Ex utero Eletroporação e Explantes hemisfério inteiro: um método simples Experimental de Estudos do Desenvolvimento Cortical Precoce

O objetivo geral deste procedimento é preparar um explante de hemisfério cerebral inteiro para o estudo do desenvolvimento cortical inicial. Isso é realizado primeiramente coletando embriões de camundongo no dia embrionário 13. Em seguida, injeta-se a mistura de DNA plasmidial no ventrículo cerebral e realiza-se uma eletroporação ex utero.

Em seguida, prepare um explante de hemisfério inteiro do embrião eletroporado. O passo final é fixar e seccionar o explante de hemisfério inteiro para análises histológicas. Em última instância, a consequência de mutação ou exposição a toxinas no desenvolvimento de neurônios corticais pode ser avaliada por meio de análises imunohistológicas de neurônios que expressam GFP.

Meu nome é Eric Olson. Sou do Departamento de Neurociência e Fisiologia da SUNY Upstate Medical University em Syracuse, e hoje vamos mostrar um método que desenvolvemos chamado explante de hemisfério inteiro X. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como o explante de fatias, é que os explantes de hemisfério inteiro X são simples de preparar e permitem dois dias de crescimento organotípico.

O método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neurodesenvolvimento, como a forma pela qual uma mutação ou toxina específica interrompe o desenvolvimento cortical inicial. Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois o preparo do explante de hemisfério inteiro sem danificar as meninges pode exigir alguma prática. A demonstração visual deste método é essencial, já que os passos de dissecação e transferência do explante são difíceis de aprender devido à sensibilidade do tecido à perturbação mecânica.

Demonstrará o procedimento a Dra. Theresa Ozzi, pós-doutoranda no meu laboratório. Para este protocolo, utilize um kit comercialmente disponível para purificar os plasmídeos. Prepare o DNA plasmidial a 0,33 miligramas por mililitro em água e adicione corante azul de poliacrilamida como marcador de injeção em aproximadamente 0,02% peso por volume. Desinfete sempre os instrumentos cirúrgicos, o espaço de trabalho e o microscópio.

Com etanol a 70%, em seguida sacrifica um número necessário de matrizes Swiss Webster no dia E13 por inalação de dióxido de carbono. Quando os embriões forem removidos, coloque-os em uma placa de 10 centímetros com HBSS gelado, mantida sob refrigeração. Disseque cuidadosamente cada embrião das membranas extraembrionárias circundantes.

Agora, transfira cada embrião individualmente para um recipiente limpo com HBSS gelado. Usando uma seringa Hamilton, injete dois a três microlitros do DNA preparado no ventrículo do hemisfério cerebral esquerdo. Não injete no interior ou próximo à área cortical destinada à análise futura.

Para eletroporar o DNA, segure o embrião suavemente com pinças e coloque levemente a lâmina positiva do eletrodo em formato de pinça sobre a linha média dorsal da cabeça. Coloque levemente a lâmina negativa sob o queixo do embrião. Execute um programa com cinco pulsos de 30 volts, cada um com 50 milissegundos, em intervalos de um segundo, utilizando um modelo BTX 830 ou outros sistemas que podem ser configurados de acordo com as instruções do fabricante.

Retorne cada embrião para o HBSS gelado e prossiga com o preparo do hemisfério inteiro de Explan sob um microscópio de dissecação, utilizando duas pinças de ourives número cinco. Remova a pele e o crânio cartilaginoso da cabeça do embrião. Em seguida, deslize as pinças sob o cérebro.

Para remover o cérebro intacto do crânio, dissecar o hemisfério eletroporado, incluindo o tecido do mesencéfalo anexo. Tenha cuidado para não danificar as meninges que recobrem o hemisfério cortical dissecado. Descobrimos que a etapa mais difícil de dominar é a dissecção e remoção do hemisfério eletroporado sem danificar as meninges.

Uma vez dissecado, transfira cada hemisfério para cinco mililitros de HBSS gelado usando uma ponta de pipeta de um mililitro alargada. Se necessário, os embriões podem ser mantidos em poços separados de uma placa de cultura tecidual de 12 poços. Em seguida, transfira suavemente até seis hemisférios para uma cultura revestida com colágeno de 24 milímetros.

Insira e posicione com o lado medial voltado para baixo. Agora, preencha um poço de 35 milímetros de uma placa de seis poços com 2,7 mililitros de meio suplementado. Remova qualquer excesso de HBSS do inserto e coloque o inserto no poço; com uma pipeta, adicione algumas gotas do meio do poço sobre a parte superior de cada x explan.

Não aumente o volume do meio. Descobrimos que é essencial colocar algumas gotas de meio de cultura sobre o explante X, de modo que os explantes X não fiquem completamente cobertos pelo meio. Isso pode significar adicionar até 400 microlitros aos 2,7 mililitros de meio sobre o explante X.

Transfira a placa para uma câmara Billups-Rothenberg que contenha um recipiente com água para umidificação e que tenha sido infundida com 95% de oxigênio por pelo menos um minuto. Feche hermeticamente a câmara e desconecte o tubo de fornecimento de gás. Coloque a câmara em uma incubadora a 37 °C por dois dias, período em que a divisão de pré-implantes terá ocorrido.

Em preparação. Prepare placas para inclusão do explan. Prepare uma solução de gelatina de pele de bezerro a 10% a 60 graus Celsius.

Uma vez solubilizado, despeje aproximadamente 10 mililitros da solução em um recipiente de 10 centímetros. Mantenha a solução restante a 60 graus Celsius para uso posterior. Deixe as placas solidificarem por meia hora, se necessário.

Eles podem ser armazenados a quatro graus Celsius por vários dias, mas devem ser aquecidos à temperatura ambiente antes do uso. No dia da fixação, em uma capela de exaustão, prepare o Pagano, o fixador e a solução Pagano sem fixador. Aqueça a solução de fixação a 37 graus Celsius.

Retire os explantes do incubador cuidadosamente e rapidamente, sem perturbar os tecidos. Remova a maior parte do meio e substitua por cinco mililitros de fixador aquecido. Certifique-se de que cada explante esteja completamente submerso.

Fixe os tecidos por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, remova o fixador e substitua pela solução de Pagano. Sem fixador.

Adicione algumas gotas de azida de sódio 10% em cada poço. Os tecidos podem agora ser armazenados a quatro graus Celsius até serem embutidos em uma placa de inclusão. Desenhe uma grade no fundo da placa com a ajuda de uma régua.

Prepare quadrados de dois a três centímetros. Transfira os explantes individuais para a placa de inclusão. Remova qualquer solução residual com pipeta e cubra cada explante com solução morna de gelatina a 10%.

Deixe endurecer. Após o completo endurecimento, adicione lentamente mais solução de gelatina até que cada explante fique totalmente envolvido. Evite derreter o suporte, o que pode ocorrer se for adicionada demasiada gelatina de uma só vez.

Agora, deixe a gelatina endurecer por cerca de uma hora. Após o endurecimento, o explante individual pode ser cortado em pequenos blocos de gelatina antes da secção. É importante pós-fixar os blocos em fixador de Pagano por um ou dois dias.

Ao realizar os cortes, posicione os explantes com o bulbo olfatório voltado para cima e seccione no plano coronal com espessura de 100 micrômetros. Colete os cortes em PBS gelado com 0,1% de azida de sódio.

Armazene as seções a quatro graus Celsius até que possam ser coradas utilizando a técnica descrita. Explantes completos de hemisfério foram preparados no E 13 antes da divisão preliminar. Na neocórtex dorsal.

O tecido continha um transgene que marca neurônios imaturos da linhagem cortical excitatória. Explantes corticais da mesma ninhada foram fixados por gotejamento sequencialmente ao longo de um período de dois dias in vitro e processados para análise histológica subsequente. No ponto inicial de análise, no DIV zero, a divisão pré-plântula ainda não ocorreu no campo um a um.DIV.

O CP tornou-se aparente e continuou a crescer até 2D IV. Assim, os explantes de hemisfério inteiro cultivados inicialmente no E 13 sustentaram por dois dias a maturação do córtex cerebral e capturaram a divisão do prelata no neocórtex dorsal para confirmar o desenvolvimento histológico normal nessa região. Os explantes de 2D IV foram imunomarcados para sulfato de condroitina, proteoglicanos e componentes da matriz extracelular. Duas faixas de imunorreatividade no córtex dorsal indicaram a divisão adequada do PPP em MZ e SP durante o período de cultura in vitro.

O PP foi dividido por seis neurônios corticais que expressam CTIP2 e TBR1. O padrão de imunomarcação desses marcadores confirma a expressão adequada desses fatores de transcrição no cp recém-formado. Conjuntamente, essas análises confirmam o desenvolvimento cortical precoce organotípico em todo o hemisfério exposto, utilizando todo o protocolo descrito; a ventrículo esquerdo de embriões E13 intactos foi injetado.

Pode-se observar a expressão de GFP eletroporada e processada a partir de precursores neuronais na vz. Embora células intensamente expressando GFP tenham sido observadas na ZI e cp, importantes neurônios positivos para GFP, marcados por setas, foram observados no topo do cp em formação, com dendritos e axônios emergentes. A camada distinta na interface entre o cp e a MZ indica migração, parada e laminação adequadas.

Os dendritos se estenderam até a ZM, enquanto os axônios corticougais se estenderam abaixo da PC e para dentro da ZI. As células em diferenciação eram células GFP positivas em diferentes estados de maturidade, incluindo neurônios com morfologia bipolar justapostos a fibras glias radiais e, abaixo delas, neurônios multipolares na ZI. Os dendritos também se estenderam até a ZM, onde a proteína da ECM reelin está adequadamente imunolocalizada.

Assim, as condições de eletroporação e de explante permitem o desenvolvimento normal de neurônios corticais. Como esperado, neurônios positivos para GFP pós-mitóticos colonizaram o cp em formação. Dessa forma, o protocolo pode direcionar de forma confiável neurônios corticais L seis para estudos de sua migração e maturação.

O uso extensivo deste procedimento resultou em uma taxa de sucesso de 79%. 195 de 248 tentativas foram adequadas para imagem e análise. Metade das falhas ocorreu devido à ausência de expressão de GFP ou ao alvo errado de GFP. Uma vez dominado.

Essa técnica pode ser realizada em 90 minutos se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de praticar as dissecações para que os hemisférios eletroporados possam ser cultivados com meninges intactas após este procedimento. Outros métodos, como a microscopia de lapso de tempo, podem ser realizados com o objetivo de responder perguntas adicionais, como a forma pela qual mutações de interesse interrompem a migração neuronal ou a agênese dendrítica.