Revestimentos de grafeno para implantes biomédicos

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um método para revestir nitinol de liga de memória de formato metálico com grafeno para melhorar a compatibilidade hemo em materiais de implantes de contato com o sangue. Isso é feito primeiro cultivando grafeno em folhas de cobre usando deposição química de vapor. O segundo passo é gravar as folhas de cobre e transferir o grafeno preparado para substratos de nitinol.

Em seguida, os substratos de nitinol revestidos com grafeno são usados para cultivar células endoteliais e células musculares lisas. Para quantificar a compatibilidade com citolidade, outro ensaio é verificar a compatibilidade hemográfica codificando ambas as proteínas, fibrinogênio e albumina nos substratos de nitinol revestidos com grafeno. Em última análise, a espectroscopia de microramina, os ensaios de citotoxicidade in vitro de microscopia confocal e a análise de proteína de página SDS são usados para mostrar o revestimento de grafeno bem-sucedido, morfologia celular aprimorada, viabilidade celular aprimorada e melhor compatibilidade hemográfica.

A principal vantagem desta técnica ou de técnicas existentes, como o revestimento de polímero, é que os revestimentos de grafeno são extremamente duráveis e resistentes à corrosão. As implicações desta técnica se estendem à melhoria da origem das tecnologias de stent porque se espera que as propriedades inerentes do material do grafeno reduzam a absorção de proteínas e reduzam a ativação de fatores de coagulação devido à mudança de confirmação de proteínas. Embora esse método possa fornecer informações sobre os stents de nitinol revestidos com grafeno também podem ser usados para outros sistemas, como válvulas cardíacas ou cateteres.

Para começar, coloque folhas de cobre de um centímetro por um centímetro em um forno de tubo de quartzo de uma polegada e aqueça a 1000 graus Celsius na presença de 50 SCCM de hidrogênio e 450 SCC CM de Argonne. Em seguida, introduza um e quatro SCCM de metano no forno de 1000 graus Celsius em diferentes taxas de fluxo por 20 a 30 minutos. Resfrie as amostras à temperatura ambiente dentro do forno sob o fluxo de hidrogênio, argônio e metano.

Depois de remover as amostras do forno, corte-as em quadrados de 4,5 milímetros e use PMMA diluído com 4% de anolis para revestir as folhas de cobre a 4.000 RPM, seguido de um tratamento térmico por cinco minutos a 150 graus Celsius. Grave a folha de cobre usando a gravação CE 100 até que a folha de cobre esteja totalmente gravada. Enxágüe em ácido clorídrico a 10% por 10 minutos e depois em água deionizada por 10 minutos.

Para obter a amostra de PMMA de grafeno, transfira as amostras de grafeno para substratos de nitinol de 4,5 milímetros quadrados. Em seguida, ail a 450 graus Celsius em 300 SCCM Argônio e 700 SCCM hidrogênio por duas horas. Para remover o PMMA, finalmente lave os substratos de nitinol com acetona para dissolver o PMMA residual para obter a amostra de grafeno-níquel titânio

Para iniciar os testes de toxicidade, adicione nitinol puro um SCCM ou quatro substratos de nitinol de grafeno SCCM a placas de 96 poços onde o SCCM declarado corresponde ao fluxo de metano usado no crescimento de deposição de vapor químico de grafeno. Em seguida, semeie células endoteliais aórticas de ratos em 10 a quinta células por poço em alguns dos poços contendo nitinol puro um SCCM ou quatro SCCM. Substratos de grafeno nitinol, células musculares lisas aórticas de rato semente de maneira semelhante em um conjunto diferente de poços.

Cultive as células por três dias ou sete dias em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono trocando meios a cada dois dias. No final do tempo, remova o meio dos poços contendo células musculares lisas e adicione meio fresco contendo 0,5 miligramas por mililitro de MTT a cada um. Bem, incube as células por mais três horas.

Em seguida, remova suavemente o meio e adicione 100 microlitros de dimetilsulfóxido a cada poço. Depois de permitir 10 minutos para que os cristais de MTT se dissolvam, transfira a solução para outra placa de poço. Para o ensaio MTS, remova o meio dos poços contendo células endoteliais no ponto final do tempo.

Substitua por 120 microlitros de solução MTS e incube por três horas. Em seguida, transfira o conteúdo do poço para uma nova placa. Leia o absorvente a 490 nanômetros e determine a viabilidade percentual normalizando a absorbância para a absorbância média da amostra de nitinol intocada.

Repita esta etapa pelo menos cinco vezes para cada amostra. Para imagens confocais de células musculares lisas da aorta de ratos, coloque os substratos em uma lâmina de oito câmaras, deixando uma câmara vazia como controle. Em seguida, semeie as células em todas as câmaras a 25.000 células por câmara e incube por três dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Depois de remover o meio das lâminas, cole as células no substrato com 4% de formaldeído em tampão PBS por 20 minutos. Lave com PBS e depois permeie com 0,1% Triton X por um minuto. Após a lavagem com PBS, adicione 100 microlitros da solução LOR 4 88 PHIN a 1,9 mililitros de tampão PBS.

Para visualizar o acton, core as células com 250 microlitros de LOR 4 88 Phin por 45 minutos e, em seguida, lave duas vezes com tampão PBS. Em seguida, core os núcleos com um meio de montagem fluorescente contendo dpi. Colete imagens confocais usando um ti confocal Nikon.

Antes de iniciar os experimentos de absorção de proteína de albumina e fibrinogênio, meça as dimensões do substrato com paquímetros. Faça três medições para cada lado das amostras aproximadamente quadradas e média. Para obter o comprimento e a largura, coloque a amostra de nitinol intocada, a amostra de nitinol de grafeno SCCM e a amostra de nitinol de grafeno SCCM em duas 12.

As placas de poço adicionam tampão PBS contendo um miligrama por mililitro de albumina. Adicione a temperatura ambiente a uma das placas e incube por três horas separadamente. Incubar os três tipos de amostras com tampão PBS contendo um miligrama por mililitro.

Fibrinogênio em temperatura ambiente por três horas após a lavagem das amostras com PBS, combine as amostras semelhantes em um tubo de microcentrífuga com 200 microlitros de tampão de amostra redutor e ferva por cinco minutos. Dilua as amostras em uma proporção de um a nove volumes para volume de tampão T glycine SDS para água deionizada e passe por um gel de eletroforese de poliacrilamida de quatro a 15% tris a 90 volts por 100 minutos. Diluir a solução de estoque vermelho spro na proporção de um para 5.000 em ácido acético a 7,5%.

Em seguida, core os géis por 60 minutos com a solução diluída de spro red. Embrulhe em papel alumínio para proteger o vermelho spro de géis de imagem de luz usando um Fluor chem SP e quantifique a intensidade fluorescente usando o software Image J. Em seguida, normalize a intensidade fluorescente de cada amostra pela área total do substrato e compare a absorção de fibrinogênio com a absorção de albumina.

O método de deposição química de vapor produziu amostras de grafeno policristalino que imitam grãos de cristal de cobre A espectroscopia Ramen foi usada para confirmar a presença de grafeno monocamada em uma amostra SCCM e quatro SCCM. A única amostra SCCM exibe uma banda GPR intensa, indicando a natureza monocamada do grafeno preparado. Em contraste, a amostra de quatro SCCM mostra uma banda GPR relativamente mais fraca, o que confirma a presença de algumas camadas de grafeno retratadas aqui é uma imagem de microscopia de força atômica de grafeno transferido para substratos de nitinol.

Medições detalhadas da amostra produziram um valor de rugosidade superficial de aproximadamente cinco nanômetros. Mostrado. Aqui estão as imagens de microscopia óptica confocal para células musculares lisas cultivadas em uma lâmina de vidro controlada em substratos de nitinol puro em um substrato de nitinol de grafeno SCCM e em quatro substratos de nitinol de grafeno SCCM. As células são densas e esféricas em ambas as superfícies de grafeno nitinol, o que demonstra melhor morfologia celular.

Os ensaios MTT e MTS mostram que um e quatro substratos de nitinol de grafeno SCCM não exibem uma diferença significativa na viabilidade das células musculares lisas em relação ao nitinol puro. Os ensaios MTS mostram que a viabilidade celular de três dias para as células endoteliais não foi significativamente diferente dos controles. As imagens de microscopia eletrônica de varredura mostram que as células endoteliais cultivadas em substratos de nitinol puro são esparsas e alongadas, enquanto são elipsoidais e densas em um e quatro substratos de nitinol de grafeno SCCM.

Esses resultados demonstram que os revestimentos de grafeno levam a uma melhor morfologia celular esférica das células endoteliais, uma SCCM e quatro amostras de nitinol de grafeno SCCM exibem baixa proporção de albumina de fibrinogênio em relação à amostra de nitinol prístina, sugerindo melhor compatibilidade hemográfica decorrente do grafeno. O equilíbrio do nível de Fermi é mostrado pelo diagrama de nível de energia para fibrinogênio e a densidade de estados eletrônicos para grafeno. Uma transferência de elétrons do fibrinogênio para o grafeno nitinol só é possível a partir dos estados eletrônicos ocupados da molécula de fibrinogênio para estados eletrônicos vazios de grafeno nitinol no mesmo nível de energia.

Tanto o grafeno mono quanto o grafeno de poucas camadas são semimetais à temperatura ambiente com baixa densidade eletrônica no nível de fúria, o que resulta em uma fraca transferência de carga do fibrinogênio para o grafeno. O grafeno não exibe nenhuma alteração na forma ou frequência da linha de banda GB, indicando transferência de carga fraca das proteínas plasmáticas. Os picos complicados D obtidos a partir do ajuste da curva são mostrados em preto para demonstrar a utilidade e viabilidade do grafeno como revestimento de implante.

Uma moeda de cobre revestida de grafeno foi exposta a 5% de peróxido de hidrogênio. A porção revestida de grafeno da moeda permaneceu inalterada enquanto a parte descoberta foi descolorida pela solução de peróxido de hidrogênio. Além disso, o grafeno nitinol imerso em ácido nítrico a 70% não apresentou alteração na frequência da banda GB, confirmando que o revestimento de grafeno é extremamente durável.

Além disso, o revestimento de grafeno em grafeno nitinol foi reduzido à taxa X do cobre subjacente, indicando a impermeabilidade das membranas de grafeno. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como transferir grafeno e implantes biomédicos para melhorar sua biocompatibilidade.