfriada - Allegra X-12R</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A - contato Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr><td>Acquity Sistema de cromatografia líquida de ultra desempenho (UPLC)</td><td>Waters Corporation</td><td>N/A - contato Waters Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Coluna UPLC C8 (opção de gradiente a)</td><td>Coluna Waters Corporation</td><td>186002876</td><td></td></tr><tr><td>UplC T3 (opção de gradiente b) </td><td>Waters Corporação</td><td>186003536</td><td></td></tr><tr><td>Xevo G2 Q-TOF Espectrômetro de massa</td><td>Waters Corporation</td><td>N/A - entre em contato com a Waters Corporation</td><td></td></tr></tbody></table>

grande escala profiling não-alvo metabolômica de soro por cromatografia líquida de ultra-espectrometria de massa (uplc-ms)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

O perfil de metabólitos não direcionados por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massa (UPLC-MS) é uma técnica poderosa para investigar o metabolismo. A abordagem oferece uma análise imparcial e aprofundada que pode permitir o desenvolvimento de testes diagnósticos, novas terapias e aprofundar nossa compreensão dos processos da doença. A diversidade química inerente do metaboloma cria desafios analíticos significativos e não existe uma abordagem experimental única que possa detectar todos os metabólitos. Além disso, a variação biológica no metabolismo individual e a dependência do metabolismo de fatores ambientais exigem um grande número de amostras para atingir o poder estatístico apropriado necessário para uma interpretação biológica significativa. Para enfrentar esses desafios, este tutorial descreve um fluxo de trabalho analítico para o perfil de metabólitos não direcionados em larga escala do soro por UPLC-MS. O procedimento inclui diretrizes para organização e preparação de amostras, aquisição de dados, controle de qualidade e identificação de metabólitos e permitirá a aquisição confiável de dados para grandes experimentos e fornecerá um ponto de partida para laboratórios novos no perfil de metabólitos não direcionados por UPLC-MS.

As etapas analíticas básicas de um experimento de perfilagem de metabólitos não direcionado por UPLC-MS são descritas na Figura 1. Os dados brutos de cada amostra podem ser visualizados como um cromatograma de pico base. Figura 2 mostra um exemplo de cromatograma de pico base de uma amostra de soro analisada pela opção de gradiente (a) no tutorial. Após a análise estatística conforme descrito acima, tenta-se a identificação dos metabólitos para todas as características moleculares estati...

O perfil de metabólitos não direcionados por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massa (UPLC-MS) é uma técnica poderosa para investigar o metabolismo. Este artigo descreve um fluxo de trabalho típico utilizado para o perfil de metabólitos não direcionados do soro, incluindo organização e preparação de amostras, aquisição de dados, análise de dados, controle de qualidade e identificação de metabólitos.

Grande Escala Profiling não-alvo metabolômica de soro por cromatografia líquida de ultra-espectrometria de massa (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar um perfilamento robusto de metabólitos não direcionados em soro, em um experimento de grande escala. Primeiro, extraia os metabólitos em formato de placa. Estabeleça uma amostra e um método de controle de qualidade robustos para garantir a estabilidade analítica ao longo do tempo.Em seguida, adquira dados espectrais de massa de amostras de soro QC e randomizadas em replicatas, prossiga para a pré-processamento dos dados, análise estatística e identificação de metabólitos. Os resultados do perfilamento de metabólitos não direcionado por U-P-L-C-M-S podem ser utilizados para identificar biomarcadores de pequenas moléculas no soro. O protocolo é apresentado aqui para a análise de soro.No entanto, pode ser facilmente estendido à análise de outros fluidos biológicos, como urina, tecidos e extratos de culturas celulares. Para criar um mapa de placa para o preparo das amostras, abra uma planilha. Na primeira coluna, insira a lista de amostras na ordem de carregamento. Na segunda coluna, insira as posições das placas de 96 poços utilizando a nomenclatura correta do software do seu amostrador automático.Reserve um poço em cada placa para a amostra de controle de qualidade. Se o seu amostrador automático de LC puder manipular duas placas ao mesmo tempo, separe a lista de amostras em lotes de 190 e salve essas informações em uma segunda planilha. Dentro de cada um desses lotes, randomize a ordem de injeção.Agora copie e cole seu pedido de injeção no sistema de fila de amostras do LCMS. Reserve as três primeiras linhas da fila de amostras para injeções de condicionamento da coluna. Prepare um estoque de 10 mililitros de amostra QC contendo no mínimo quatro compostos de massa e tempo de retenção conhecidos que abranjam a eluição cromatográfica do experimento.Descongele as amostras de soro em gelo e vortexe suavemente por cerca de cinco segundos. Umedeça previamente as ponteiras de uma pipeta de 12 canais com metanol para ajudar a prevenir gotejamento durante a dispensação das amostras. Em seguida, adicione 370 microlitros de metanol frio a cada poço de uma placa de 96 poços e transfira 100 microlitros de cada amostra para a posição correspondente na placa, conforme os mapas da placa.Cubra as placas e incube a menos 80 graus Celsius por 30 minutos. Para precipitar as proteínas, centrifugue as placas a 3.200 ×g e quatro graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, transfira 250 microlitros do sobrenadante para uma nova placa de 96 poços e repita a etapa de centrifugação.Agora transfira alíquotas de 60 microlitros do snat para 3 placas de 96 poços adequadas para o amostrador automático de UPLC ou lc. Adicione 100 microlitros da mistura de amostra QC à posição de poço reservada na placa. Sobreponha cada placa com filme adesivo.Configure o amostrador automático em quatro graus Celsius. Coloque as duas primeiras placas no amostrador automático. Configure o método de aquisição utilizando um dos dois gradientes alternativos de fase reversa.O gradiente A é voltado para moléculas não polares. Enquanto o gradiente B proporcionará uma cobertura aprimorada de moléculas moderadamente polares. Configure o espectrômetro de massas para coletar dados no modo positivo, realizando varredura de 50 a 1200 na razão massa/carga.Condições adicionais específicas do instrumento variarão de acordo com o sistema utilizado no início de cada dois. Plaqueie manualmente as amostras e injete as amostras de controle de qualidade cinco vezes. Utilize a terceira à quinta injeção de controle de qualidade para monitorar a área do pico com menos de 25% de RSD, o tempo de retenção com variação de ±0,05 minutos e a exatidão de massa com variação de ±3 partes por milhão.Esses parâmetros podem precisar ser ajustados para atender às especificações do instrumento utilizado para a aquisição de dados. Se as amostras de controle de qualidade forem aprovadas, adquira dados das amostras de soro para essas duas placas quando a aquisição de todo o conjunto de dados estiver concluída. Realize detecção de características, alinhamento e normalização dos dados de espectrometria de massas para todo o conjunto de dados.Em seguida, realize uma análise estatística para determinar as características moleculares de interesse biológico. Essas etapas são descritas no protocolo textual. O fluxo de trabalho a seguir apresenta uma visão conceitual do processo de identificação de metabólitos.Uma estratégia alternativa é fornecida no protocolo textual. Utilize um software para prever uma fórmula molecular a partir da massa exata e da distribuição isotópica das características moleculares significativas. Em seguida, pesquise as medidas de massa exata em bancos de dados de metabolitos internos ou públicos.Os bancos de dados filtram o metabólito candidato, identificações por erro de massa, fórmula molecular prevista, tempo de retenção, fragmentação na fonte e relevância biológica nas tendências observadas em relação ao delineamento experimental. Isso resultará em uma identificação putativa do metabólito. A identificação absoluta exige a correspondência da massa exata, tempo de retenção e fragmentação do composto experimental com um padrão autêntico do metabólito putativo.Por fim, atribua confiança de identificação a todas as identificações de metabólitos relatadas com base nas recomendações da Iniciativa de Padrões Metabolômicos. Este fluxo de trabalho indica os passos analíticos básicos para realizar um experimento de perfilagem de metabólitos não direcionado por U-P-L-C-M-S. Os dados brutos podem ser visualizados como um cromatograma de pico base.Este exemplo mostra uma amostra de soro que foi analisada por gradiente e submetida posteriormente à análise estatística. A identificação de metabólitos é tentada para todas as características moleculares biologicamente importantes e estatisticamente significativas. Aqui, a cafeína foi identificada em soro humano mediante a correspondência do tempo de retenção cromatográfico, da massa exata e do padrão de fragmentação entre a característica molecular experimental e um padrão autêntico do metabólito putativo.Esta é um exemplo de identificação de metabólitos de nível um. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como garantir a estabilidade analítica durante perfis metabólicos não direcionados em larga escala de soro utilizando UPLC ms. No entanto, a estabilidade analítica é apenas um aspecto importante de um experimento bem-sucedido de perfilagem de metabólitos. O delineamento experimental e a análise e interpretação dos dados posteriores também são fundamentais.Mas fora do escopo deste tutorial em vídeo, esses tópicos são introduzidos e discutidos no protocolo textual.

large-scale-non-targeted-metabolomic-profiling-serum-ultra

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Irrelevantes metabolômica fornece uma hipótese gerando instantâneo de um perfil metabólico. Este protocolo irá demonstrar a extracção e análise de metabolitos a partir de células, soro ou tecido. Uma gama de metabolitos são pesquisadas utilizando extracção de fase líquido-líquido, cromatografia líquida de microfluxo UltraPerformance /-espectrometria de massa de alta resolução (UPLC-HRMS), acoplado ao software de análise diferencial.

Metabolomics irrelevantes de fontes biológicas Usando UltraPerformance cromatografia líquida de alta resolução Espectrometria de Massa (UPLC-HRMS)

Metabolite perfis tem sido um ativo valioso para o estudo do metabolismo na saúde e na doença. Utilizando cromatografia normal em fases líquida acoplada à espectrometria de massa de alta resolução com mudança de polaridade e um ciclo rápido, nós descrevemos um protocolo para analisar a composição metabólica polar de material biológico com alta sensibilidade, precisão e resolução.

Uma estratégia para sensíveis, Large Scale quantitativos Metabolomics

A confiabilidade dos resultados em experimentos de metabolômica depende da eficácia e reprodutibilidade da preparação de amostras. Descrito é um método rigoroso e em profundidade que permite a extração de metabólitos a partir de fluidos biológicos com a opção de seguida, analisar-se a milhares de compostos, ou apenas as classes de compostos de interesse.

Preparação Técnica Multi-passo para recuperar várias classes compostas metabólito para em profundidade e análise metabolômica Informativo

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Apresentamos um protocolo para dosar com precisão as proteínas com rotulagem isobárica, fracionamento extensivo, ferramentas de bioinformática e etapas de controle de qualidade em combinação com cromatografia líquida interfaceada com um espectrômetro de massa de alta resolução.

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

Um protocolo detalhado é descrito para a separação, identificação e caracterização de proteoforms em amostras de proteínas usando a zona capilar eletroforese-electrospray em tandem-ionização espectrometria de massa (CZE-ESI-MS/MS). O protocolo pode ser usado para a caracterização de alta resolução do proteoforms em amostras da proteína simples e a identificação em larga escala de proteoforms em amostras complexas proteome.

Em grande escala proteômica de cima para baixo usando zona capilar eletroforese espectrometria de massa em Tandem

Aqui nós descrevemos um método de alta produtividade para a fiscalização de drogas abrangente que permite a resolução melhorada e detecção de grandes painéis de drogas de abuso e seus metabolitos, com controle de qualidade baseado na injeção multisegment-capilar eletroforese / espectrometria de massa.

Vigilância de drogas de alto rendimento e abrangente utilizando espectrometria de massa Multisegment eletroforese capilar-injeção

Apresenta-se um método para a análise não direcionada de metabólitos e lipídios de grãos de trigo. O protocolo inclui um método de extração metabólica acetonitrila e metodologia de espectrometria de cromatografia líquida de fase invertida, com aquisição em modos positivos e negativos de ionização eletrospray.

Análise de metabolômica baseada em espectrometria líquida não direcionada

Os protocolos descrevem métodos de cromatografia líquida de alto desempenho acoplados ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para estudar reações metabólicas em sistemas complexos de isenta de células baseadas em lysato.

Cromatografia líquida acoplada ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para perfil metabólito em sistemas livres de células baseadas em lysato

O objetivo deste protocolo é detectar metabólitos fenólicos no plasma usando um método de espectrometria de massa cromatografia-masscamo semi-direcionada.

Cromatografia ultra-alta-performance semi-direcionada acoplada à análise de espectrometria de massa de metabólitos fenólicos no plasma de idosos adultos

Aprenda a realizar perfilamento metabolômico não-alvo de soro em larga escala usando UPLC-MS. Este método permite extrair metabolitos, estabelecer controles de qualidade e identificar biomarcadores moleculares com estabilidade analítica robusta.

Grande Escala Profiling não-alvo metabolômica de soro por cromatografia líquida de ultra-espectrometria de massa (UPLC-MS)

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