Name: Recombineering Construções recombinação homóloga em Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Aprenda a gerar vetores de recombinação homóloga em Drosophila usando técnicas de recombineering. Este método permite criar mutações nulas e marcar proteínas endógenas com precisão genética.

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Gostaríamos de agradecer ao Banco de Bloomington Centro de reagentes e Hugo Bellen. Agradecemos mais Koen Venken, Hugo Bellen e todos os membros da Buszczak e Hiesinger laboratórios para discussões úteis. Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional de Saúde para ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) e MB (RO1GM086647), a concessão pelo Cancer Prevention Research Institute of Texas a MB e PRH (RP100516), eo Welch Fundação (I-1657) para PRH. MB é um EE e Greer Garson Fogelson Scholar em Investigação Biomédica e PRH é um Eugene McDermott Scholar em Investigação Biomédica pelo UT Southwestern Medical Center.

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<li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene targeting by homologous recombination in Drosophila.</a> Science. 288, 2013-2018 (2000).</li>
<li>Gong, W. J., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ends-out%2C+or+replacement%2C+gene+targeting+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).</li>
<li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36(2005).</li>
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<li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+P%5Bacman%5D+BAC+libraries+for+transgenesis+studies+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster.</a> Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).</li>
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<li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).</li>
<li>Chan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Rab+GTPases+with+synaptic+functions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila.</a> Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).</li>
<li>Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+recombineering+and+ends-out+homologous+recombination+to+systematically+characterize+Drosophila+gene+families%3A+Rab+GTPases+as+a+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study.</a> Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).</li>
<li>Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+DNA+electrotransformation+efficiency+in+Escherichia+coli+DH10B+electrocompetent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Electronic+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells.</a> Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).</li>
<li>Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+positive%2Fnegative+selection+scheme+for+precise+BAC+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering.</a> Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134, 3571-3584 (2007).</li>
<li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses conflitantes no que diz respeito às técnicas descritas aqui.

O poder de organismos modelo genético em pesquisa biomédica é em grande parte baseado nas ferramentas disponíveis para a manipulação genética. Os modelos pequenos C. elegans e Drosophila em particular, permitir análises genéticas moleculares barato e rápido de caminhos completos e famílias de genes implicados no desenvolvimento multicelular ou função. Nos últimos anos houve avanços significativos no desenvolvimento de ferramentas para manipulação de genes em Drosophila 14,15. Por ex...

Limpe manipulações molecularmente definidos de genes individuais em seus loci endógenos oferecer uma ferramenta de valor inestimável para o estudo de uma miríade de questões relevantes para a biologia dos eucariotas. Drosophila reverter técnicas genéticas para a geração de alelos de perda de função tinha provado ser um desafio até Golic e colegas introduziram em segmentação de genes in vivo utilizando recombinação homóloga de Drosophila 1-3. Eles demonstraram que o locus genómico específicos podem ser alvo utilizando um fragmento linear de ADN a partir de uma construção transgénica integrado. Este DNA linear &quot;dador&quot; é gerado in vivo por meio de recombinação FRT-mediada (para excisar o ADN do cromossoma como uma molécula circular), seguido por linearização com a meganuclease I-Scel. Embora esta metodologia tem sido utilizada com sucesso para gerar uma variedade de lesões definidos, a técnica não tem sido facilmente adaptar para a manipulação de vários genes em paralelo, porque cada indivíduoconstrução dupla de nocaute requer design distinto e personalizado. Por exemplo, as dificuldades em manipular facilmente grandes fragmentos de ADN (&gt; 5 kb) in vitro, usando a enzima de restrição clássica / ligadura clonagem ou PCR, bem como as limitações de tamanho da tradicional, em vectores de transformação in vivo, interferem frequentemente com a criação rápida de recombinação homóloga segmentação vetores. Para superar essas limitações, nós combinamos a P [acman] sistema recombineering / transgenia, que permite a sub-clonagem e transgênese de até 100 kb de DNA, com o fim-out gene metodologia visando a estabelecer uma plataforma eficiente e relativamente rápida que facilita gene Drosophila segmentação. Recombinação mediada por engenharia genética (recombineering) é um poderoso recombinação homóloga baseada em tecnologia de clonagem 4,5. Em contraste com a enzima / ligase de clonagem convencional restrição, recombineering não é limitado pela sequência ou size do DNA manipulado. Recombineering utiliza uma E. especial coli que alberga maquinaria de recombinação é fornecida por um profago defeituoso λ 4. Esta técnica foi recentemente aprovada para uso em Drosophila 6,7. Recombineering em Drosophila depende de um cromossoma alterado condicionalmente amplificável bacteriano artificial (BAC) vetor chamado P [acman] 6,7. Este vector transporta duas origens de replicação: oriV, que produz maior número de cópia por indução química, para a purificação de grandes quantidades de ADN necessárias para a sequenciação e injecção de embriões e oris, que mantém baixo número de cópia em condições basais. Além disso, o P [acman] vector é equipado com um acessório local bacteriana (attB). O local attB serve como um substrato para a integrase ΦC31 transgénese mediada que permite a incorporação de grandes fragmentos de ADN num local de pouso predeterminado dentro do genoma de Drosophila 8,9. Geramos um P [acman] vetor (referido como P [acman]-KO 1.0) que pode ser usado como um vector-alvo termina para fora recombinação homóloga 10,11. Para incorporar fins-out gene targeting tecnologia no sistema, nós adicionamos dois FRT e dois locais I-SCEI. Incluímos também uma cassete gateway dentro desse vetor modificado para agilizar o processo de incorporação dos braços de homologia em P [acman]-KO 1.0. Isso fornece uma maneira rápida e simples para introduzir praticamente qualquer região genômica de interesse no vetor alvo. Neste protocolo, irá descrever como projetar um vetor alvo usando P [acman]-KO 1.0, e como mobilizar esse vetor in vivo para atingir o locus endógeno. Para o propósito deste protocolo usaremos o cassete RFP / Kan para substituir um gene de interesse, mas uma variedade de cassetes que contêm um marcador de selecção de antibiótico pode ser usada com este protocolo. Temos desenvolvido e utilizado com sucesso um conjunto de cassetes parasubstituição de genes de marcação e 10,11.

<table><tbody><tr><td>SW102 Bactérias competentes para recombinação</td><td>NCI-Frederick</td><td>Bactérias de recombinação (SW102, SW105 e SW106)</td><td><a href="http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx" target="_blank">http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx</a></td></tr><tr><td>TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli</td><td>Epicentre</td><td>EC300110</td><td>Inclui CopyControl solução de indução</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polimerase</td><td>Aligent Technology Inc.</td><td>600670</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>Use Gateway BP ClonaseII Kit enzimático</td><td>Invitrogen</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>P[acman]KO1.010</td><td>Buszczak e Hiesinger Labs</td><td>Mediante solicitação</td><td></td></tr><tr><td>pENTR RFP-Kan11</td><td>Buszczak e Hiesinger</td><td>Labs Upon Flystocks</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bloomington stock center</td><td>Números de estoque: 25680, 25679</td><td>y1 w*/Dp(2; Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2; Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1</td></tr><tr><td>Máquina de eletroporação</td><td>Biorad GenePulser Xcell com módulo de PC</td><td>165-2662</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetes</td><td>Marca</td> <td>Fisher#FB101</td><td></td></tr></tbody></table>

recombineering construções recombinação homóloga em<em&gt; drosophila</em

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

A continuação do desenvolvimento de técnicas para a manipulação rápida e em grande escala de loci de genes endógenos vai alargar a utilização de Drosophila melanogaster como um organismo modelo genético para investigação relacionada com a doença humana-. Nos últimos anos houve avanços técnicos e recombineering como recombinação homóloga. No entanto, a geração de mutações nulas inequívocos ou proteínas endógenas marcação continua a ser um esforço substancial para a maioria dos genes. Aqui, nós descrevemos e demonstrar as técnicas para a utilização de métodos de clonagem baseados em recombineering para gerar vectores que podem ser utilizados para alvejar e manipular loci endógenas in vivo Especificamente, nós estabelecemos uma combinação de três tecnologias: (1). BAC transgénese / recombineering, ( 2) termina-a recombinação homóloga e (3) de tecnologia de gateway para fornecer um método robusto, flexível e eficiente para a manipulação de loci genómicas endógenos. Neste protocolo, nós fornecemos detalhes passo-a-passo sobre como (1) projeto individuavetores l, (2) como clonar grandes fragmentos de DNA genômico no vetor recombinação homóloga utilizando reparação lacuna, e (3) como substituir ou marcar genes de interesse dentro desses vetores usando uma segunda rodada de recombineering. Finalmente, vamos também fornecer um protocolo de como mobilizar esses cassetes in vivo para gerar um nocaute ou um gene marcado via knock-in. Estes métodos podem ser facilmente adotado para alvos múltiplos em paralelo e fornecer meios para manipular o genoma de Drosophila em uma maneira oportuna e eficiente.

Ampliação da LA e os braços de homologia com AR deve produzir 500 produtos bp ea reação de PCR-SOE deve produzir um produto de 1,0 kb (Seções 2,1-2,4; Figura 2). A reação BP realizada na seção 2.5 é tipicamente transformação muito eficiente e bacteriana dos rendimentos produtos 5-100 colônias em média. Quase todas as colônias testadas com PCR verificar mostrar o produto de PCR esperado. Durante a primeira rodada de recombineering (Seção 3) espera obter colônias 20-40 após a ...

Técnicas de recombinação homóloga avançar muito<em&gt; Drosophila</em&gt; Genética, permitindo a criação de mutações molecularmente precisas. A recente adopção recombineering permite manipular grandes pedaços de DNA e transformá-los em<em&gt; Drosophila</em<sup&gt; 6</sup&gt;. Os métodos aqui apresentados combinar estas técnicas para gerar rapidamente grandes vectores de recombinação homóloga.

Recombineering Construções recombinação homóloga em<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar rapidamente grandes vetores de recombinação homóloga que possam ser usados para direcionar e manipular locos oph endógenos. Isso é realizado primeiramente selecionando um clone vetorial que cubra a região genômica de interesse. O segundo passo do procedimento é clonar braços de homologia em um vetor de recombinação homóloga.O terceiro passo é clonar o DNA genômico no vetor de recombinação homóloga utilizando reparo de lacuna. O passo final é substituir a região genômica pelo cassete de direcionamento. Em última análise, esses procedimentos irão construir um vetor de direcionamento para recombinação homóloga Enzo, a fim de gerar mutações nulas inequívocas ou marcar proteínas endógenas em drosófila por meio do uso de técnicas baseadas em recombinação.Além disso, o manuscrito escrito também inclui um protocolo para mobilizar esses cassetes in vivo a fim de gerar um gene nulo ou um gene marcado por meio de inserção direcionada. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela pode ser facilmente adaptada para múltiplos alvos em paralelo, fornecendo um meio para manipular o genoma de oph de maneira rápida e eficie

recombineering-homologous-recombination-constructs-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Produção de C. elegans Transgenes via Recombineering com o GalK Marcador selecionável

Neste vídeo, descrevemos a técnica de Southern blotting para identificar eventos de recombinação homóloga no genoma de células-tronco embrionárias de camundongos usando sondas radiomarcadas. As regiões de DNA contendo eventos de recombinação homóloga aparecem como bandas distintas quando a membrana contendo o DNA ligado à sonda é exposta a raios-X.

Southern Blotting para detectar recombinação homóloga no genoma de células-tronco embrionárias de camundongos

Metodologias de direcionamento de genes podem ser usadas para gerar camundongos transgênicos com alelos knockout, knock-in e marcados.  Aqui, descrevemos um método aprimorado de recombinação em E. coli, que chamamos de 'subclonagem mais inserção', que pode ser usado para gerar vetores de direcionamento de genes personalizados rapidamente.

Subclonagem Além disso Inserção (SPI) - Um Método recombineering Novel para a construção rápida de Gene Segmentação Vetores

Este protocolo demonstra como gerar tumores clonais fluorescente marcada, geneticamente definidas no Drosophila olho / discos imaginais antenares (DAE). Ele descreve como dissecar o EAD e do cérebro a partir do terceiro larvas e como processá-los para visualizar e quantificar as mudanças de expressão gênica e invasão tumoral.

o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Proteínas, muitas vezes contêm vários domínios que podem exercer diferentes funções celulares. Gene knock-out (KO) não consideram essa diversidade funcional. Aqui, relatamos uma abordagem de estrutura-função com base na troca de cassete mediada por recombinação (RMCE) em KO células estaminais embrionárias que permite a dissecação molecular de vários domínios funcionais ou variantes de uma proteína.

Estudos de estrutura-função em células estaminais embrionárias Rato Usando recombinase mediada por troca cassete

Aqui, apresentamos um método para gerar sistemas de transcrição binário de tecido-específica em Drosophila , substituindo o primeiro exon codificação de genes com drivers de transcrição. O método baseado em CRISPR/Cas9 coloca uma sequência liberada sob o Regulamento endógena de um gene substituído e, consequentemente, facilita a expressão de transctivator exclusivamente em padrões spatiotemporal gene-específico.

Uma estratégia eficiente para gerar sistemas de transcrição binário de tecido-específica em Drosophila editando genoma

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para identificar os eventos de recombinação homóloga que ocorreram em células-tronco embrionárias do mouse usando a mancha do Sul e/ou PCR. Este método é exemplificado pela geração de nonmuscle myosin II substituição genética rato modelos usando embrionária baseada em células-tronco homóloga mediada por recombinação segmentação tecnologia tradicional.

Identificação de eventos de recombinação homóloga em células-tronco embrionárias de camundongo usando Southern Blotting e reação em cadeia da polimerase

O objetivo deste protocolo é delinear o desenho e o desempenho de experimentos in vivo em Drosophila melanogaster para avaliar as conseqüências funcionais de variantes genéticas raras associadas a doenças humanas.

Estudo funcional in vivo de variantes humanas raras associadas à doença usando Drosophila

Este artigo toma como exemplo a transgênese mediada por integrase phiC31 em Drosophila e apresenta um protocolo otimizado para microinjeção de embriões, uma etapa crucial para a criação de moscas transgênicas.

Microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

Wolbachia em Drosophila infecção bacteriana

Aprenda a gerar vetores de recombinação homóloga em Drosophila usando técnicas de recombineering. Este método permite criar mutações nulas e marcar proteínas endógenas com precisão genética.

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