Avaliação da função sensório-motora em rato modelos de doença de Parkinson

O objetivo geral desses procedimentos é avaliar quantitativamente a função motora do sensor. Em camundongos. Conseguimos isso usando uma bateria de testes comportamentais sensíveis.

Isso inclui a desafiadora atividade espontânea de travessia do feixe no cilindro e o teste de remoção de adesivo, também conhecido como teste DOT. Após o teste, as gravações de vídeo da travessia do feixe e da atividade espontânea podem ser pontuadas. Em última análise, esses testes podem ser usados para caracterizar a função do sensor ou do motor em novos modelos genéticos de camundongos, bem como em estudos pré-clínicos de medicamentos que estudam possíveis terapias para doenças.

Portanto, a principal vantagem desses testes sobre outros testes, especialmente os automatizados, é que os consideramos altamente sensíveis à disfunção motora, mais sensíveis do que testes como a haste do rotor. Além disso, esses testes são realmente muito econômicos, especialmente em comparação com os automatizados, que podem custar até milhares de dólares. Esses testes podem responder a perguntas-chave no campo dos distúrbios do movimento em geral e são medidas de resultados altamente úteis.

Ao testar potenciais terapêuticas, o feixe é configurado invertendo três gaiolas de rato limpas em uma mesa ou em uma gaiola de rato. Trocando a capela de exaustão, alinhe as gaiolas uniformemente para que possam suportar o comprimento de uma viga de um metro. Em seguida, monte as quatro seções da viga da seção mais larga para a mais estreita e coloque em cima das gaiolas de mouse invertidas.

Coloque a gaiola inicial dos ratos que você planeja testar de lado na extremidade da viga, de modo que a extremidade mais estreita da viga leve direto para a gaiola inicial. Para iniciar o teste assistido, pegue o primeiro rato pela base da cauda e apoie os membros posteriores com a palma da mão. Coloque o mouse na extremidade larga do feixe e solte sua cauda e remova a mão.

Deixe o mouse cheirar e se mover para se orientar melhor para o aparelho. Se o mouse girar suavemente, redirecione-o para a direção desejada. Para encorajar o mouse a descer o caminho, levante a gaiola inicial, mantendo-a na mesma posição de lado, e aproxime-a do mouse de teste.

Quando o mouse começar a tentar entrar na gaiola inicial, mova-o para trás para que o mouse não entre, mas dê um passo à frente. Por fim, permita que o mouse entre na gaiola inicial. Faça o mesmo procedimento para cada rato na gaiola.

Limpe bem o feixe entre as gaiolas com solução de limpeza de quarto de animais dentro de uma gaiola. É importante limpar qualquer urina ou pelotas fecais do feixe antes que o próximo mouse seja executado, pois isso distrairá o próximo mouse. Depois que todos os ratos na gaiola tiverem passado por um teste assistido, pegue o primeiro mouse novamente e coloque-o na extremidade larga do feixe, se necessário.

Oriente suavemente o mouse na direção desejada e toque levemente sua parte traseira para incentivá-lo a se mover ao longo do comprimento do feixe em direção à gaiola inicial, corrija o mouse se ele parar de cheirar ou sair do feixe. Tenha sua mão por perto para guiar o mouse até o final do feixe. Minimize a parada e a exploração enquanto estiver no feixe.

Quanto mais isso é feito durante o treinamento, menos o mouse tende a fazê-lo. Durante o teste, o teste termina quando o camundongo coloca um de seus quatro membros na gaiola inicial, o próximo camundongo pode receber seu segundo teste. Os camundongos recebem um total de cinco tentativas no primeiro dia de treinamento, alternando entre os camundongos, de modo que cada camundongo tenha um intervalo entre tentativas de 30 segundos ou mais.

No segundo dia, execute mais cinco tentativas para cada mouse usando a mesma configuração de feixe do primeiro dia, os mouses não devem precisar de nenhuma assistência, mas podem precisar ser corrigidos ou tocados na parte traseira para evitar parar ou explorar. 24 horas depois, comece o dia de teste. Configure a viga de maneira semelhante aos dois dias de treinamento anteriores.

No entanto, coloque uma grade de malha que corresponda a cada largura de viga na parte superior de cada seção da viga. Use uma câmera de vídeo para gravar todas as tentativas de travessia do feixe antes do início de cada tentativa. Rotule um cartão com as informações essenciais do experimento, como data, número do mouse e número da avaliação, e coloque-o na frente da câmera.

Grave por dois a três segundos antes de cada tentativa para que fique claro qual mouse está sendo testado e em qual teste está. Para cada teste, coloque o mouse em cima da superfície da grade na seção mais larga e registre à medida que ele se move ao longo do registro do feixe para que todo o comprimento do corpo do mouse fique visível. A câmera deve ser posicionada de forma que a grade fique no meio do visualizador.

Execute cada mouse no teste cinco vezes no feixe de superfície da grade, limpando-o entre cada mouse. Para configurar o experimento de atividade espontânea, organize duas gaiolas uma ao lado da outra com cerca de 18 centímetros de distância, de modo que as frentes das gaiolas fiquem voltadas para o experimentador. Se necessário, coloque uma gaiola adicional atrás das outras duas gaiolas para servir de suporte para o espelho.

Em seguida, coloque um pedaço de vidro em cima das duas gaiolas e posicione-o de forma que o vidro fique apoiado na borda externa das duas primeiras gaiolas. Em seguida, coloque um cilindro em cima do vidro e um espelho em um ângulo abaixo do vidro. Apoiando-se na terceira gaiola para trás.

O ângulo pode variar de 30 a 45 graus, mas o mais importante, a visão da câmera deve incluir todo o diâmetro do cilindro. Depois que o experimento estiver configurado, coloque a câmera de vídeo na frente do espelho e ajuste o espelho e a câmera de vídeo até que você possa visualizar todo o diâmetro da parte inferior do cilindro. Em seguida, defina um cronômetro para três minutos e rotule um cartão com os detalhes importantes do experimento, como no vídeo do experimento anterior.

Grave o rótulo por dois a três segundos. Então pare. Para executar o experimento, coloque um mouse no cilindro.

Pressione gravar e inicie o cronômetro. Grave o mouse por três minutos. É importante que a área de teste seja silenciosa, pois ruídos altos e conversas podem distrair o mouse e potencialmente causar comportamento de congelamento.

Durante o experimento, use um contador de mão para contar o número de traseiros que o mouse faz enquanto está no cilindro. Uma traseira é definida como um movimento vertical com os dois membros caídos do chão, de modo que o mouse fique de pé apenas sobre os membros posteriores. Quando o cronômetro expirar, remova o mouse e coloque-o de volta em sua gaiola inicial.

Limpe o cilindro e o vidro com solução de limpeza de sala de animais entre cada mouse. Deixe a solução de limpeza secar antes de passar para o próximo mouse. Comece o teste de remoção de adesivo colocando o mouse em sua gaiola doméstica.

Com a caixa do alimentador removida, permita que os ratos se habituem à sala de testes e à gaiola sem o alimentador. Por uma hora para o teste, use uma gaiola limpa para colocar os companheiros de gaiola de forma que o mouse de teste seja o único na gaiola doméstica. Remova três quartos da roupa de cama e coloque-a na gaiola limpa com os companheiros de gaiola na gaiola doméstica.

Scruff o mouse de teste para contê-lo usando um par de pinças pequenas, coloque uma etiqueta adesiva no sslt do mouse. Pressione suavemente a etiqueta no focinho com a pinça e solte o mouse. Coloque a tampa na gaiola e inicie um cronômetro quando o mouse tentar remover as etiquetas com seus quatro poros.

Registre o tempo se o mouse fizer contato, mas não remover o rótulo. Registre a hora, mas mantenha o cronômetro funcionando até que isso aconteça. Remova-o completamente.

Se o mouse não entrar em contato ou remover o adesivo em 60 segundos, encerre o teste e remova manualmente o adesivo. Após cada teste, coloque o mouse de teste na gaiola de retenção e comece a testar o próximo mouse. Todos os camundongos recebem três tentativas alternadas entre os camundongos.

Em vez de fazer todos os três testes em um camundongo ao mesmo tempo, os testes em que o rótulo cai ou não está seguro nos focinhos não são contados. A atividade espontânea do feixe desafiador no cilindro e os testes de remoção de adesivo são ensaios altamente úteis da função do motor do sensor em camundongos no teste de feixe desafiador, os camundongos com alfa-sinucleína TH um cometem significativamente mais erros por etapa do que os camundongos do tipo selvagem. O número de erros aumentou em camundongos alfa-sinucleína à medida que o feixe se torna mais estreito.

Este não foi o caso dos camundongos do tipo selvagem. Essa mesma linha de camundongos também mostra uma diminuição robusta nos passos dos membros posteriores no teste do cilindro. Esses resultados mostram que a superexpressão de alfa humano no núcleo nos camundongos mutados leva ao desenvolvimento de déficits motores detectáveis do sensor.

Finalmente, no teste de remoção de adesivo, PITX três camundongos akia com uma diminuição profunda nos neurônios dopaminérgicos nigroestriatais mostram um tempo de contato significativamente maior em comparação com os controles do tipo selvagem. Nós e outros usamos esses testes rotineiramente para avaliar o potencial terapêutico dos tratamentos para a doença de Parkinson. Esses testes também podem ser usados para caracterizar modelos genéticos de camundongos e determinar as consequências de mutações específicas na função sensório-motora.