A Novel de alta resolução In vivo Técnica de Imagem para estudar a resposta dinâmica de estruturas intracranianas ao crescimento do tumor e Terapêutica

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de células únicas de alta resolução de células progenitoras derivadas da medula óssea seguindo seus padrões de recrutamento para o cérebro normal e vasculatura associada a tumores cerebrais com o tempo. Isso é feito removendo a tíbia e o fêmur de camundongos doadores para obter células progenitoras fluorescentes da medula óssea e, em seguida, injetando essas células em camundongos receptores irradiados. O segundo passo é gerar xenoenxertos GB M intracranianos nos camundongos quiméricos dentro de uma câmara de janela craniana.

Em seguida, os camundongos passam por uma variedade de regimes de tratamento, incluindo radiação guiada estereotáxica. A etapa final é obter imagens dos camundongos em um microscópio confocal de dois fótons. Em última análise, essa metodologia pode ser usada para estudar dinamicamente os mecanismos de vascularização intracraniana em uma variedade de modelos.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a histopatologia do tecido ex vivo, é que podemos estudar informações dinâmicas críticas relacionadas à formação de vasos no cérebro. Como tal, podemos responder a questões-chave em torno dos mecanismos da neovascularização intercraniana. Embora esse método possa ser usado para fornecer informações sobre a neovascularização intracraniana, ele também pode ser aplicado a outros sistemas e processos de doenças no cérebro, como isquemia intracraniana ou acidente vascular cerebral, doença neurodegenerativa e mecanismos de metástases de células tumorais no cérebro.

Para o propósito deste vídeo, não foi possível seguir uma técnica asséptica rigorosa. Como tal, a capa de biossegurança tem uma abertura superior a 12 polegadas e os animais não são drapeados, permitindo ao espectador uma imagem mais nítida e melhor acesso para orientar os procedimentos para o trabalho experimental. A técnica asséptica deve ser rigorosamente seguida.

Comece este procedimento confirmando a expressão de fluorescência do camundongo doador GFP e eutanasiando-o de acordo com as diretrizes do comitê institucional de cuidados com animais. Em seguida, limpe os dois membros posteriores e remova a tíbia e o fêmur enquanto trabalha em condições assépticas. Retire todo o excesso de tecido dos ossos.

Em seguida, remova as placas terminais de ambas as extremidades dos quatro ossos extraídos. Lave-os com uma agulha de calibre 22 e um mililitro de PBS estéril. Eles ficarão claros assim que toda a medula óssea for eliminada.

Em seguida, misture a suspensão de medula óssea extraída. Bem, ele deve conter aproximadamente 20 milhões de células, o que é suficiente para três reconstituições de camundongos hospedeiros. Em seguida, prepare 3 agulhas de tuberculina de calibre 27 e coloque 300 microlitros da suspensão da medula óssea em cada uma delas.

Enquanto o mouse está posicionado no limitador. Marque a superfície dorsal da cauda para se orientar. Em seguida, injetar a suspensão na veia lateral da cauda de três previamente irradiados.

Camundongos deslizantes neste procedimento trabalhando em condições assépticas. Anestesie os camundongos quiméricos da medula óssea e administre analgesia preventiva aprovada pelo iacuc. Aplique gel lacrimal para evitar a desidratação da córnea.

Limpe a cabeça primeiro com a solução de Betadine, depois com álcool e remova o excesso de pelos. Em seguida, limpe ainda mais o couro cabeludo subjacente com álcool. Faça uma incisão do ponto médio das orelhas até logo acima dos olhos.

Remova o couro cabeludo em ambos os lados da primeira incisão para expor cerca de cinco milímetros do crânio subjacente. Em seguida, identifique os pontos de referência anatômicos da superfície do crânio. Em seguida, identifique e levante o periósteo injetando solução de epinefrina 2% de lidocaína.

Posteriormente, disseque o periósteo para longe da superfície do crânio com um instrumento pontiagudo. Em seguida, use uma broca de refinamento TR de 2,7 milímetros para enfraquecer um retalho ósseo circular de 2,7 milímetros no hemisfério direito do crânio equidistante de Lambda e bgma. Não penetre no osso com a broca para proteger a dura-máter e o tecido subjacentes.

Agora, remova o retalho ósseo enfraquecido usando a dissecção, a pinça e o gancho dentário com força deliberada, mas controlada. Em seguida, carregue uma seringa Hamilton de calibre 30 com 10 microlitros de suspensão celular e coloque a agulha na estrutura estereotáxica. Em seguida, coloque o mouse no quadro estereotáxico.

Alinhe a agulha com o ponto central da janela gerada depois disso, abaixe a agulha até tocar a superfície cortical. Em seguida, redefina as coordenadas digitais. Agora abaixe a agulha 3,2 milímetros no tecido cortical.

Em seguida, retraia 0,2 milímetros e injete a três milímetros. A injeção de profundidade deve ser realizada a uma taxa de 10 microlitros por minuto. Quando a injeção estiver concluída, deixe a agulha no lugar por um minuto antes de retraí-la lentamente.

Em seguida, remova o mouse do quadro. Posteriormente, mantenha a superfície do cérebro hidratada. Usando gotas de PBS estéril.

Coloque uma lamínula de três milímetros na superfície do cérebro para selar a janela de 2,7 milímetros. Em seguida, seque o osso do crânio circundante. Em seguida, aplique o veterinário para colar o tecido do couro cabeludo no osso do crânio e mantenha a lamínula no lugar.

Não aplique muito, pois vazará sob o vidro e diminuirá o potencial de imagem. Em seguida, misture o pó acrílico dental fresco e a solução no capuz e aplique a mistura sobre o veterinário usando uma agulha de calibre 22. Para garantir uma vedação firme, aplique o acrílico para sobrepor levemente com a borda da lamínula de vidro, mas não para cobrir a lamínula de vidro.

Nesta etapa, coloque um mouse anestesiado em um limitador de cabeça personalizado dentro do irradiador estereotáxico XAD 2 25 projetado pela casa. Obtenha uma tomografia computadorizada de feixe cônico de 360 graus com o tubo de raios-x funcionando a 40 quilo de tensão de pico e 0,05 miliamperes através de um filtro de alumínio de dois milímetros. Use a imagem para posicionar o palco de forma que o centro ISO de radiação seja direcionado para o hemisfério direito e seja central na direção ventral dorsal.

Há uma grande variedade de colimadores disponíveis para direcionar a radiação, o que demonstra a adaptabilidade do modelo. Nesse caso, usamos oito milímetros por 11 milímetros para irradiação hemisférica. Insira o colimador hemisférico no irradiador estereotáxico X RAD 2 25.

Obtenha as imagens ortogonais de TC únicas da parte superior e inferior através do colimador para garantir o posicionamento correto da cabeça, localizando as estruturas ósseas anatômicas e ajustando manualmente a posição do estágio no monitor. Troque o filtro de alumínio XAD 2 25 IRRADIATOR por um filtro de tratamento de cobre de 0,93 milímetros. Em seguida, execute o programa do tubo de raios-x a 225 picos de tensão e 13 miliamperes e administre metade da dose de radiação do topo em uma direção AP.

Retorne o pórtico para a posição inferior e administre a segunda metade da dose de radiação de baixo para baixo na direção PA. Neste procedimento, anestesiar o mouse janela intracraniana gerado anteriormente e limpar a janela usando spray de álcool. Configure os canais no microscópio confocal conforme determinado pelos fluorocromos integrados ao camundongo quimérico gerado.

Como alternativa, reutilize as configurações anteriores para reduzir a variabilidade entre as sessões de imagem. Injete todas as marcas necessárias para a imagem da veia lateral da cauda, neste caso, dextrana para vasculatura. Inverta o mouse no limitador de cabeça personalizado, apoiando com plasticina moldável, garantindo que o cabeçote esteja perpendicular ao laser e carregue o limitador no microscópio móvel

Ligue o laser do primeiro canal e posicione-o no centro da janela intracraniana olhando diretamente para o ponto de interseção do feixe de laser na janela da câmara. Tire uma imagem de cada canal para toda a janela com uma lente de cinco x e use-a como um mapa para outras imagens de resolução mais alta com lentes de longo alcance de 10 x e 20 x. Este esquema destaca os erros técnicos associados ao processo cirúrgico e demonstra o efeito que cada um terá nas imagens produzidas.

O ar preso sob a janela será visível como bolhas nas imagens. O acúmulo de acrílico no vidro é autofluorescente no canal vermelho distante e bloqueará parte do campo de visão. Da mesma forma, a sujeira na janela durante a imagem aparece como flexão autofluorescente nas imagens.

Mesmo a janela intracraniana perfeita pode encontrar problemas quando está sob o microscópio. Artefatos respiratórios resultam em imagens alinhadas, enquanto o mau posicionamento do mouse no quadro resulta em uma imagem segmentada. Como o laser atravessa apenas parte do tecido com pós-processamento de imagem, é possível adicionar um canal adicional para células marcadas com CFP, por meio do qual as imagens GFP podem ser subtraídas das imagens CFP para revelar o verdadeiro sinal CFP.

Além disso, utilizando a autofluorescência de segunda geração harmônica característica das quatro fibras de colágeno, somos capazes de obter imagens da membrana basal da vasculatura. A disponibilidade de cinco canais fluorescentes permite ao usuário uma grande flexibilidade e adaptabilidade do novo modelo de espelhamento descrito neste artigo. Ao tentar este procedimento, é importante ter em mente os produtos perigosos usados durante os procedimentos cirúrgicos.

Também é essencial ser meticuloso e prestar atenção específica aos detalhes para garantir que o tecido cerebral permaneça intacto durante a imagem de longo prazo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar um camundongo quimérico com células progenitoras fluorescentes e, por sua vez, ser capaz de capturar imagens em tempo real de alta resolução da vasculatura intracraniana após o implante de células tumorais com ou sem intervenção terapêutica.