Avaliando fenótipos Neurodegenerativas em Drosophila Neurônios dopaminérgicos subindo Ensaios e toda Imunocoloração Cérebro

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a neurodegeneração de neurônios dopaminérgicos em drosófilas transgênicas. Isso é feito expressando primeiro os transgenes desejados sob o controle do promotor da tirosina hidroxilase por meio do sistema GAL quatro UAS. A segunda etapa do procedimento é coletar moscas do genótipo desejado, separá-las por sexo e envelhecê-las.

O terceiro passo é testar a atividade de escalada das moscas pelo geoeixo negativo à medida que envelhecem. A etapa final é contar o número de neurônios dopaminérgicos de cérebros dissecados coletados em diferentes idades. Em última análise, os resultados mostrarão mudanças no comportamento locomotor do animal e no tamanho de sua população de neurônios dopaminérgicos.

As implicações dessa abordagem se estendem à terapia de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson. Essa abordagem pode ajudar a identificar genes neuroprotetores e intervenções farmacológicas Para configurar o ensaio, selecione moscas com idade correspondente dos genótipos desejados. Separe-os por gênero e agrupe-os aleatoriamente em coortes de 20 a 30 animais.

Cada coorte representa uma amostra estatística. Manter as coortes em um ciclo claro escuro de 12 horas para controlar os efeitos dos ritmos circadianos no comportamento locomotor e a uma temperatura que possa ser replicada na sala de testes. Troque os frascos da coorte a cada dois ou três dias e teste-os semanalmente em um horário consistente.

30 minutos antes do teste, anestesiar cada coorte com dióxido de carbono e transferi-los para um tubo de plástico rotulado feito de frascos de comida vazios unidos com fita adesiva. As moscas devem estar acordadas após cinco a 10 minutos, mas a recuperação completa da anestesia varia com a idade e o genótipo e deve ser otimizada. Agora. Crie uma escala de altura para visualizar atrás dos frascos de teste.

Marque distâncias entre um e 20 centímetros em um pedaço de papel branco. Em seguida, prenda a balança na posição. Agora alinhe os tubos a serem testados contra a escala a cerca de 20 a 30 centímetros de distância.

Posicione uma câmera digital com uma visão quadrada dos frascos. Certifique-se de que as etiquetas nos tubos e na balança estejam claramente à vista. Uma vez posicionado, inicie a gravação e inicie um temporizador digital.

Agora bata em um tubo por alguns segundos. Todas as moscas devem coletar o fundo do tubo. Certifique-se de fazer esta etapa de forma consistente com a mesma duração e a mesma força durante todo o experimento.

Depois de um minuto, repita o knockdown novamente pela segunda das 15 tentativas consecutivas. Quando os 15 testes estiverem concluídos, devolva as moscas a frascos novos, inspecionando visualmente os filmes. Para cada uma das 15 tentativas realizadas por coorte, conte o número de moscas acima da marca de dois centímetros.

Após 10 segundos, a marca de dois centímetros é determinada empiricamente, é a distância que todos os controles cruzam após 10 segundos em muitas das idades que estão sendo testadas. Pegue a pontuação média dos 15 ensaios e expresse-a como uma porcentagem dos membros da coorte que cruzaram a marca. O número de repetições estatísticas é igual ao número de coortes testadas para cada grupo, não pelos 15 ensaios.

Avalie a significância estatística entre diferentes genótipos usando o teste T de Student, anova ou outros métodos apropriados de análise. Coloque as moscas em uma placa de dissecação com etanol a 70% por cerca de um minuto. Para remover a cera da cutícula.

Em seguida, transfira as moscas para outro prato de dissecação cheio de PBS gelado e prossiga com a dissecação do cérebro. Posicione a mosca com o lado ventral para cima e, opcionalmente, remova as asas e as pernas. Use um conjunto de pinças para segurar o corpo e outro para segurar a cutícula sob o olho.

Em seguida, puxe a cabeça para longe do corpo. Em seguida, remova os probos puxando-os para fora da cabeça. Em seguida, segure a cutícula da cabeça nas bordas opostas do novo orifício e puxe em direções opostas até que o cérebro seja removido da cápsula da cabeça.

Agora, delicadamente, remova a cutícula restante da superfície do cérebro. Em seguida, remova todo o tecido traqueal cheio de ar. Isso impedirá que o cérebro flutue durante as etapas de incubação a seguir.

Prepare uma pipeta de manuseio cerebral a partir de uma ponta de pipeta P 200. Corte alguns milímetros e equilibre-o com 0,1% Triton X 100 em PBS. Transfira os cérebros para um tubo de meio mililitro completamente preenchido com 4% de PFA em PBS.

Fixe os cérebros em temperatura ambiente por 20 minutos com rotação suave. Após 20 minutos, use uma pipeta P 1000 para substituir o fixador por meio mililitro de tampão de lavagem sendo 0,1% Triton X 100 em PBS. Misture por inversão e deixe os cérebros incubarem por um minuto antes de recolocar o tampão de lavagem.

Após um minuto, substitua o tampão de lavagem uma segunda vez e incube os cérebros em temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, substitua o tampão de lavagem pela terceira vez e incube os cérebros por mais 20 minutos. Agora, remova o tampão de lavagem e deixe os cérebros incubarem em meio milímetro de tampão de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente.

Após uma hora, adicionar uma diluição de um a 100 de anticorpo anti-T na solução de bloqueio. Deixe incubar por dois dias a quatro graus Celsius com rotação suave. Para remover o bloco, repita as lavagens usadas para remover a correção.

Em seguida, equilibre os cérebros com meio mililitro de diluição de um a 200 de anticorpo secundário em solução de bloqueio por dois dias a quatro graus Celsius com rotação suave. Alguns dias depois, remova o anticorpo secundário usando o mesmo procedimento de lavagem. Para preparar as lâminas de montagem, adicione 2 gotas de 25 microlitros de mídia de montagem a uma lamínula.

Coloque dois vidros de cobertura na mídia de montagem com um espaço no meio. Deixe as lâminas secarem. Se a largura da lâmina de montagem não se encaixar no estágio do microscópio confocal, use esmalte para prender uma lamínula de 22 por 22 milímetros à lâmina para que ela se encaixe corretamente.

Agora substitua a solução em que os cérebros estão por 50 microlitros de mídia de montagem. Equilibre os cérebros com a mídia de montagem pipetando com uma ponta P 200 cortada. Em seguida, use uma ponta P 200 cortada para transferir os cérebros para a trincheira.

No slide de montagem, oriente os cérebros para visualizar seu lado anterior ou posterior. Em seguida, cubra-os com uma lamínula número 1,5 e, de um canto, preencha o espaço entre os vidros de cobertura com mídia de montagem para remover todo o ar. Deixe as lâminas secarem e depois sele-as com esmalte antes do exame.

A alfa-sinucleína humana foi expressa em neurônios DA usando o driver TH GAL quatro no ensaio de escalada. Os machos que expressam este transgene exibiram um declínio acelerado em relação aos controles pareados por idade e voaram como coex expressando o parceiro de ligação NRF 2D NA. As fêmeas Math S mostraram resultados semelhantes comparando moscas machos de quatro semanas de idade de diferentes genótipos.

As contagens de neurônios DA baseadas em imunofluorescência foram usadas para quantificar o número de neurônios PPL um. Uma perda pequena, mas significativa, de neurônios PPL um foi encontrada em moscas que expressam alfa-sinucleína. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a neurodegeneração dos neurônios varg em zoa transgênicos por ensaios de CLA e imunofluorescência da tirosina aase.

Obrigado por assistir.