Name: Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-24T18:10:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar cardiomiócitos de camundongo adulto usando perfusão Langendorff. Este método permite visualizar contração e manuseio de cálcio, além de transfecção viral para manipulação gênica em pesquisa cardiovascular.

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<ol><li>Chlopcikova, S., Psotová, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+rat+cardiomyocytes-a+model+for+the+study+of+morphological%2C+biochemical+and+electrophysiological+characteristics+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Papers%22%5BJournal%5D)">Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart.</a> Biomedical Papers. , (2001).</li>
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<li>Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Na%2B%2FCa2%2B-exchanger+overexpression+on+excitation-contraction+coupling+in+adult+rabbit+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).</li>
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<li>Splawski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+of+SCN5A+sodium+channel+implicated+in+risk+of+cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia.</a> Science. 297, 1333-1336 (2002).</li>
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<li>Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+mechanical+pulse+of+single+cardiomyocytes+with+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope.</a> European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Neste relatório, nós descrevemos as técnicas necessárias para o isolamento do sucesso e da cultura do adulto CMs do coração mouse. A nossa técnica permite o estudo subsequente da função LV e excitabilidade utilizando os métodos descritos acima. O parâmetro fundamental para o estudo da funcionalidade do adulto CMs é a saúde ea qualidade do CMs isoladas. Como descrito acima, as nossas técnicas de permitir um elevado rendimento de células funcionais que são susceptíveis a manipulação da expressão de genes usando as infecçõ...

Modelos murinos de doenças cardiovasculares têm servido como ferramentas eficazes para elucidar os mecanismos fundamentais de doença 1,2, bem como para identificar potenciais alvos terapêuticos 1,3. Em particular, o uso de ambos os modelos de murino de doença cardíaca adquirida (tais como sobrecarga de volume) 4,5 e modelos de ratinhos transgénicos têm avanços na compreensão da doença cardíaca 6-8. A utilização de técnicas de cultura celular para estudar cascatas de sinalização 3,9,10 e alterações em proteínas individuais que estão subjacentes a excitabilidade celular e o acoplamento de excitação-contracção no coração 11-13 ao nível de uma única célula foram complementados os modelos in vivo de ratinho. No entanto, a falta de linhas celulares adequadas que reflectem a estrutura e função de adulto CM tem sido uma limitação significativa. Os investigadores têm tentado ultrapassar esta estudando proteínas individuais, tais como a canais de iões, em sistemas de expressão heterólogos <sup&gt; 14, e, embora estes estudos nos forneceu informações úteis em termos de biofísica canais iônicos ou tráfico de proteína, a representação inadequada do microambiente nativo de CMs é uma limitação significativa. Em segundo lugar, já que a maioria dessas células heterólogas não tem um aparelho contrátil maduro, não foi possível estudar a função contrátil e da complexa interação entre excitabilidade celular e contração. Por esse motivo, os investigadores voltaram-se para as culturas de células cardíacas primárias para muitos dos seus estudos funcionais in vitro. Finalmente, os estudos de cardiomiócitos isolados permitir a avaliação da função contrátil, sem os fatores de confusão de preparação multicelular, incluindo o efeito de cicatriz ou fibrose e orientação das fibras. Cardiomiócitos ventriculares de rato neonatal primárias (NRVMs) são relativamente fáceis de cultura, podem ser infectadas com adenovirus e lentivírus para manipular a expressão do gene 15, umaª Assim, foram utilizadas com sucesso 1, mas têm limitações próprias. Embora eles fornecem um microambiente fisiológico 1 e tem sido o carro-chefe do campo de sinalização, diferenças substanciais entre a morfologia ea organização subcelular de NRVMs e cardiomyoctyes adultos torná-los um modelo inadequado para a investigação de fluxos iônicos e acoplamento excitação-contração no coração de adultos . Mais notavelmente NRVMs falta uma t-tubular subsistema definitiva 4. Desde Ca 2 + fluxo e dinâmica é criticamente dependente maduro t-tubular e retículo sarcoplasmático (RS) estrutura 6, Ca 2 + dinâmica e estudos funcionais da contratilidade cardíaca em NRVMs não são um reflexo preciso desses processos críticos em cardiomiócitos adultos. Além disso, alguns componentes de vias de sinalização diferente entre ratos neonatal e adulto 9, proporcionando assim uma outra limitação para o estudo de processos de doença e sua icompactas na excitabilidade celular e contratilidade em NRVMs. Finalmente, a distribuição da máquina contrátil leva ao encurtamento célula multidireccional e não uniforme, limitando a precisão das medições contrácteis. O uso de cardiomiócitos adultos isolados fornece, portanto, um sistema in vitro de modelagem mais precisa. O crescimento extraordinário do conhecimento tornada possível pela manipulação genética de ratinhos sublinha a importância da obtenção funcionais cardiomiócitos isolados a partir de murganhos. Na verdade, a caracterização dos CMs adultas isoladas de modelos de mouse lançou luz sobre muitos eventos biológicos e patológicos. CMs isoladas a partir de modelos de camundongos transgênicos têm permitido estudos sobre o ganho ou perda de função das proteínas nas propriedades contráteis de células individuais 2,16, e viabilidade em modelos de doenças, como a isquemia / reperfusão 17,18, complementando, assim, informações obtidas a partir de estudos in vivo sobre oratinhos SE. Uso de isolado adulto CMs de modelos murinos de doença cardíaca adquirida 3,19,20 (como sobrecarga de pressão induzida pela constrição da aorta transversa, que a hipertensão imita ou estenose da válvula aórtica) ou exercício 5,21 (para a modelagem de hipertrofia fisiológica) permite a análise da interacção de cascatas de sinalização envolvidos nestes processos com excitabilidade celular e o acoplamento de excitação-contracção ao nível de uma única célula. Além disso, a capacidade de manipular a expressão de genes usando a expressão do gene dirigido adenoviral no adulto CMs nos oferece a oportunidade para dissecar os componentes de vias de sinalização complexas. Do ponto de vista eletrofisiológico, a tensão de célula inteira e experiências atuais sobre grampo isolado adulto CMs foram fundamentais para elucidar a natureza dos fluxos iônicos no início do estudo e em vários estados de doença. Devido à estrutura complexa da membrana celular e a prote diferencialem estruturas de andaimes adulto entre as linhas de células heterólogas CMs e NRVMs ou, a capacidade de corrigir células adultas dá um muito melhor representação dos efeitos de certas proteínas de membrana, proteínas estruturais, e os parceiros de canais iónicos que interagem nos componentes electrofisiológicas do coração de adulto. Apesar de tais vantagens proeminentes no estudo adultos cardiomiócitos murinos, isolar e cultivar cardiomiócitos ratos adultos tem sido um desafio, pedindo que a necessidade de uma descrição sistemática e precisa da metodologia para isolar cardiomiócitos viáveis ​​do mouse e mantê-los na cultura para permitir ainda mais a manipulação genética usando viral vetores. Estudos anteriores já haviam usado tanto agudamente isolado do rato adulto CMs ou culta rato adulto CMs. Estes últimos são mais fáceis de cultura de rato adulto CMs, ea maioria dos experimentos manipulando expressão gênica in vitro têm usado rato adulto CMs. Poucos estudos têm alterado e investigados functi com sucessoa expressão do gene onal em rato adulto CMs, apresentando uma grande limitação no âmbito de experiências. Portanto, aqui apresentamos detalhadamente tais metodologias, modificado a partir de investigações anteriores, para o isolamento 7,8,22, cultura 3,10,15,23, infecção adenovírus 11-13,15, e análise funcional de cardiomyoctyes ventriculares adulto do rato. Este protocolo resulta em isolamento Ca 2 +-tolerantes, cardiomiócitos excitáveis ​​que temos com sucesso cultivadas por até 72 horas e transitoriamente transfectadas com adenovírus. A funcionalidade destas células isoladas pode ser avaliada utilizando o sistema de imagem MMSYS 14,24 e patch-clamp, que também será discutida.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose mínima</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butanodiona Monóxido</td><td>Sigma</td><td>B0752</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase B</td><td>Roche Ciência Aplicada</td><td>11088807001</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase D</td><td>Roche Ciência Aplicada</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Protease XIV de Streptomyces griseus</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Meio essencial mínimo</td><td>Sigma</td><td>51411C</td><td></td></tr><tr><td>Solução de albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Meio de selenito de insulina-transferrina-sódio suplemento</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Césio</td><td>Sigma</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/289329?lang=en&amp; region=US" target="_blank">289329</a></td><td></td></tr><tr><td>Glutamato</td><td>Sigma</td><td>G3291</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-trifosfato magnésio sal</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Etilenoglicol-bis(2-amina&#8211; tiléter)-N,N,N',N'-ácido tetracético</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hidróxido de césio</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hidróxido de tetraetilamônio</td><td>Sigma</td><td>86643</td><td></td></tr><tr><td>OptiVisor viseira binocular de vidro óptico</td><td>Dohegan Optical Company Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de tecido, 5.5", 1x2 dentes</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-8164</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Moloney - 4.5" (11.5 cm) de comprimento ligeira curva, serrilhada </td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-8254</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 Pinça, Dumostar, tamanho da ponta 0.17 x 0.10mm</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-4966</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Packer Mosquito 5" Reta Plana</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-7114</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Micro Dissecação 4.5" Curvada Afiada/Afiada </td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-5917</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Micro Dissecação 3.5" Reta Afiada/Afiada20mm</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-5907</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto cardiomyoctyes

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

O uso de cardiomiócitos primários (CMS), em cultura tem proporcionado um complemento poderoso para modelos murinos de doenças do coração em avançar na compreensão de doenças do coração. Em particular, a possibilidade de estudar a homeostase de íons, função canal iônico, excitabilidade celular e acoplamento excitação-contração e suas alterações em condições de doentes e por mutações causadoras de doenças levaram a insights significativos sobre doenças cardíacas. Além disso, a falta de uma linha de células adequada imortalizado para imitar adulto CMs, e as limitações dos CMs neonatal (que não têm muitos da característica biomecânica estrutural e funcional do adulto CMs) na cultura têm dificultado a compreensão da complexa interação entre as vias de sinalização, canais iônicos e propriedades contráteis no coração adulto reforçando a importância do estudo adultos cardiomiócitos isolados. Aqui, apresentamos métodos para o isolamento, a cultura, a manipulação da expressão gênica por adenovírus-expreproteínas sseD, e posterior análise funcional dos cardiomiócitos do rato adulto. O uso destas técnicas irá ajudar a desenvolver uma visão mecanicista em vias de sinalização que regulam a excitabilidade celular, Ca 2 + dinâmica e contratilidade e fornecer uma caracterização muito mais fisiologicamente relevante de doença cardiovascular.

O isolamento dos adultos cardiomyoctyes resultados em células em forma de bastonete, estriados, e quiescentes (não bater espontaneamente) (Figura 5A). As células mortas vão olhar arredondado e sem estrias estarão presentes. As células quiescentes podem ser cultivadas e transfectadas com o adenovírus para manipular a expressão do gene (Figuras 5B e 5C). Após 24 horas de cultura, a morfologia das células vivas não muda, elas ainda são Ca2 +-tolerante, e que pod...

Aqui, descrevem o isolamento de cardiomyoctyes ratinho adulto usando um sistema de perfusão de Langendorff. As células resultantes são Ca2 +-tolerantes, electricamente quiescente e podem ser cultivadas e transfectadas com lentivírus para manipular a expressão de genes ou vírus adeno-. A sua funcionalidade, também pode ser analisada utilizando o sistema de MMSYS e técnicas de fixação de membranas.

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar, cultivar e visualizar a contração e o manuseio de cálcio em cardiomiócitos adultos semelhantes. Isso é realizado primeiramente removendo o coração murino e colocando-o em temperatura ambiente. PBS, o coração pode ser canulado na placa conforme mostrado no desenho esquemático ou diretamente na agulha acoplada ao sistema de perfusão, como no vídeo.O terceiro passo é lavar e digerir o coração por meio de perfusão com tampão e, em seguida, tampão enzimático, bombeados através do sistema. O passo final é cortar os ventrículos em uma placa com tampão de transferência e picar suavemente o tecido com pinça. Em última análise, os resultados podem mostrar a contração celular individual dos cardiomiócitos e o manejo de cálcio por meio de medições da célula inteira e/ou do comprimento do sarcômero e da razão métrica.Indicadores de cálcio como RO 2:00 AM com o sistema óptico iônico. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque pode ser difícil pendurar rapidamente o coração pela aorta sem danificar o vaso ou o próprio coração. Injete camundongos adultos com cerca de 12 semanas de idade com 150 USP de heparina sódica no espaço

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Culturas rato cardiomiócitos primários são uma das ferramentas fundamentais para a investigação da organização e função miofibrilar. O protocolo a seguir descreve o isolamento e cultura de cardiomiócitos primários de corações neonatais do mouse. As culturas de cardiomiócitos resultantes podem ser subsequentemente utilizados para uma variedade de biomecânicas, ensaios bioquímicos e celulares biológica.

Isolamento e Cultura de Neonatais rato Cardiomyocytes

Cardiomiócitos individuais de camundongos selvagens e mutantes podem ser isolados do coração para estudar sua contratilidade e transientes de cálcio. Isso permite caracterizar a contribuição da disfunção celular para a disfunção cardíaca por qualquer causa.

Isolamento e Fisiológica Análise de rato Cardiomyocytes

Nós descrevemos um método confiável para isolamento de cardiomiócitos adultos do mouse. Este protocolo produz um resultado consistente para a cultura de cardiomiócitos adultos funcionais a partir de uma variedade de camundongos geneticamente modificados.

Isolamento e Cultura de rato adulto Cardiomyocytes de sinalização celular e<em&gt; In vitro</em&gt; A hipertrofia cardíaca

Este protocolo descreve um método passo a passo para o isolamento reprodutível e cultura de longo prazo de cardiomiócitos de camundongos adultos com alto rendimento, pureza e viabilidade.

Isolamento, cultura e Transdução de rato adulto Cardiomyocytes

Métodos são demonstradas para o isolamento de miócitos do nó sinoatrial (SAM) a partir de ratinhos adultos por patch-clamp electrofisiologia ou imagiologia estudos. As células isoladas podem ser utilizadas directamente ou podem ser mantidas em cultura que permita a expressão de proteínas de interesse, tais como repórteres geneticamente codificados.

Métodos para o isolamento, Cultura e caracterização funcional de SINOATRIAL Nó miócitos de ratos adultos

O objetivo geral deste artigo é a padronização do protocolo para o isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas (CSCs) do fundo do coração de rato adulto. Aqui, descrevemos um método de centrifugação gradiente de densidade para isolar murino CSCs e métodos elaborados para CSC cultura, proliferação e diferenciação em cardiomyocytes.

Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas do coração de rato adulto

Este protocolo é usado para isolar cardiomiócitos atriais únicos do coração do rato adulto usando uma abordagem de digestão do pedaço. Esta aproximação é usada para isolar os miócitos atrial direito ou esquerdos que podem ser usados para caracterizar a electrofisiologia atrial do miócitos em estudos da remendo-braçadeira.

Isolamento de miócitos atriais de camundongos adultos

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento, transfecção e cultura de longo prazo de cardiomiócitos adultos de camundongos e ratos.

Isolamento, Transfecção e Cultura de Longo Prazo de Cardiomiócitos de Ratos Adultos e Ratos

Um método é descrito para o isolamento simultâneo de miócitos e não miócitos tanto da atria quanto dos ventrículos de um único coração de rato adulto. Este protocolo resulta em rendimentos consistentes de miócitos cardíacos altamente viáveis e não miócitos e detalha condições ideais de cultura específica celular para fenotipagem e análise in vitro.

Isolamento simultâneo e cultura de miócitos atrial, miócitos ventriculares e não-miócitos de um coração de rato adulto

O padrão-ouro em cardiologia para experimentos funcionais celulares e moleculares são os cardiomiócitos. Este artigo descreve adaptações à técnica não-Langendorff para isolar cardiomiócitos de camundongos.

Um Método Simples e Eficaz para Isolar Consistentemente Cardiomiócitos de Camundongos

Aprenda a isolar e cultivar cardiomiócitos de camundongo adulto usando perfusão Langendorff. Este método permite visualizar contração e manuseio de cálcio, além de transfecção viral para manipulação gênica em pesquisa cardiovascular.

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

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