Name: Imagem direta de cálcio ER com Targeted-Esterase Induzida Dye Loading (TED) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Aprenda a visualizar dinâmica de cálcio no retículo endoplasmático usando o método TED com carboxilesterase recombinante e indicadores fluorescentes. Esta técnica preserva a integridade celular e permite estudos de sinalização intracelular em tempo real.

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Este trabalho foi suportado por concessões do Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1 ea Friedrich-Baur-Stiftung. Gostaríamos de agradecer Roger Y. Tsien, Howard Hughes Medical Institute Laboratories na Universidade da Califórnia, em San Diego por nos fornecer as Tag-RFP-T2. Nós felizmente reconhecer David Baltimore, do Instituto de Tecnologia da Califórnia em Pasadena, e Didier Trono, da Universidade de Genebra, Genebra, por nos fornecer o lentiviral plasmídeos FUGW e psPAX2/pMD2.G.

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

As vantagens e desvantagens do método TED foram amplamente discutidas em publicações recentes 34,35. Em comparação com os outros métodos descritos acima, o TED contorna o problema da interrupção e perfundir as células. Além disso, dois aspectos precisam ser enfatizados. O princípio de TED para ER imagem requer cálcio (1.) A expressão de um alvo carboxilesterase activo no lúmen do ER, com a ajuda de TED construções de vectores e (2.) A libertação eficiente e preferencial de baixa afinidade sintéticos AM-éstere...

A fim de resolver as respostas fisiológicas de cálcio do ER, desenvolvemos uma nova estratégia para melhorar a retenção de corantes sensíveis cálcio sintéticos para o ER. O método permite o monitoramento em tempo real direto, sem interrupções de livre ER cálcio na presença de cálcio extracelular. Função e sinalização de cálcio ER Sinais de cálcio são encontradas em diferentes tipos de células, células musculares, por exemplo, neurónios e células gliais e a sua gama de funções de mediar a contração do músculo a um envolvimento na transmissão sináptica na aprendizagem e na memória 1,2. As alterações na concentração de cálcio livre são de interesse científico porque o cálcio está envolvido na regulação da transcrição de genes, a proliferação celular, a excitabilidade neuronal, morte celular e outros eventos de sinalização celular 1-7. Todos estes sinais de cálcio celulares estão funcionalmente ligados e contribuir para cálcio intracelularloja dinâmica 8-10. Uma característica comum a todos os sinais de cálcio é o fluxo de cálcio entre o espaço extracelular, o citosol e organelas, principalmente, o ER e mitocôndrias. Isto faz com que as alterações dinâmicas na concentração de cálcio dentro destes organelos, que são detectados pelos diferentes componentes de sinalização. Em geral, a concentração de cálcio em gamas de RE entre 100 a 800 | iM, no citosol da concentração de cálcio é de cerca de 100 nM, e no espaço extracelular, a concentração é de cerca de 1-2 mM. Assim, não existe uma força motriz maior para o fluxo químico cálcio para o citosol 2,9,10. Os sinais de cálcio ER derivados mais comumente investigados dependem da estimulação dos receptores acoplados à proteína G (GPCR), que, em seguida, activam a fosfolipase C (PLC). PLC em vez produz o inositol 1,4,5-trifosfato (IP 3) 1. Após a ligação de IP 3 à sua conseptor (IP 3-Rec, Figura 1) na ER-membrana, os íons cálcio são liberados a partir do lúmen ER. Historicamente, a liberação de cálcio 3 mediada IP do ER foi o primeiro - mesmo que indiretamente - medido em células pancreáticas acinares por Streb et al, em 1983, 11.. Esta publicação sugeriu pela primeira vez que uma cascata de sinalização que envolvem a acetilcolina, a fosfolipase C e IP3. Esta forma de libertação de cálcio é geralmente denominado libertação de cálcio induzida por IP 3 (IiCR) (Figura 1). Ativação da quinase dependente de fosfolipase Cy por receptores tirosina quinases liga a ação de fatores de crescimento e fatores neurotróficos para ER cálcio sinalização após IP 3 elevação 12. Além IiCR, elevação de cálcio podem ser a entrada de cálcio mediada por receptores ionotrópicos, por exemplo através de canais de cálcio dependentes da voltagem (Ca V), e subsequente libertação de cálcio induzida por cálcio (CICR) por re rianodinaceptors (RyR). IiCR e CICR são fisiologicamente ligado a entrada de cálcio loja operado (SOCE). SOCE inclui a ação do STIM (molécula interagindo estroma), que é um sensor para a liberação ER cálcio. STIM foi mostrada para estimular a entrada de cálcio extracelular através de canais de receptores transientes potenciais (Trp) 13, Orai canais de cálcio de 14 e até mesmo dos canais de cálcio dependentes da voltagem 15 (Figura 1). Perda de ER cálcio é dinamicamente resgatado pela ação do Sarco-retículo endoplasmático cálcio ATPase (SERCA), que ativamente bombas de cálcio de volta para o ER. O bloqueio da SERCA com drogas tais como tapsigargina revela uma perda contínua de cálcio RE para o compartimento citosólico. Este requisito de cálcio &quot;fuga&quot; é causado por ER intramembrane complexos de poros, tais como o complexo de proteína de 16,17 Sec61 (Figura 1). Em 1998, Berridge publicou um modelo, o &quot;neurônio dentro de um modelo de neurônio&quot;, which sugere um papel fisiológico princípio da ER na integração de cálcio neuronal 5. Este modelo considera a existência de um sistema de membrana ER contínuo formando uma &quot;imagem&quot; intracelular da membrana plasmática neuronal 5. Este sistema de membranas eucarióticas binário foi reivindicada a ser um pré-requisito básico para a integração temporal e espacial dos sinais de cálcio rápidas e lentas em neurônios. Sinais de cálcio que ocorrem ou concomitantemente ou posteriormente em diferentes espinhos ou dendritos de um mesmo neurônio são conferidos a soma ou núcleo através da ER, onde se resumem 5,18 da célula. Então, a soma pode ter efeitos sobre a excitabilidade do neurônio, a regulação da transcrição do gene ou a integração de cascatas de sinalização. Assim, o ER suporta a integração de sinais de cálcio. Um pré-requisito para este conceito é a continuidade do ER de uma única célula, o que foi reivindicado em diversos estudos e que foi provado pelo menos para somato-dáreas endritic e curta distância projeções axonais 19-21. Se há continuidade ER dentro projeções axonais longas é uma questão de debate. Estratégias para medir o fluxo de cálcio livre sobre a membrana ER Sinais de cálcio são mais frequentemente monitorados no citosol 22,23. Portanto, não pode ser facilmente distinguida se Ca 2 + a fluir para o citosol a partir extracelular ou de reservas intracelulares 6,24. Para superar esta limitação, foram desenvolvidas estratégias metodológicas para a imagem latente de cálcio direto ER. Em resumo, são utilizadas as seguintes estratégias: (1) ER-alvo geneticamente modificadas indicadores de proteína-25-27 de baixa afinidade de Ca 2 + os indicadores baseados Proteína utilizar a proteína bioluminescente aequorina GFP ou em combinação com uma proteína. Sensível ao cálcio. Estes Ca 2 + indicadores geneticamente modificados (Gecis) podeser orientada para o ER, com a ajuda de um péptido de sinal e são activamente mantido no ER e de retenção utilizando um padrão de recuperação. Comum ER Ca 2 + indicadores de base no princípio da Cameleon e são o Cameleon YC4.3 26,28; Cameleon divisão YC7.3ER 29, e Cameleon D1 30. (2) direto carregamento de AM-éster de baixa afinidade Ca 2 tintura baseada em indicadores esterase + 31,32. Dos corantes indicadoras (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM ou Fluo5N-AM) derivativos AM passar o membranas biológicas em um estado de cálcio-insensitive lipofílico. Em seguida, no citosol, bem como no ER, esterases endógenas de clivar o grupo de AM-éster e libertar o indicador de Ca2 +, deixando para trás uma certa quantidade de corante activa no citossol e no ER. Por conseguinte, esta abordagem é útil em condições de uma elevada concentração de cálcio no ER, enquanto a concentração de cálcio citosólico permanece bem inferior ao nível delimite de protecção dos indicadores de baixa afinidade, em particular durante os sinais característicos de cálcio (por exemplo, de baixo nM até uM). (3) Carga AM-éster, em combinação com a permeabilização da membrana do plasma 32. Qualquer citosólica de Ca2 + indicador remanescente é removido por permeabilização da membrana do plasma com quantidades pequenas de um detergente &quot;leve&quot; (por exemplo, saponina) num tampão intracelular artificial. Assim, as membranas intracelulares podem ser estimuladas, por exemplo, com IP 3 intracelular no tampão, directamente através de &quot;poros&quot; da membrana plasmática. (4) Diálise do citosol sob configuração de célula inteira e medições simultâneas de Ca 2 + no lúmen ER e citosol 32,33. Uma célula é carregado pela primeira vez com uma baixa afinidade Ca 2 + indicador (por exemplo, Mag-Fura2- AM, raciométrica, UV-luz). Depois, com a ajuda de uma pipeta de remendo, qualquer cit remanescenteosolic baixa afinidade de Ca 2 + indicador é dialisado para fora do citosol com um tampão contendo um indicador de Ca2 + de elevada afinidade (por exemplo, Fluo-3, luz visível). Esta estratégia permite a gravação simultânea de sinais derivados citosólicas e ER. (5) Targeted-esterase induzida corante de carga de 8,34. Carboxilesterase (CES) está voltado para o lúmen do RE e proporciona uma elevada actividade de esterase de aprisionamento eficaz da forma de AM-éster de baixa afinidade de Ca 2 + indicadores. Targeted-esterase induzida corante de carregamento (TED) Para melhorar o direcionamento de baixa afinidade de Ca 2 + indicadores para o lúmen ER, TED foi desenvolvido. TED requer a superexpressão de uma carboxilesterase alvo rato ER (CES2) (Figura 2), o que é conseguido por meio de construções de expressão. As células que expressam uma construção recombinante CES-são incubadas com a forma de AM-éster de cálcio emcorante dicator (Fluo5N-AM, a Figura 2). Em seguida, no ER, o corante é convertido para o Ca2 + sensíveis, a membrana impermeável de Ca 2 + complexo indicador (Fluo5N/Ca 2 +), pela elevada actividade de esterase, aprisionando, por conseguinte, o corante numa concentração elevada no lúmen ER 8 , 34. O método é especialmente útil para investigar ER-libertação de cálcio através dos IiCR-vias, por exemplo por meio de purinérgicos ou receptores de glutamato metabotrópicos, 8,34 e visualizar a depleção de cálcio através da &quot;ER&quot; canais de vazamento, por exemplo, directamente após o bloqueio da 17 SERCA , 34. Para nossa experiência, a baixa afinidade Ca 2 + indicador Fluo5N-AM é atualmente o melhor indicador disponível para usar com a estratégia de carregamento TED corante. Fluo5N-AM tem uma baixa afinidade pelo Ca 2 + (constante de dissociação K D ~ 90 mM, figura 2), é quase não-fluorescente em seu AM-forma, mas oferece emissão de fluorescência de alta sobre calciu8,34 m de ligação. O Fluo5N/Ca 2 + complexo pode ser excitado com uma fonte de luz padrão de ~ 490 nm, o que corresponde a corantes convencionais, tais como FITC, Alexa 488, ou eGFP. Sinais de cálcio citosólico dificilmente atingir uma concentração na gama uM baixo e são, portanto, apenas detectada por Fluo5N no citosol 35. Para melhorar o desempenho TED, várias construções de vectores recombinantes foram desenvolvidos (Figura 3). Originalmente, os vectores de TED baseados na sequência de codificação de CES2 (RefSeq número de acesso NM_145603, CES2c) e melhor desempenho TED é observado com a expressão estável de CES construtos. Novos vetores TED expressar um elemento central da CES2 fundido à proteína fluorescente vermelha TagRFP-T2 36. Estes vectores possuem a vantagem de que eles podem ser utilizados para identificar as células transduzidas e utilizar a fluorescência vermelha como um controlo interno para a normalização de alterações na Fluo5N/Ca 2 + fluorescência. A fluorescência vermelha também oferece a possibilidade de visualizar a distribuição estrutural do ER e as alterações na dinâmica do ER sob condições de estimulação.

<table><tbody><tr><td>(S) -3,5-DHPG (Dihidroxifenilglicina)</td> <td>Tocris</td><td>0805</td><td></td></tr><tr><td>5 '; -ATP-Na2, ATP hidrato de sal dissódico</td><td>Sigma</td><td>A26209-1G</td><td></td></tr><tr><td>B-27 suplemento, 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de carbamoilcolina (Charbachol)</td> <td>Sigma</td><td>C4382-1g</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ciclopiazônico (CPA)</td> <td>Ascent científico</td><td>Asc-300</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM com Glutamax</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS sem Ca/Mg 1x</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-5N-AM, 10 x 50 &mu; g</td><td>Invitrogen</td><td>F14204</td><td></td></tr><tr><td>Glutamate</td><td>Ascent científico</td><td>Asc-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de nutrientes F12 do presunto</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>21765-029</td><td></td></tr><tr><td>BSS de Hank (1x) sem Ca, sem Mg, com vermelho de fenol, HBSS</td><td>PAA Laboratories</td><td>H15-010</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>SHD3250YK</td><td>Linearis</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina Ca2+ sal</td><td>Ascent scientific</td><td>Asc-116</td><td></td></tr><tr><td>murine EGF </td><td>PreproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>N2 suplemento 100x</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127, baixa absorção de UV, 2g</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td>Bromidrato de poli-DL-ornitina PORN</td><td>Sigma</td><td>P8638</td><td></td></tr><tr><td>Bromidrato de poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Calbiochem</td><td>586005-1mg</td><td></td></tr><tr><td>TryLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Worthington</td><td>LS-003707</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de tripsina da glicina MAX (soja)</td> <td>Sigma</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr> < td colspan = "4 ">< forte > Materiais< / forte ></td></tr> <tr><td>Sistema confocal: microscópio de varredura a laser invertido: FV1000 com IX81</td><td>Configuração específica do usuário</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>Sistema confocal: combinador de laser FV10 e lasers de diodo (405, 473, 559, 635)</td> <td>Olympus</td><td></td><td>configuração específica do usuário</td></tr><tr><td>Sistema confocal: cabeça de varredura FV10-SPD com detector de espectrais</td><td>Configuração específica do usuário</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de aquecedor TC-344B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0101</td><td>para controlar o aquecedor de solução em linha</td></tr><tr><td>Software</td> <td>NIH ImageJWS Rasband, ImageJ, Institutos Nacionais de Saúde dos EUA, <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>, 1997--2006</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objetivo: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35</td><td>Olympus</td><td>N2709100</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo: UPLFLN40XO</td><td>Olympus</td><td>N1478700</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15</td><td>Olympus</td><td>N1480700</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de perfusão, inversa</td><td>feita sob medida</td><td></td><td></td></tr> Câmara <tr><td>de perfusão, RC-49FS</td><td>Warner Instruments</td><td>W4 64-1709</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de perfusão: PT-49</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1730</td><td>para perfusão</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica MiniPlus 3 (4 canais)</td><td>Gilson</td><td>n.a.bomba</td> <td>de perfusão</td></tr><tr><td>Aquecedor de solução única em linha SH-27B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td>controlado por controlador de aquecedor</td></tr><tr><td>Tubos de sucção: ST3R</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1407</td><td>para perfusão</td></tr><tr><td>Inserção de aquecimento: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel</td><td>Pecon</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

imagem direta de cálcio er com targeted-esterase induzida dye loading (ted)

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualização da dinâmica do cálcio é importante para entender o papel do cálcio na fisiologia celular. Para examinar a dinâmica de cálcio, Ca 2 + indicadores fluorescentes sintéticos tornaram-se populares. Aqui demonstramos TED (= targeted-esterase induzida corante de carga), um método para melhorar a libertação de Ca2 + corantes indicadoras no lúmen do ER de diferentes tipos de células. Até à data, o TED foi utilizado em linhas de células, células gliais e neurónios, in vitro. TED sobre bases eficientes, recombinante alvo de uma atividade de alto carboxilesterase para o lúmen ER usando vetores construções que carboxilesterases rápidas (CES). Os últimos vectores TED contendo um elemento de núcleo de CES2 fundida com uma proteína fluorescente vermelha, permitindo assim imagiologia simultânea de duas cores. A dinâmica do cálcio livre na ER são gravadas em uma cor, enquanto a estrutura ER correspondente aparece em vermelho. No início do processo, as células foram transduzidas com um lentivírus. Posteriormente, as células infectadas are semeadas em lamínulas para finalmente permitir imagens de células vivas. Em seguida, as células vivas são incubadas com o éster acetoximetílico (AM-éster) forma de baixa afinidade Ca 2 + indicadores, por exemplo Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, ou Mag-Fura2-AM. A actividade de esterase nos cliva fora do ER cadeias laterais hidrófobas da forma AM do indicador de Ca 2 + e de um corante fluorescente / Ca 2 + complexo hidrófilo é formado e preso no lúmen do ER. Depois de corante de carga, as células foram analisadas num microscópio confocal laser scanning invertido. As células são continuamente perfundido com soluções de Ringer-like e as dinâmicas ER cálcio são diretamente visualizados por imagem time-lapse. Libertação de cálcio a partir do ER é identificado por uma redução na intensidade de fluorescência em regiões de interesse, enquanto que o reenchimento da loja ER cálcio produz um aumento na intensidade de fluorescência. Finalmente, a mudança na intensidade de fluorescência ao longo do tempo é determinada pelo cálculo da Af / F 0.

Este protocolo fornece uma abordagem sem interrupções para a imagem direta de livre ER cálcio. Baixa afinidade sintético Ca2 + indicadores são libertados e preso no lúmen do ER, com a ajuda de um ER alvo, a actividade da enzima esterase recombinante. Melhoria carregamento dos Ca 2 + indicador de corantes para o lúmen ER permite que uma imagem direta e rápida de dinâmicas armazenam cálcio ER. Tipos de células para TED A viabilidade do método tem...

Targeted-esterase induzida corante de carregamento (TED) suporta a análise da dinâmica intracelular de cálcio loja por imagens de fluorescência. O método baseia-se na segmentação de uma carboxilesterase recombinante para o retículo endoplasmático (ER), onde se melhora o desmascaramento do local sintético de baixa afinidade Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Corantes indicador no lúmen ER.

Imagem direta de cálcio ER com Targeted-Esterase Induzida Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar diretamente a dinâmica de cálcio no interior do retículo endoplasm�tico de células vivas. Isso é alcançado mediante a transdução das células com o vetor construído para o corante induzido por esterase direcionado, ou seja, o construto TED, para superexpressar a carboxiesterase CS2 no retículo endoplasmático. Em seguida, as células são incubadas com o indicador de cálcio acetoximetil éster fluo-5N AM, que difunde através das membranas plasmática e do retículo endoplasmático.Em seguida, a carboxilesterase cliva. O grupo éster libera o indicador sensível ao cálcio no lúmen do retículo endoplasmático. São formados complexos fluorescentes de cálcio.Obtêm-se resultados que mostram alterações na concentração de cálcio livre no retículo endoplasmático com base em imagens de células vivas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a regulação da homeostase celular de cálcio. Os sinais de cálcio são mais frequentemente monitorados no citosol; portanto, não é fácil distinguir se o cálcio que flui para o citosol provém do espaço extracelular ou do armazenamento intracelular de cálcio no retículo endoplasmático.Para su

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Aprenda a visualizar dinâmica de cálcio no retículo endoplasmático usando o método TED com carboxilesterase recombinante e indicadores fluorescentes. Esta técnica preserva a integridade celular e permite estudos de sinalização intracelular em tempo real.

Imagem direta de cálcio ER com Targeted-Esterase Induzida Dye Loading (TED)

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