Imagem direta de cálcio ER com Targeted-Esterase Induzida Dye Loading (TED)

O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar a dinâmica do cálcio diretamente no lúmen do retículo endoplasmático de células vivas. Isso é conseguido transduzindo as células com o corante induzido por esterase direcionada ou construção de vetor TED para superexpressar a carbox esterase CS dois no retículo endoplasmático. Em seguida, as células são incubadas com o aceto metil éster cálcio indicador flu oh five NA, que se difunde através das membranas plasmática e ER.

Em seguida, a carboxila esterase se separa. O grupo éster libera o indicador sensível ao cálcio no er. Lúmen e complexos de cálcio fluorescentes são formados.

São obtidos resultados que mostram alterações na concentração de cálcio livre no RE com base em imagens de células vivas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a regulação da homeostase do cálcio celular. Os sinais de cálcio são monitorados com mais frequência no citosol, portanto, não podem ser facilmente distinguidos onde o cálcio está fluindo para o citosol a partir do espaço extracelular ou do armazenamento de cálcio intracelular do RE.

Para superar essa limitação, desenvolvemos o download induzido por esterase direcionado. Com este método, o cálcio liberado do RE é monitorado diretamente. A abordagem não é disruptiva.

A membrana plasmática permanece intacta e as cascatas de sinalização intracelular são preservadas. Geralmente, os indivíduos que usam o método terão dificuldades porque precisam de experiência. Na expressão do vetor TED, desenvolvemos construções vetoriais que expressam uma proteína cent fundida à carboxilase CES dois.

Isso nos permite identificar facilmente as células adequadas para imagens de cálcio AR durante os experimentos, que serão células caracterizadas por fluorescência vermelha forte e fluorescência indicadora de cálcio apenas moderada a forte. Esses marcadores fluorescentes devem ser distribuídos uniformemente por todo o retículo endoplasmático e estão ausentes na região nuclear. Antes de começar.

Prepare o líquido cefalorraquidiano artificial ou um LCR e gripe oh cinco NAM de acordo com o protocolo de texto. Pré-aqueça o A CSF à temperatura ambiente e adicione glicose profunda, areje o A CSF com carbogênio por cinco minutos. Em seguida, adicione soluções de estoque de um molar de cloreto de cálcio e cloreto de magnésio até concentrações finais de dois milimolares cada.

Depois de iniciar o microscópio de imagem ao vivo e o programa de computador, comece a profusão em uma câmara de imagem fictícia e equilibre o sistema de tubos, pré-aqueça o aquecedor de solução em linha e a câmara de imagem na platina do microscópio e equilibre o sistema a 32 a 37 graus Celsius. Antes de iniciar o procedimento de download para carregar o corante nas células, adicione 100 microlitros de A CSF pré-aquecido a uma alíquota de 0,5 microlitro de cinco milimolares de gripe oh cinco NAM e solubilize a solução em um sonicado em banho-maria por 90 segundos, transfira 400 microlitros de solução de imagem pré-aquecida para um poço de uma placa de quatro ou 24 poços. Adicione a solução D ao mesmo poço para produzir 500 microlitros de uma solução de cinco micromolares.

Em seguida, coloque cuidadosamente uma lamínula com as células no poço, incube por um período de tempo apropriado: em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius, o tempo de carregamento de DI e a concentração de D dependem do tipo de célula, da densidade celular e das necessidades específicas dos experimentos. Longos tempos de incubação podem prejudicar as células, especialmente as células de nuance primária e glial, e isso é fundamental para a capacidade de resposta a estímulos fisiológicos. A incubação de mais de 30 minutos só será útil para experimentos de localização de cálcio ER para investigar a distribuição de cálcio ER em pequenos microdomínios, por exemplo, MUEs de espinhos Imediatamente após a incubação, transfira a lamínula para outro poço de cultura de células contendo solução de imagem.

Para se preparar para a montagem das células na câmara de imagem, use um pincel para aplicar graxa de alto vácuo na câmara de imagem. Usamos câmaras de imagem de fabricação própria para lamínulas de 10 a 12 milímetros com um pequeno volume, permitindo assim altas velocidades de perfusão de até 15 vezes a troca de tampão por minuto. Pegue a lamínula com a gripe oh cinco e células carregadas e adicione uma pequena gota de solução de imagem para mantê-la molhada.

Em seguida, vire a lamínula de cabeça para baixo e monte as células na câmara de imagem. Use um cotonete para pressionar a lamínula na cola de silicone e para limpar o tampão residual da parte inferior da lamínula de vidro. Em seguida, troque a câmara de imagem fictícia pela câmara de imagem experimental.

Lave as células por cinco a 10 minutos por perfusão contínua para seleção celular. Use uma quantidade mínima de iluminação a laser para evitar o branqueamento rápido da gripe oh cinco e cálcio dois no pronto-socorro, uma alta taxa de varredura de dois a quatro hertz, um tamanho de imagem pequeno e um alto ganho configurado no microscópio. De acordo com o experimento com a planta.

No início do experimento, documente a distribuição celular do rótulo de gripe oh cinco e cálcio e o rótulo fluorescente vermelho da construção da célula esterase da caixa vermelha. Em sua célula de interesse aqui, neurônios representativos por pilhas de imagens X, YZ de alta resolução realizam imagens XYT para monitorar a dinâmica do cálcio ER sob as condições experimentais específicas. As configurações típicas para o nosso sistema estão listadas na tabela dois do protocolo de texto As alterações do monitor no cálcio do RE sob perfusão contínua com solução de imagem são de 1,5 mililitro por minuto para lavagem celular e depleção de armazenamento bloqueando o cálcio do retículo endoplasmático do sarco, dois TPAs e três mililitros por minuto para estimulação por um TP e DHPG e agonista para o receptor metabotrópico de glutamato.

Aqui, as células gliais são estimuladas com 200 micromolares A TP por 10 segundos. Para processar as imagens, abra a pilha de imagens no programa Image J para imagens multicoloridas. Divida os canais RBG quando solicitado pelo software.

Identifique as regiões de interesse. Dependendo da finalidade, desenhe regiões de interesse ao redor do ER completo ou de pequenas regiões do ER. Use o plug-in do analisador de séries temporais para ler a intensidade média de pixels em uma região de interesse.

Calcule as mudanças relativas corrigidas de fundo na fluorescência por delta F sobre F zero usando esta fórmula. Apresentar mudanças relativas na fluorescência como um traço com delta F sobre F zero para o eixo Y e tempo para o eixo x. Nesta figura, as células A, astrócitos corticais e neurônios do hipocampo expressam um vetor TED fluorescente vermelho e são marcados com o indicador de cálcio de baixa afinidade.

Gripe oh cinco N.O complexo indicador de cálcio fluorescente está localizado no retículo endoplasmático de todos os tipos de células. Esta figura mostra as células da glia marcadas com gripe oh cinco N. Durante o tratamento com NIC, uma marcação citosólica brilhante é observada se a membrana plasmática de uma célula for danificada antes e depois do tratamento com NIC.

Isso revela que a gripe oh cinco N também é liberada no citosol por esterases endógenas. Neste experimento, após a marcação TED com gripe oh cinco Ner a depleção de cálcio dos neurônios do hipocampo cultivados é causada pelo ácido ciclônico bloqueador circa. Observe que a enorme mudança na densidade média de fluorescência por região de interesse observada aqui é uma série de lapso de tempo com células GL cortico de camundongo que são estimuladas com um TP. A fluorescência cai abruptamente e se recupera, representando a liberação e o reabastecimento de cálcio do ER Simultaneamente, a fluorescência da proteína fluorescente vermelha diminui marginalmente como consequência de diagramas de branqueamento de ardósia mostrando a mudança na intensidade da fluorescência ao longo do tempo em alguns, mas não em todos os experimentos.

Os valores de fluorescência não voltam aos níveis iniciais de intensidade de fluorescência porque alguns complexos de N da gripe ou cinco são perdidos durante a estimulação. Este filme mostra uma célula BHK 21 infectada com carboxilase em alta resolução marcada por gripe oh cinco complexos de cálcio N e estimulada com um TP. Observe que uma liberação de cálcio induzida por TP e o reenchimento do estoque de cálcio do ER são visualizados em estruturas finas dos túbulos do RE. Ao participar deste procedimento, é importante lembrar que apenas células perfeitamente saudáveis apresentam respostas fisiológicas de cálcio.

Portanto, recomendamos realizar uma série de experimentos inter-relacionados de homeostase de cálcio em um dia com o mesmo lote de células. Com base em nossa experiência, o corante da gripe de cinco N funciona melhor, mas esse indicador de cálcio não é muito resistente a violações. Portanto, este método se beneficiará do desenvolvimento de indicadores de cálcio de baixa afinidade mais resistentes ao alvejante.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter imagens do transiente de cálcio E com indicadores sintéticos de cálcio de baixa afinidade. Esses indicadores permitem monitorar a dinâmica do cálcio com alta resolução temporal. Por esse motivo, nosso método pode ser benéfico para a investigação de cascatas de sinalização de cálcio envolvidas na plasticidade sináptica e para monitorar alterações na homeostase do cálcio em modelos celulares para doenças neurodegenerativas.