In Vivo Modelagem do Morbid Genoma Humano utilizando Danio rerio

- [Narrador] O objetivo geral do experimento a seguir é testar a patogenicidade de alterações não sinônimas clinicamente significativas usando complementação in vivo em peixe-zebra. Isso é conseguido primeiro gerando mRNA humano mutante para recapitular lesões genéticas humanas. Em seguida, o mRNA e os morfolinos humanos selvagens e mutantes são injetados em embriões de peixe-zebra e traduzidos em proteínas funcionais ou usados para bloquear a tradução, respectivamente. Em seguida, os embriões são fenotipados para avaliar os efeitos da proteína mutante no desenvolvimento. São obtidos resultados que mostram os efeitos deletérios das mutações nas sequências de proteínas humanas que podem ser confirmados com base na capacidade de resgate do mRNA humano mutante.

- A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o modelo de camundongo, é que alelos potencialmente prejudiciais podem ser testados mais rapidamente em um nível de rendimento médio a alto, e também, séries alélicas dentro de um único gene podem ser avaliadas para entender melhor o efeito direcional em um nível celular, como perda de função ou ganho de função.

- [Narrador] Para começar, determine se o gene humano de interesse tem um ortólogo de peixe-zebra e, em caso afirmativo, quantas cópias. Recomendamos BLAST recíproco da proteína humana contra o genoma do peixe-zebra e BLAST subsequente do peixe-zebra atingido contra o genoma humano. Os verdadeiros ortólogos serão os mais atingidos em cada instância. Obtenha ou gere uma construção usando o Open Reading Frame humano para o gene desejado com menos de seis quilobases de comprimento, bem como um local de transcrição 5 'SP6 e um sinal 3' polyA. Em seguida, projete um morfolino para bloquear o splicing ou a tradução do gene do peixe-zebra alvo. Usando zfin.org determinar se o ortólogo do peixe-zebra é expresso em um contexto espaço-temporal relevante para a leitura fenotípica. Como alternativa, realize RT-PCR usando cDNA de embriões inteiros de peixe-zebra ou hibridização in situ. Para realizar a mutagênese dirigida ao local, comece projetando primers de mutagênese de 25 a 45 bases de comprimento com a mutação desejada no centro que irá recozer para fitas opostas do plasmídeo. A temperatura de fusão do primer deve ser maior ou igual a 78 graus Celsius. Monte a reação de mutagênese com uma polimerase de alta fidelidade e faça um ciclo usando o programa mostrado aqui. Quando a reação de PCR estiver completa, adicione um microlitro de endonuclease de restrição de DpnI por reação para remover o molde metilado da barragem. Incube a 37 graus Celsius por duas horas. Transforme dois microlitros da reação de mutagênese em 20 microlitros de células competentes de acordo com protocolos padrão. Uma vez que a mutação de interesse e a sequência de toda a ORF sejam confirmadas a partir de culturas noturnas, linearize o modelo pCS2+ e gere mRNA limitado. Depois de determinar a concentração de mRNA e verificar sua integridade por eletroforese em gel, armazene as amostras em três ou mais alíquotas a 80 graus Celsius negativos até que estejam prontas para uso. Para experimentos de perda de função variante, obtenha embriões de acasalamentos naturais de peixe-zebra e mantenha-os a 28 graus Celsius em água de embriões em pratos de seis ou dez centímetros. Conduza uma curva de resposta à dose de morfolino injetando pelo menos três concentrações diferentes entre um a dez nanogramas em 50 a 100 embriões de peixe-zebra por dose. Morfolinos eficientes devem dar origem a aumentos dependentes da dose na proporção de embriões afetados em um lote. Ao realizar análises quantitativas ou qualitativas, se os embriões estiverem pontuados 24h após a fertilização ou mais tarde, trate os embriões com feniltioureia 24h após a fertilização para reduzir a formação de melanócitos. Para morfolinos bloqueadores de splice, teste a deficiência de morfolino extraindo RNA total de lisados de embriões inteiros no momento da pontuação fenotípica. Gerar cDNA e conduzir RT-PCR do gene alvo usando primers flanqueando o local alvo do morfolino. Para verificar a eficiência de supressão de um morfolino bloqueador de tradução, ou TBMO, se um anticorpo que reage de forma cruzada com a proteína do peixe-zebra estiver disponível, colha lisados de proteínas de embriões inteiros e conduza immunoblotting para comparar os níveis da proteína alvo versus controle. Se um anticorpo não estiver disponível, co-injete o mRNA do tipo selvagem com o TBMO para mostrar que ele resgata o fenótipo ou demonstre uma dependência de dosagem conforme descrito anteriormente. Se um fenótipo qualitativo foi observado, selecione uma dose de morfolino na qual 50% a 75% dos embriões sejam afetados. Para fenótipos quantitativos, escolha uma dose em que a medida fenotípica seja significativamente diferente do tipo selvagem. Em seguida, injete novos lotes de embriões com um coquetel contendo a dose de ensaio de morfolino e a curva de dosagem de mRNA humano do tipo selvagem. Em seguida, realize a pontuação mascarada dos lotes de injeção para determinar a dose de mRNA do tipo selvagem com o resgate mais significativo em comparação com o MO sozinho. Esta será a dose de ensaio de mRNA. Injetar novos lotes de embriões com as doses de ensaio de morfolino e mRNA humano mutante. Fenotipar os embriões no estágio apropriado e, usando um teste qui-quadrado ou t, comparar os resultados com um resgate com mRNA humano do tipo selvagem. Se não for observada perda de fenótipo de função com a injeção de morfolino, ou se o mRNA mutante der origem a fenótipos não significativamente diferentes do MO sozinho, injetar uma curva de dosagem de mRNA humano de tipo selvagem em lotes de embriões. Realize a pontuação fenotípica e determine a dose mais alta na qual não há um número estatisticamente significativo de embriões mortos e/ou afetados em comparação com controles não injetados. Esta é a dose do ensaio. Injetar a dose de ensaio de mRNA humano mutante, fenótipo dos embriões e comparar os resultados com a pontuação da injeção da dose de ensaio de mRNA humano de tipo selvagem ou a concentração de morfolino do ensaio. Se os resultados forem indistinguíveis do morfolino, titular o mRNA mutante com o mRNA do tipo selvagem e comparar com as injeções de mRNA do tipo selvagem humano e mutante. A melhoria dos fenótipos com lotes injetados de mRNA mutantes e selvagens indica um negativo dominante. Nenhuma melhora indica um ganho de função. Finalmente, para integrar os dados de patogenicidade do peixe-zebra in vivo com outras linhas de evidência, compare-os com dados genéticos dentro do pedigree, dados de frequência populacional de controle e estudos de proteínas baseadas em células in vitro. Aqui é mostrada uma avaliação quantitativa e qualitativa das mutações humanas de MKS1 modeladas em embriões de peixe-zebra. Com base na gravidade, os fenótipos são classificados em 3 grupos: Embriões injetados com morfolino com fenótipos de Classe I tinham morfologia grosseiramente normal, mas eram mais baixos com excesso de tecido embrionário na gema em comparação com os embriões injetados de controle. Os morfantes da Classe II eram finos, curtos e tinham estruturas de cabeça e cauda pouco desenvolvidas e, além disso, careciam de definição e simetria somíticas. Os embriões de classe III foram severamente atrasados com somitos pouco desenvolvidos e deformados, notocordas onduladas e normalmente não sobreviveram além do estágio 10 = somito. A co-injeção de mRNA humano e KS1 resgatou cada um desses defeitos, demonstrando especificidade dos fenótipos para supressão de MKS1. Os fenótipos foram quantificados medindo a distância do primeiro ao último somite apreciável em embriões corados com ribogravos krox20, pax2 e myoD no estágio de 11 somitos. Visto aqui é um modelo de peixe-zebra de dismorfologia craniofacial humana. Embriões injetados de mRNA controle e mutante foram corados com azul de Alcian cinco dias após a fertilização. Os embriões mutantes exibiam cabeças notavelmente menores e deformadas e uma desorganização geral do esqueleto craniofacial cartilaginoso, incluindo arcos branquiais abertos e estruturas ausentes ou malformadas. Cinco dias após a fertilização, um embrião injetado com morfante de macrocefalia exibe alargamento da cabeça visto pelo espaço entre os olhos. Neste exemplo de integridade vascular reduzida dois dias após a fertilização, os morfantes apresentam brotamento prejudicado de vasos intersegmentares e outras estruturas vasculares. A hibridização in situ de embriões selvagens não injetados mostra a expressão de patas no mesoderma da placa lateral esquerda, um controle para o loop cardíaco correto. Os embriões do morfante Ccdc39 apresentaram expressão bilateral ou, na maioria dos casos, indetectável de patas. Mostrado aqui, é mostrado um exemplo de um morfante Ift80 que desenvolve grandes cistos renais, edema pericárdico e cauda enrolada. Para visualizar a filtração glomerular reduzida, a rodamina dextrana foi injetada no coração e a fluorescência foi visualizada 24 horas depois. A fluorescência está ausente do embrião controle, onde se dispersa por todo o sistema vascular e é quase completamente evacuada pelo rim. O embrião do morfante Ift80 exibe um sinal de dextrana fluorescente persistente, sugerindo filtração glomerular reduzida. Neste modelo de distrofia muscular, os embriões injetados do tipo selvagem mostram miofibras lentas normais abrangendo os somitos entre os mioseptos adjacentes, conforme determinado pela imunocoloração usando um anticorpo anti-miosina lenta. Embriões injetados mutantes mostraram descolamento parcial a completo de miofibras de mioseptos em um ou vários somitos. Aqui são mostradas vistas laterais ao vivo de um controle não injetado e um morfante Kif7 30 horas após a fertilização. Como visto pela comparação do ângulo do somito, os morfantes exibem somitos de formato anormal, atribuíveis à sinalização ectópica do ouriço no miótomo do peixe-zebra.

- Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como desenvolver ensaios in vivo fisiologicamente relevantes, sensíveis e específicos para interpretar a variação humana na patologia usando o peixe-zebra como modelo de organismo.