Name: Avaliando fenótipos Neurodegenerativas em Drosophila Neurônios dopaminérgicos subindo Ensaios e toda Imunocoloração Cérebro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprenda a avaliar neurodegeneração em neurônios dopaminérgicos de Drosophila usando ensaios de escalada e imunocoloração de tirosina hidroxilase. Este método permite quantificar alterações funcionais e populacionais celulares.

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Agradecemos Leo Pallanck para as populações da mosca, Christine Sommers de assistência técnica e Gerasimos P. Sykiotis para discussões úteis. Este trabalho foi financiado pelo NIH formação concessão T32CA009363 para MCB

1. Sobressalto induzida Ensaio geotaxis Negativo <ol><li> Selecione moscas do genótipo desejado, separá-los por gênero, aleatoriamente agrupá-los em grupos de 20-30 animais e lançá-los em novos frascos de comida a cada 2-3 dias, teste cada conjunto de moscas (ou seja, grupos pareados por idade, uma coorte / genótipo) pelo menos uma vez por semana. </li><li> Trinta minutos antes do teste geotaxis negativo, anestesiar as moscas com CO 2 e colocá-los em tubos de plástico transparente pré-rotulados feitos com dois frascos vazios de alimentos (ver Tabela de Materiais) Cadastrado em suas aberturas com fita adesiva transparente (dimensões da câmara: 19 cm x 2,85 cm). Em nossos ensaios que normalmente usam 25 moscas / tubo. Nota. O tempo de recuperação da anestesia pode ser variada desde alguns minutos a várias horas (por exemplo, S / N) e devem ser optimizados para os genótipos específicos testados. </li><li> Marcar alturas diferentes (de 1 a 20 cm) sobre um pedaço de papel e fita de papel em uma as superfícies verticaise, perpendicular ao banco. </li><li> Coloque os tubos na frente do papel: os tubos devem estar todos alinhados e tão perto quanto possível do papel para permitir a medição da altura exata. </li><li> Coloque a câmera digital (consulte a tabela &quot;Equipamento Especial&quot;) na frente dos tubos, a uma distância de 20-30 cm do papel, em um suporte (por exemplo, uma caixa de ponteira), selecione a opção &quot;filme&quot; e começar gravação, neste momento você também deve iniciar um timer para controlar o tempo entre ensaios consecutivos. </li><li> Permitir que as moscas se acumulem na parte inferior do tubo, tocando o tubo durante alguns segundos (por exemplo, 10 segundos). Este passo deve ser realizado de forma consistente (ou seja, igual duração, a mesma força, o mesmo operador) durante todo o experimento. </li><li> Movimentos Record &#39;voa com a câmera digital de 10 seg. </li><li> Repita os passos de 1,5-1,7 catorze vezes em intervalos de um minuto. </li><li> Analisar os dados: <ol type="a"><li> Contar o número de moscas que estão acima do2 centímetros marca após 10 segundos por inspeção visual dos filmes gravados. Nota: Em nossas condições de ensaio geotaxis comportamento negativo das moscas não durou além do primeiro 10 segundos depois surpreendente (ou seja, moscas começaram a se mover em todas as direções 10 segundos depois surpreendente deles). A distância mínima subiu por moscas de controle (ou seja, 1 semana atrás moscas expressando o motorista THGal4, veja a legenda da Figura 1) nesta janela de tempo foi de 2 cm. Assim, foi utilizada a marca de 2 cm como referência para a análise das atividades de escalada de moscas de diferentes idades e genótipos de 10 segundos após o início do comportamento. Estes parâmetros podem exigir ajuste para ter em conta as diferenças no comportamento das moscas testados (devido, por exemplo, a diferentes origens genéticas ou condições de laboratório). Observe que em nossas condições de ensaio, todos os genótipos testados desempenho pior ou semelhante para as moscas do genótipo controle. </li><li> Tomar a média dos resultados dos quinzeprovações. </li><li> Média expresso como uma percentagem do número total de moscas no tubo (= actividade escalada%), o número de repetições (N) é dado por o número de grupos independentes testadas para cada genótipo </li><li> Avaliar a significância estatística entre os diferentes genótipos ao longo do tempo. Isto pode ser realizado com o teste t de Student (quando se compara dois genótipos) ou de uma análise ANOVA de 2 vias seguido pelo teste de Bonferroni post-hoc (ao realizar comparações múltiplas) utilizando programas comerciais, tais como o GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Jolla, CA, EUA). </li></ol></li></ol> Nota Realizamos todos os nossos ensaios na mesma hora do dia, à TA e sob as mesmas condições de iluminação. Mantendo as moscas em um ambiente de ciclo de 12 hr luz / escuro é aconselhável controlar o efeito dos ritmos circadianos no comportamento locomotor das moscas. 2. Tirosina hidroxilase ImunofluorescênciaEnsaio de Montes cérebro inteiro Soluções e tampões Solução fixadora: 4% de paraformaldeído (PFA) em tampão fosfato salino (PBS) Tampão de lavagem: 0,1% de Triton X-100 em PBS 0,1 M de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 0,15 M, 0,1% de Triton X-100 e 0,5% de BSA: Tampão de bloqueio Meios de montagem: Mowiol-Dabco (ver protocolo descrito no Harlow E, Lane D., Antibodies-Um manual de laboratório Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA, 10:418 (1988)) Procedimento <ol><li> Coloque moscas em um prato de dissecação enchido com 70% de EtOH durante cerca de 1 min para remover a cera cutícula. </li><li> Transferência voa para outro prato dissecção preenchido com PBS gelado. </li><li> Dissecar o cérebro: <ol type="a"><li> Coloque a voar com o lado ventral para cima (opcional: asas remover e pernas). </li><li> Puxe a cabeça para fora do corpo: use um conjunto de pinças parasegurar o corpo e outro para segurar a cutícula sob o olho para evitar danos ao cérebro </li><li> Retire a tromba. </li><li> Segurar o cutícula cabeça em lados opostos da fenda deixada em aberto após a remoção da tromba e puxar em direcções opostas até que o cérebro é retirado da cápsula cabeça. </li><li> Remova toda a cutícula do cérebro. </li><li> Remover todo o tecido traqueal cheia de ar, o que irá impedir o cérebro de flutuar durante as seguintes etapas de incubação. </li></ol></li><li> Cortar a poucos milímetros da ponta de uma ponta de pipeta P-200 e equilibrar com uma solução a 0,1% de Triton X-100/PBS </li><li> Com a ponta de pipeta P-200 preparados, transferir os cérebros para um tubo de 0,5 ml de Eppendorf encheu com 0,5 ml de 4% PFA / PBS e manter em gelo até que o esvaziamento está completo. </li><li> Corrigir os cérebros à temperatura ambiente durante 20 min: aplicar uma rotação suave, colocando os tubos Eppendorf em um rack e colocar o rack em um nutator. </li><li> Remover o fixadorusando um P-1000 micro-pipeta, adicionar 0,5 mL de 0,1% de Triton X-100/PBS, misturar por inversão e deixar incubar durante 1 min; repetir este passo de lavagem uma vez. </li><li> Remover o tampão de lavagem a partir da segunda, adicionar 0,5 mL de 0,1% de Triton X-100/PBS e deixar incubar à TA durante 20 min, repetindo este passo duas vezes. </li><li> Remover o tampão de lavagem e deixar os cérebros incubar em tampão de bloqueio (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 0,15 M, 0,1% de Triton X-100 e 0,5% de BSA) durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Incubar os cérebros com uma diluição de 1:100 de anticorpo anti-TH (consulte &quot;Tabela de reagentes específicos&quot;) em solução de bloqueio, por dois dias, a 4 ° C, com rotação suave (veja o passo 2.6.). </li><li> Repita os passos de lavagem 2.7. e 2.8 .. </li><li> Equilibrar os cérebros com uma diluição 1:200 de uma solução de bloqueio antibodyin secundário, durante dois dias, a 4 ° C, com rotação suave. </li><li> Repita os passos de lavagem 2.7. e 2.8 .. </li><li> Preparar as lâminas de fixação, como ilustrado na Figura 2A: <ol type="a"><li> Add 2 X 25 gotas ul de meios de montagem para uma cobertura de vidro (24 x 60 mm, n. 1.5). </li><li> Coloque dois copos de cobertura (tamanho 18 x 18 mm, não. 2) sobre os meios de montagem, deixando uma lacuna no meio do slide e deixe secar. </li></ol> Nota. Verifique o suporte de amostras no palco do seu microscópio confocal. Você pode fazer a tampa de vidro do mesmo tamanho de um x 75 mm Slide 25, anexando a 22 x 22 mm 1,5 tampa de vidro de uma das extremidades (usar unha polonês e fita). </li><li> Retire o tampão de lavagem, adicionar 50 mL de meios de montagem e permitir que os cérebros para equilibrar com ele por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Utilizando um corte de P-200 a ponta da pipeta (ver passo 2.4), transferir os cérebros para a corrediça no espaço entre as duas lamelas e cobri-los com uma lamela não. 1.5 (ver Figura 2A, para orientar os cérebros no slide ver 7). Observação: as amostras são montadas entre dois vidros de cobertura para permitir a visualização tanto do anterior e posterior lado do cérebro. </li><li> Preencher todo o espaço entre os vidros da tampa com meios de montagem; pipeta de um canto para retirar todo o ar e deixe secar e selar com unha polonês. </li><li> Para avaliar o número de neurónios dopaminérgicos em um conjunto específico adquirir uma série de secções ópticas ao longo do eixo z com um passo de 1,0 uM de tamanho utilizando um microscópio confocal (anatómica para a identificação de grupos dopaminérgicos no cérebro adulto de Drosophila ver 7). </li></ol>

<ol><li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly,, Botella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li>
<li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li>
<li>Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+in+Drosophila+dopaminergic+cells+using+regulatory+sequences+from+tyrosine+hydroxylase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase.</a> J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li>
<li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurol.+Disord.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).</li>
<li>Lundell, M., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spacial+development+of+serotonin+and+dopamine+neurons+in+the+Drosophila+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS.</a> Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).</li>
<li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil%3A+anatomical+and+physiological+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5(2009).</li>
<li>Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-Synuclein+Transgenic+Drosophila+As+a+Model+of+Parkinson%27s+Disease+and+Related+Synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies.</a> Parkinsons Dis. 2011, 212706(2011).</li>
<li>Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+and+senescence+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster.</a> Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).</li>
<li>Trinh, K., Moore, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+phase+II+detoxification+pathway+suppresses+neuron+loss+in+Drosophila+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease.</a> J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).</li>
<li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205(2010).</li>
<li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li>
<li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li>
</ol>

Nós declaramos que não temos interesses financeiros concorrentes.

Os ensaios descritos aqui proporcionam uma abordagem útil para estudar o papel de genes específicos, as vias de sinalização ou de compostos pequenos na manutenção de neurónios DA em envelhecimento, bem como em diferentes fundos genéticos doenças ligadas (revisto em 5). O comportamento negativo geotaxis sobressalto induzida de Drosophila tem sido amplamente utilizada como um funcional leia-out para a funcionalidade do AD neurônios em diferentes origens genéticas, particula...

A especificidade dos ensaios descritos aqui baseia-se no uso de uma linha de mosca Gal4 que explora as sequências reguladoras do gene da hidroxilase de tirosina, para conseguir a expressão específica de neurónios dopaminérgicos 3. Tirosina hidroxilase catalisa a primeira e passo limitante da velocidade na síntese de dopamina. Imunorreactividade TH na mosca sobrepõe cérebro adulto com a da dopamina, tornando TH um bom candidato para identificar neurónios DA in vivo (ver, por exemplo 6). Além disso, o padrão de expressão THGal4 é mais específico do que a de outras linhas, tais como Gal4 DdcGal4, que contém as sequências reguladoras a partir do gene da dopa descarboxilase e dirige a expressão transgénica não apenas em neurónios DA, mas também nos neurónios serotoninérgicos e subconjuntos de células gliais 3 . Feany e Bender (2000) observaram pela primeira vez que a expressão de pan-neuronal do gene α-sinucleína humana DP-linked acelera a perda progressiva de stageotaxis comportamento negativo rtle induzida em Drosophila. Temos observado resultados similares usando a linha DA-neurônio específico THGal4 para conduzir o expressionof uma α-sinucleína transgene 10 e usou este funcional de leitura para estudar o papel neuroprotetor da via Nrf2 neste Drosophila modelo de PD 14. O ensaio específico aqui descrito é adaptado a partir de 2 e 3. O cérebro de Drosophila contém mais de 100 neurónios DA, dispostos em, pelo menos, cinco grupos diferentes (PPL1, PPL2, PAL PPM1 / 2, ppm3) que podem ser visualizados nos seus suportes de a totalidade do cérebro por meio de microscopia confocal (ver, por exemplo, 11 e 7). É ainda controverso se o número de neurónios DA em declínios cerebrais Drosophila com 9 anos de idade, 11, no entanto, dependente da idade, a neurodegeneração é observada nas moscas onde os genes PD-linked foram mutados / overexpressed para modelar doenças humanas5. A expressão de humano α-sinucleína em DA neurónios tem tal efeito e, consequentemente, tem sido utilizada como um modelo para a DP. Aqui nós descrevemos um ensaio para neurônios DA contar no cérebro todo montado usando TH como um marcador de células. Este ensaio foi adaptado a partir de 13 e 10.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo anti-tirosina hidroxilase de coelho</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-IgG de coelho marcado com TRITC de burro</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-026-152</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipamento</td></tr><tr><td>Vials de poliestireno</td><td>VWR</td><td>89092-734</td><td>28.5 x 95 mm</td></tr><tr><td>Câmera digital</td><td>Canon</td><td>PowerShot A3100IS (modelo)</td><td>12.1 Megapixels 4X Zoom Óptico</td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura de vidro nº 1.5</td><td>VWR</td><td>48366 205 48393 252</td><td>Tamanhos: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura de vidro nº 2</td><td>VWR</td><td>48368-040</td><td>Tamanho: 18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Pratos de dissecação</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70543-01</td><td>Tamanho: 30 mm O.D.</td></tr><tr><td>Pinças Dumostar nº 5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72705-01</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000 (modelo)</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Leica</td><td>SP2 ou SP5 (modelo)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela de Materiais.</td></tr></tbody></table>

avaliando fenótipos neurodegenerativas em<em&gt; drosophila</em&gt; neurônios dopaminérgicos subindo ensaios e toda imunocoloração cérebro

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster é um organismo modelo valioso para estudar processos degenerativos do envelhecimento e patológicas do sistema nervoso. As vantagens da mosca como um sistema experimental incluir sua rastreabilidade genética, vida curta ea possibilidade de observar e analisar quantitativamente os comportamentos complexos. A expressão de genes ligados à doença em populações neuronais específicas do cérebro de Drosophila, pode ser usado para modelar doenças neurodegenerativas humanas, tais como a doença de Parkinson e de Alzheimer 5. Dopaminérgicos (DA) neurônios estão entre as populações mais vulneráveis ​​neuronais no cérebro humano envelhecimento. Na doença de Parkinson (DP), a desordem de movimento neurodegenerativa mais comum, a perda acelerada de DA neurónios conduz a uma deterioração progressiva e irreversível da função locomotora. Além da idade e exposição a toxinas ambientais, a perda de neurónios DA é exacerbado por mutações pontuais no codificanteou regiões promotoras dos vários genes. A identificação de tais alelos DP associados fornece a base experimental para a utilização de Drosophila como um modelo para estudar a neurodegeneração de neurónios DA in vivo. Por exemplo, a expressão do gene α-sinucleína humana PD-ligados em Drosophila neurônios DA recapitula algumas características da doença humana, por exemplo, perda progressiva de neurônios DA e declínio da função locomotora 2. Assim, este modelo tem sido utilizado com sucesso para identificar potenciais alvos terapêuticos na DP 8. Aqui nós descrevemos dois ensaios que têm sido comumente usados ​​para estudar a neurodegeneração idade-dependente de Da neurônios em Drosophila: um ensaio de escalada com base na resposta de sobressalto geotaxis negativa induzida e tirosina hidroxilase immunostaining de cérebro adulto todo monta para monitorar o número de neurônios DA em diferentes idades. Em ambos os casos, a expressão in vivo de t UASransgenes especificamente em neurónios DA pode ser conseguido através de uma tirosina-hidroxilase (TH)-Gal4 promotor de linha de condutor 3, 10.

Usamos os ensaios descritos aqui para estudar o papel do protector via Nrf2 o stress num modelo de Drosophila de DP 14. Este modelo baseia-se na expressão do gene α-sinucleína humana em neurónios DA utilizando um condutor de Gal4 TH 2, 10. A Figura 1 mostra um resultado representativo de um sobressalto induzidas geotaxis negativos (subida) de ensaio nas moscas macho que expressam transgenes diferentes sob o controlo do controlador de TH Gal4. T...

Aqui nós descrevemos dois ensaios que foram estabelecidos para estudar neurodegeneração idade-dependente de dopaminérgicos (DA) neurônios<em&gt; Drosophila</em&gt;: A escalada / ensaio geotaxis negativa induzida sobressalto que permite estudar os efeitos funcionais de neurónios DA degeneração e a imunomarcação de tirosina-hidroxilase, que é usado para identificar e contar os neurónios do cérebro de DA em montagens inteiras.

Avaliando fenótipos Neurodegenerativas em<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurônios dopaminérgicos subindo Ensaios e toda Imunocoloração Cérebro

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a neurodegeneração dos neurônios dopaminérgicos em drosophila transgênica. Isso é realizado primeiro expressando os transgenes desejados sob o controle do promotor da tirosina hidroxilase através do sistema GAL quatro UAS. A segunda etapa do procedimento é coletar moscas do genótipo desejado, separá-las por gênero e ensiná-las.A terceira etapa é testar a atividade de escalada das moscas por meio do eixo geo negativo à medida que envelhecem. A etapa final é contar o número de neurônios dopaminérgicos de cérebros dissecados coletados em diferentes idades. Em última análise, os resultados mostrarão mudanças no comportamento locomotor do animal e no tamanho de sua população de neurônios dopaminérgicos.As implicações desta abordagem se estendem à terapia de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson. Esta abordagem pode ajudar a identificar genes neuroprotetores e intervenções farmacológicas. Para configurar o ensaio, selecione moscas com idade correspondente dos genótipos desejados. Separe-os por gênero e aleatoriamente em grupos de 20 a 30 animais.Cada coorte representa uma amostra estatística. Mantenha as coortes em um ciclo de luz escura de 12 horas para controlar os efeitos dos ritmos circadianos no comportamento locomotor, e em uma temperatura que possa ser replicada na sala de teste. Troque os frascos da coorte a cada dois ou três dias e teste-os semanalmente em um horário consistente.30 minutos antes do teste, anestesie cada coorte com dióxido de carbono e transfira-as para um tubo de plástico rotulado feito de frascos de comida vazios unidos com fita adesiva. As moscas devem estar acordadas após cinco a 10 minutos, mas a recuperação completa da anestesia varia com a idade e o genótipo e deve ser otimizada.Agora. Crie uma escala de altura para visualizar atrás dos frascos de teste.Marque distâncias entre um e 20 centímetros em um pedaço de papel branco. Em seguida, fixe a escala na posição. Agora alinhe os tubos a serem testados contra a escala a cerca de 20 a 30 centímetros de distância.Posicione uma câmera digital com uma visão quadrada dos frascos. Certifique-se de que os rótulos nos tubos e na escala estejam claramente à vista. Uma vez posicionado, inicie a gravação e inicie um temporizador digital.Agora, toque um tubo por alguns segundos. Todas as moscas devem coletar o fundo do tubo. Certifique-se de fazer essa etapa consistentemente com a mesma duração e mesma força durante todo o experimento.Após um minuto, repita o knockdown novamente para o segundo de 15 ensaios consecutivos. Quando os 15 ensaios forem concluídos, devolva as moscas a frascos novos, inspecionando visualmente os filmes. Para cada um dos 15 ensaios realizados por coorte, conte o número de moscas acima da marca de dois centímetros.Após 10 segundos, a marca de dois centímetros é determinada empiricamente, é a distância que todos os controles cruzam após 10 segundos em muitas das idades sendo testadas. Tome a pontuação média dos 15 ensaios e expresse-a como uma porcentagem de membros da coorte que cruzaram a marca. O número de repetições estatísticas é igual ao número de coortes testadas para cada grupo, não pelas 15 tentativas.Avalie a significância estatística entre diferentes genótipos usando um teste T de estudante, anova ou outros métodos apropriados de análise. Coloque as moscas em uma cuba de dissecação com 70% de etanol por cerca de um minuto. Para remover a cera da cutícula.Em seguida, transfira as moscas para outra cuba de dissecação cheia de PBS gelado e prossiga com a dissecação do cérebro. Posicione a mosca com o lado ventral para cima e opcionalmente remova as asas e as pernas. Use um conjunto de pinças para segurar o corpo e outro para segurar a cutícula sob o olho.Em seguida, puxe a cabeça para longe do corpo. Em seguida, remova o probos puxando-o da cabeça. Em seguida, agarre a cutícula da cabeça nas bordas opostas do novo orifício e puxe em direções opostas até que o cérebro seja removido da cápsula cefálica.Agora, remova delicadamente o restante da cutícula da superfície do cérebro. Em seguida, remova todo o tecido traqueal cheio de ar. Isso impedirá que o cérebro flutue durante as etapas de incubação seguintes.Prepare uma pipeta de manipulação de cérebro a partir de uma ponta de pipeta P 200. Corte alguns milímetros e equilibre-a com 0,1% de Triton X 100 em PBS. Transfira os cérebros para um tubo de meio mililitro completamente preenchido com 4% de PFA em PBS.Fixe os cérebros à temperatura ambiente por 20 minutos com rotação suave. Após 20 minutos, use uma pipeta P 1000 para substituir o fixador por meio mililitro de tampão de lavagem sendo 0,1% de Triton X 100 em PBS. Misture por inversão e deixe os cérebros incubar por um minuto antes de substituir o tampão de lavagem.Após um minuto, substitua o tampão de lavagem uma segunda vez e incube os cérebros à temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, substitua o tampão de lavagem pela terceira vez e incube os cérebros por mais 20 minutos. Agora, remova o tampão de lavagem e deixe os cérebros incubar em meio milímetro de tampão de bloqueio por uma hora à temperatura ambiente.Depois de uma hora, adicione uma diluição de um para 100 de anticorpo antit em solução de bloqueio. Deixe incubar por dois dias a quatro graus Celsius com rotação suave. Para remover o bloqueio, repita as lavagens usadas para remover o fixador.Em seguida, equilibre os cérebros com meio mililitro de uma diluição de um para 200 de anticorpo secundário em solução de bloqueio por dois dias a quatro graus Celsius com rotação suave. Alguns dias depois, remova o anticorpo secundário usando o mesmo procedimento de lavagem. Para preparar as lâminas de montagem, adicione 2 gotas de 25 microlitros de meio de montagem em um porta-objetos.Coloque dois porta-objetos sobre o meio de montagem com um espaço no meio. Deixe as lâminas secarem. Se a largura da lâmina de montagem não se encaixar no estágio do microscópio confocal, use esmalte para anexar um porta-objetos de 22 por 22 milímetros à lâmina para que se ajuste corretamente.Agora substitua a solução em que os cérebros estão com 50 microlitros de meio de montagem. Equilibre os cérebros com o meio de montagem pipetando com uma ponta P 200 cortada. Em seguida, use uma ponta P 200 cortada para transferir os cérebros para a trincheira.Na lâmina de montagem, oriente os cérebros para visualizar seu lado anterior ou posterior. Em seguida, cubra-os com uma lâmina de cobertura de número 1,5 e, de um canto, preencha o espaço entre as lâminas de cobertura com meio de montagem para remover todo o ar. Deixe as lâminas secarem e, em seguida, sele-as com esmalte antes de seu exame.A alfa-sinucleína humana foi expressa em neurônios DA usando o driver TH GAL quatro no ensaio de escalada. Machos expressando este transgene exibiram um

assessing-neurodegenerative-phenotypes-drosophila-dopaminergic

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Ensaios de comportamento para as funções de medição de locomoção, aprendizado e habilidades de memória...

Locomotor ensaio, Aprendizagem e Memória Os déficits no Drosophila Modelos de neurodegeneração

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Apresentamos um ensaio de geotaxia negativa otimizado, barato e confiável em Drosophila melanogaster como modelo para doenças neurodegenerativas. Sendo mais sensível a defeitos locomotores leves, este ensaio ajudará a rastrear possíveis interações genéticas e alvos de drogas.

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Mass Histologia para quantificar neurodegeneração em<em&gt; Drosophila</em

Este protocolo descreve a dissecção e imunocoloração de adultos Drosophila melanogaster tecidos do cérebro. Especificamente, este protocolo destaca o uso da Drosophila cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios como subconjuntos neuronal de exemplo que podem ser usados com precisão para descobrir princípios gerais subjacentes a muitos aspectos do desenvolvimento neuronal.

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Este passo a passo protocolo analisa o comportamento de geotaxis negativo de drosófila usando um sistema automatizado de vários cilindro que hospeda centenas de moscas e sincroniza a sua acção por um motor elétrico. Após a sincronização, comportamento de voar geotaxis negativo é analisado, digitalmente gravada e analisados utilizando o software RflyDetection auto-concebidos.

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