A Novel Ex vivo Método de Cultura para o Rato coração embrionário

O objetivo geral deste procedimento é excisar o coração embrionário para cultura ex vivo. Isso é feito recuperando primeiro o corno uterino de uma rata grávida. Em seguida, um embrião é recuperado e preparado para dissecação.

Em seguida, a parede torácica embrionária é aberta para visualizar o coração. Finalmente, o coração é excisado e colocado em um poço de cultura contendo matrigel diluído. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram um coração vivo saudável por meio da visualização sob um microscópio de campo brilhante.

A principal vantagem dessa técnica sobre outros métodos, como culturas de balanço, é que o coração pode ser tratado com agentes locais, como uma proteína conjugada ao grânulo, ou com agentes globais, como a adição de uma pequena molécula ao matrigel. As implicações desta técnica, estende-se à terapia para doenças cardiovasculares, pois permite que os eventos dentro de segmentos especializados do coração sejam examinados no contexto de todo o órgão intacto. Depois de sacrificar uma rata grávida cronometrada no dia embrionário desejado, usando uma técnica aprovada pelo seu instituto, borrife generosamente a fêmea com etanol a 70% antes de abrir a cavidade abdominal e recuperar e extirpar o corno uterino.

Coloque o corno uterino em uma placa de Petri contendo um XPBS frio e enxágue-o. Coloque o prato no gelo até que esteja pronto para dissecar. Em seguida, abra o corno uterino através da linha média para expor os sacos embrionários anexados.

Abra um saco embrionário e coloque um embrião em uma segunda placa de Petri com PBS frio. Coloque o prato com o chifre uterino no gelo. Depois de decapitar o embrião, coloque-o de costas e corte-o.

Abra a parede torácica para visualizar o coração e os pulmões. Dependendo do estágio, a parede torácica pode ser transparente. Se a genotipagem for feita, salve a cauda do embrião.

Usando uma pinça, levante cuidadosamente o coração e corte os vasos abaixo. Em seguida, corte acima dos grandes vasos para libertar o coração. Se necessário, remova os tecidos estranhos.

Coloque o coração em um poço de um prato de 24 poços cheio de PBS frio e sentado no gelo. Repita a dissecção para isolar todos os corações embrionários. Em uma capela de fluxo laminar, combine o gel de matriz fria e o meio de cultura desejado na proporção de um para um, mantendo o gel de matriz diluído no gelo.

Pipete 500 a 1000 microlitros da solução nos poços de uma cultura de 24 poços. Coloque isso no gelo. Escolha e coloque cuidadosamente os corações excisados nos poços individuais do prato de cultura contendo matrigel.

Se a orientação de um coração embutido for crucial, use etanol 70% para pulverizar generosamente um microscópio invertido e o espaço circundante. Então, depois de trabalhar no capuz para colocar o coração no poço do tapete de gel no gelo. Coloque a placa em um microscópio stage e oriente rapidamente o coração enquanto o gel do tapete começa a solidificar.

Coloque a placa de cultura em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e deixe o gel matri solidificar por aproximadamente 30 minutos. Adicione um mililitro de cultura pré-aquecida, média a cada poço contendo um coração. Os corações podem permanecer na cultura por pelo menos quatro dias.

Se desejar, adicione uma matriz de célula viva fluorescente, como o cyto 16. Para visualizar o coração vivo, a fotografia será limitada ao lado do coração que é visível com base na posição em que foi incorporado. Se for realizada uma imagem de montagem completa ou seccionamento, remova o meio de cultura.

Substitua-o por formaldeído frio a 4% e coloque o prato no gelo por 30 minutos. Depois que o matrigel se dissolver, substitua o fixador e o matrigel por formaldeído fresco e fixe os corações durante a noite a quatro graus Celsius. Lave os corações com PBS ou Triss e guarde a quatro graus Celsius até novas análises.

Quando cultivada ex vivo por 24 horas, a vasculatura coronária parece semelhante a um coração excisado de um embrião com idade comparável que foi mantido no útero, como mostrado aqui. A análise de hemat, toin e eoin de corações excisados em E 16,5 e cultivados ex vivo por quatro dias demonstra que a morfologia geral, incluindo as paredes das grandes artérias e o miocárdio septal ventricular e interventricular do coração, permanece intacta apesar da falta de circulação. Os osteo coronários são aparentes, conforme indicado pela ponta da seta.

No entanto, a fragmentação do DNA indicada com setas e observada com h e d e DAPI é aparente no miocárdio compacto e ao redor dos grandes vasos. Além disso, o miocárdio é menos denso em comparação com um coração de um embrião E 18.5 que se desenvolveu no útero, embora o coração cultivado ex vivo ainda estivesse batendo. Assim, existem limitações quanto ao período de tempo ou ao estágio em que esses corações podem ser mantidos.

Esta técnica de cultura também pode ser usada para marcar corações fluorescentemente durante a cultura após a incubação com um corante fluorescente específico endotelial, os corações são cultivados por 48 horas. Nesse caso, a visualização é limitada com base na orientação do coração e na opacidade do tecido. Cortes histológicos subsequentes através do miocárdio ventricular confirmam que o cito-16 pode penetrar nas camadas celulares externas para rotular vasos subepicárdicos dentro dos ventrículos e co-localiza com a seletina, conforme demonstrado aqui Após cultura ex vivo por 30 horas, um coração excisado de um embrião E 14.5 mostra contratilidade e estimulação consistentes entre os átrios e os ventrículos.

Ao realizar esta técnica, é importante ser gentil e cuidadoso ao extirpar o coração. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extirpar e cultivar um coração de camundongo embrionário.