Simultânea de pré e pós-sináptica gravação eletrofisiológico de Xenopus Nervo músculo-Co-culturas

O objetivo geral deste procedimento é obter culturas primárias de neurônios espinhais sinapticamente acoplados e células musculares de embriões de xenopus. Isso é conseguido primeiro induzindo a reprodução em xenopus por injeção de coriônico humano em atropina em sapos machos e fêmeas e coletando ovos fertilizados. O segundo passo é remover a camada gelatinosa e fatel e as membranas dos embriões do estágio 22.

Em seguida, os neurônios e músculos espinhais são isolados dos embriões e a pele é removida e descartada. A etapa final é colocar as células isoladas em placas de cultura e permitir a formação de junções neuromusculares funcionais. Em última análise, as conexões sinápticas funcionais podem ser demonstradas com gravações simultâneas de patch clamp emparelhado de neurônios e células musculares em cultura.

A beleza dessa técnica é que ela produz uma preparação sináptica de vertebrados facilmente acessível. Ele pode ser usado para monitorar a liberação de neurotransmissores com registros eletrofisiológicos pós-sinápticos e, ao mesmo tempo, medir a ocorrência de íons pré-sinápticos. Além disso, os métodos são claros e diretos, não exigindo nenhum equipamento especial além de um microscópio de dissecação, e as culturas de so podem ser armazenadas em temperatura ambiente em um meio de cultura simples.

Essa preparação pode ser útil para responder a questões-chave no campo da fisiologia sináptica, incluindo como os eventos pré-sinápticos, bioquímicos e biofísicos são associados à liberação de neurotransmissores. Além disso, também é útil para o estudo da sinaptogênese da neuromodulação e da plasticidade sináptica Para iniciar este procedimento, prepare as soluções necessárias de acordo com o manuscrito que o acompanha. Em seguida, fabrique pelo menos duas ferramentas de microdissecação colando um alfinete de minuchinho na extremidade de uma pipeta de pastel de vidro.

Com cola acrílica Sano, deixe a ponta afiada do pino se estender além da extremidade da pipeta aproximadamente 0,5 centímetros. Dois dias antes de preparar as culturas, identifique um par pronto para reprodução de XUS observando uma garra avermelhada proeminente aika na fêmea e pigmentação escura na superfície plana das patas dianteiras do macho. Em seguida, pegue cada sapo e segure-o com o lado ventral voltado para baixo em uma pia com a rede para que ele possa escapar.

Injete um mililitro de HCG através da rede e por via subcutânea em um dos sacos linfáticos dorsais para garantir que os animais não pisoteiam os ovos recém-postos e fertilizados. Instale um piso blindado com um tamanho de malha de meia polegada instalado de uma a duas polegadas no fundo do tanque. Em seguida, coloque o casal reprodutor em um tanque coberto de 10 galões de água.

Deixe as rãs intactas por 12 a 48 horas até que os ovos fertilizados sejam observados no chão abaixo da tela. Em seguida, retire os animais do tanque, mas deixe os ovos intactos por pelo menos mais 24 horas. Este par de sapos pode ser reproduzido após seis semanas.

Em seguida, solte os embriões do fundo do tanque e transfira-os para quatro ou cinco placas de cultura de 60 por 15 milímetros contendo 10% de solução salina. Classifique os embriões por estágio de acordo com o esquema de novos embriões cupê e Faber que são lisos na aparência com modelagem clara, marrom e branca como os da esquerda são ideais. Por outro lado, os embriões que apresentam grandes manchas pretas ou brancas, como os da direita, geralmente não são saudáveis e inutilizáveis.

Dentro de uma capela de fluxo laminar, rotule e encha aproximadamente até a metade de placas de cultura estéreis de 360 por 15 milímetros com solução salina a 10% e uma com CMF. Usando uma pipeta de pastier de vidro estéril, transfira de cinco a 10, estágio 22 a 24 embriões para um dos pratos contendo solução salina a 10% com os oito de um microscópio de dissecação de zoom estéreo dentro do exaustor, remova a camada gelatinosa e a membrana viel de cada embrião usando dois pares de pinças estéreis. Lave os embriões nus passando-os um de cada vez pelos dois pratos restantes de solução salina a 10% e, finalmente, no prato contendo CMF.

Em seguida, segure cada embrião suavemente, mas com firmeza, com um par de pinças e use a ferramenta de microdissecção para remover o tubo neural e os miótomos associados, que estão localizados na face mais dorsal do animal. Faça isso fazendo três fatias, uma em cada extremidade da localização do tubo neural e uma terceira logo ventral a ele. Em seguida, mova cada miótomo do tubo neural dissecado para uma parte limpa do prato, longe dos grânulos de gema e outros detritos.

Após cerca de 15 minutos em CMF, use a pinça para retirar a pele pigmentada do tecido dissecado e descarte a pele. Após mais 30 a 60 minutos, as células formarão uma pilha de areia à medida que se dissociarem umas das outras. Neste procedimento, descongele um tubo de 10 mililitros de meio de cultura, em seguida a 70 microlitros de ITS em 35 nanogramas por mililitro, etiqueta BDNF e encha as placas de cultura estéreis de 35 milímetros aproximadamente até a metade com meio de cultura L 15.

Use uma placa de cultura para cada embrião que você dissecou. Para fabricar uma pipeta de revestimento, segure as duas extremidades de uma pipeta de pastel de vidro e coloque a parte cônica sobre uma chama. Em seguida, separe as pontas em cerca de 10 centímetros.

Posteriormente, quebre a extremidade para ceder à ponta de aproximadamente 0,2 milímetros. Depois, use a pipeta de chapeamento para sugar a pilha de areia de um embrião. Tenha cuidado para minimizar a quantidade de solução extraída.

Em seguida, expulse as células para o fundo de uma placa de cultura e coloque-as em várias linhas. Em seguida, deixe os pratos das células revestidos intactos por pelo menos 15 minutos para permitir que as células se prendam ao prato. Após 12 a 24 horas em cultura, as células plaqueadas desenvolverão características morfológicas distintas.

Por exemplo, as células musculares tornam-se fusiformes e os neurônios espinhais desenvolvem processos longos. O contato sináptico funcional entre urato, varicosidades e células musculares pode ser confirmado com registros eletrofisiológicos emparelhados simultâneos. Para fazer isso, prepare dois eletrodos de patch para registro, um para a varicosidade pré-sináptica e outro para a célula muscular.

Em seguida, encha o eletrodo pré-sináptico com solução contendo infoterina e o eletrodo pós-sináptico com solução interna de potássio. Depois disso, substitua a mídia no prato de cultura por NFR. Em seguida, transfira-o para um microscópio invertido equipado com óptica de contraste facial, tampe a varicosidade pré-sináptica com o eletrodo contendo anfotericina e a célula muscular pós-sináptica com o outro eletrodo para confirmar a funcionalidade da sinapse, despolarize a varicosidade com um amplificador de patch clamp e observe as correntes pré-sinápticas e pós-sinápticas simultâneas.

Esta figura mostra uma visão de poder de cinco x das células e da cultura imediatamente após o plaqueamento, e esta é a mesma cultura em 40 x. Aqui está a junção neuromuscular em cultura, que mostra o soma neuronal, a célula muscular pré-sináptica, varicosa e pós-sináptica. Aqui são mostradas as correntes pré-sinápticas e pós-sinápticas.

Em resposta à aplicação de etapas de tensão incremental de 10 milivolts apresentadas à varicosidade pré-sináptica de menos 30 milivolts a mais 40 milivolts, o potencial de retenção para ambas as células foi de menos 70 milivolts Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em cerca de duas horas. As culturas de células viáveis podem ser obtidas em até 24 horas e podem ser mantidas por vários dias. Esta preparação já está em uso há vários anos, ajudando a explicar algumas das propriedades fundamentais da transmissão neuromuscular.

Esperamos que este vídeo permita a continuação da descoberta, ajudando os investigadores a se familiarizarem com essa técnica poderosa e simples.