Rato de curto e longo prazo da atividade locomotora analisados ​​pelo software Rastreamento Vídeo

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar diferenças na atividade locomotora de curto e/ou longo prazo entre diferentes grupos de camundongos tratados experimentalmente. Isso é alcançado por meio da gravação em vídeo da atividade no viveiro dos camundongos em tempo real. Em um segundo passo, a atividade locomotora do animal é analisada em tempo real ou a partir de uma gravação, utilizando software de rastreamento de vídeo.

Em seguida, os parâmetros locomotores pontuados são importados para um software secundário destinado à análise estatística. Assim, o procedimento pode elucidar os efeitos de tratamentos ou condições sobre a atividade locomotora de curto e longo prazo com base em parâmetros avaliados, como distância percorrida, velocidade do movimento e duração do movimento. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a contagem de travessias de linhas e a implantação de emissores, é que ela permite um exame mais completo da atividade locomotora de camundongos, sem a necessidade de um procedimento cirúrgico invasivo e potencialmente confundidor.

De modo geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois montar as gaias e o equipamento de forma a permitir qualidade ótima de imagem para o rastreamento por vídeo subsequente pode ser trabalhoso e levar tempo para ser aprendido. A atividade locomotora de curto prazo é testada nas gaias de origem de camundongos isolados, com cama que apresenta alto contraste em relação à cor do código do animal. Antes do experimento, os animais devem ser aclimatados à sua cama por pelo menos 24 horas.

Para preparar o ambiente de teste, comece instalando uma câmera de vídeo com capacidade de visão noturna e com pelo menos 120 gigabytes de memória acima da área de gravação. O ambiente não deve ter nenhum som ambiente acima de 70 decibéis. Se houver ruídos de fundo intermitentes inevitáveis, utilize um gerador de ruído branco para abafar esses sons.

É igualmente importante que as condições ambientais da sala de teste sejam semelhantes às condições normais de alojamento do animal. Antes de posicionar novos sujeitos, limpe a área de gravação e cubra a superfície com papel de açougueiro ou papel para bancada de laboratório de cor semelhante à da cama do viveiro. Em seguida, posicione divisórias opacas de plástico de meio centímetro de espessura. Sobre a superfície de teste, as divisórias devem ter cor semelhante à da cama e estar limpas.

Agora leve os camundongos à área de teste e posicione as gaiolas entre os divisores. Para facilitar a análise, posicione sempre as gaiolas da mesma maneira. Para o teste, cubra as gaiolas com plexiglás transparente de um quarto de polegada de espessura.

O acrílico precisa de pelo menos 11 furos de um quarto de polegada para proporcionar ventilação adequada. Em seguida, monte luminárias com abraçadeiras para aquecedor e lâmpadas vermelhas para iluminar as gaiolas. Agora, posicione centralmente a visão da câmera sobre as gaiolas, sem exceder a capacidade do sistema de rastreamento de vídeo.

Este sistema é limitado ao rastreamento de oito camundongos em tempo real. Agora, observando a exibição da câmera de vídeo, ajuste o ângulo e a posição das luzes para remover reflexos ou reflexões nos tampos das gaiolas de plexiglass. Obter uma visão limpa dos camundongos, livre de artefatos visuais, é a etapa mais crítica para obter bons resultados.

Inclua sempre tanto os indivíduos experimentais quanto os controles em cada grupo para garantir que os possíveis efeitos das diferenças temporais na LMA sejam minimizados. Pouco antes do teste, remova qualquer material de ninhada e enriquecimento dos gaiolas, pois eles podem obstruir a visão do camundongo. No vídeo, inicie a gravação com uma lousa que identifique as informações experimentais relevantes.

Para garantir a identificação correta do vídeo, utilize o cronômetro na tela da câmera para acompanhar a duração do teste e permaneça fora do campo de visão do animal durante a gravação. Ao finalizar o teste, devolva todos os materiais a cada gaiola.

Se os animais forem testados novamente, restabeleça o acesso a comida e água entre os testes. Armazene as gravações de vídeo da sessão de teste em uma mídia de arquivo compatível com o sistema de rastreamento de vídeo, como um disco rígido. No sistema de rastreamento de vídeo, analise os vídeos em tempo real. Inicialmente, selecione todo o piso da gaiola como a região de interesse ou ROI para o rastreamento.

Para análises avançadas, como a avaliação de impostos Figma, crie múltiplas ROI intra jaula para estudos de alto rendimento. Analise todas as jaulas dentro do vídeo simultaneamente com ROI individuais para o piso de cada jaula. Configure o VTS para calcular a distância total, a velocidade dos movimentos e a duração dos movimentos; após os cálculos serem realizados, exporte os dados para um arquivo de planilha para armazenamento e análise adicional.

O teste de longo prazo é realizado da mesma forma que o teste de curto prazo. No entanto, exige uma gaiola modificada com um novo ponto de acesso para alimento e água. Primeiro, corte um orifício de 5,5 centímetros de diâmetro na parede curta de uma gaiola padrão.

Em seguida, corte aberturas de meio polegada na tela de aço galvanizado de um quarto de polegada e alise a tela para remover bordas afiadas usando a própria tela, construa um funil externo para pellets de alimento que possa se conectar à tela sobre a abertura. A seguir, adicione furos para rebites. Em seguida, cubra o orifício na gaiola com a tela e o funil acoplado utilizando rebites de alumínio e arruelas de aço inoxidável.

Para fornecer hidratação, construa um bebedouro a partir de um tubo cônico padrão de 50 mililitros e uma rolha de borracha com um furo ampliado. Isso permitirá a inserção de um tubo bebedor sem gotejamento. Fixe este bebedouro à gaiola.

Usando fita de velcro, o tubo de bebedouro deve ser inserido através da abertura coberta por malha. Agora, enquanto a gaiola estiver coberta pela tampa de plexiglás, os camundongos mantêm acesso a alimento e água seguindo os mesmos procedimentos descritos para o ensaio de locomoção de curta duração. O ensaio de longa duração geralmente dura 12 horas ou pelo período correspondente à fase atual do ciclo claro-escuro.

O teste de atividade locomotora de longo prazo geralmente é analisado em tempo real, sem a realização de gravação em vídeo. No entanto, pode-se fazer uma gravação utilizando uma câmera secundária ou por meio de um gravador de DVD conectado à câmera principal. Os camundongos podem ser testados pelo tempo que as capacidades do sistema de rastreamento de vídeo permitirem, e, como nos testes de curto prazo, apenas o material de enriquecimento iluminado pelo ninho é removido da gaiola, não o substrato de sabugo de milho ou serragem.

No STV, configure o sistema de rastreamento de vídeo para análise em tempo real. Ajuste a ROI de rastreamento para abranger todo o piso de cada gaiola que está sendo gravada. Da mesma forma que no ensaio de curto prazo, configure o sistema para calcular a distância total percorrida, a velocidade de movimento e a duração do movimento.

Em seguida, após a análise, exporte os dados para uma planilha para armazenamento e análise utilizando ensaios locomotores de curto prazo repetidos. Verificou-se que, após a injeção de lipopolissacarídeo, camundongos mantidos em gaiolas individualmente ventiladas ou IVC se recuperaram da perda de LMA de curto prazo provocada pela injeção mais rapidamente do que camundongos mantidos em gaiolas em ambiente ambiente ou EC. Embora a perda inicial de atividade locomotora seja semelhante entre os grupos injetados com LPS, a recuperação da atividade locomotora basal é mais rápida em camundongos mantidos em IVC, assim como a velocidade e a duração dos movimentos.

Nesta análise, a detecção de movimento de dois centímetros por segundo iniciou o rastreamento e 1,75 centímetro por segundo interrompeu o rastreamento, utilizando as variáveis de detecção. Foi realizado um pequeno teste de locomoção ao longo de dois ciclos consecutivos de atividade de 12 horas. Em camundongos normais, não foi encontrada diferença significativa na distância percorrida, na velocidade dos movimentos ou na duração dos movimentos.

Se a tendência de ausência de diferença mensurável se mantiver ao repetir o procedimento com um tamanho amostral maior, os dados sugeririam que o ensaio poderia ser usado para substituir os transmissores implantados utilizados em ensaios locomotores de longo prazo. Ao realizar este procedimento, é importante ter especial atenção às condições de alojamento pré-experimentais. Todos os animais experimentais e de controle devem estar em condições ambientais semelhantes, especialmente em relação ao ciclo de luz, temperatura ambiente e umidade relativa.

Além disso, sua exposição a estímulos de ruído e odor deve ser minimizada após este procedimento. Outros métodos, como o teste do quatro nadadores, podem ser utilizados para responder perguntas adicionais, como se o tratamento de um determinado experimento resulta em comportamento semelhante à depressão sem afetar a atividade locomotora geral.