A Novel de alta resolução

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de alta resolução de células individuais de células progenitoras derivadas da medula óssea, seguindo seus padrões de recrutamento para a vasculatura cerebral normal e associada a tumores cerebrais ao longo do tempo. Isso é realizado removendo a tíbia e o fêmur de camundongos doadores para obter células progenitoras fluorescentes da medula óssea, e então injetando essas células em camundongos receptores irradiados. O segundo passo consiste em gerar xenografts intracranianos de GBM em camundongos quiméricos dentro de uma câmara com janela craniana.

Em seguida, os camundongos são submetidos a uma variedade de regimes de tratamento, incluindo radiação guiada por estereotaxia. O passo final é obter imagens dos camundongos em um microscópio confocal de dois fótons. Em última análise, esta metodologia pode ser utilizada para estudar dinamicamente os mecanismos de vascularização intracraniana em uma variedade de modelos.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a histopatologia de tecido ex vivo, é que podemos estudar informações dinâmicas essenciais relacionadas à formação de vasos no cérebro. Assim, podemos responder perguntas fundamentais sobre os mecanismos de neovascularização intracraniana. Embora este método possa ser usado para obter insights sobre a neovascularização intracraniana, ele também pode ser aplicado a outros sistemas e processos patológicos no cérebro, como isquemia intracraniana, acidente vascular cerebral, doenças neurodegenerativas e mecanismos de metástase de células tumorais para o cérebro.

Para fins deste vídeo, não foi possível seguir uma técnica asséptica rigorosa. Por esse motivo, a cabine de segurança biológica possui uma abertura maior que 12 polegadas e os animais não são cobertos com campos cirúrgicos, o que permite uma imagem mais clara ao espectador e um melhor acesso para orientar os procedimentos em trabalhos experimentais. A técnica asséptica deve ser rigorosamente seguida.

Inicie este procedimento confirmando a expressão de fluorescência do camundongo doador GFP e eutanazie-o de acordo com as diretrizes do comitê institucional de cuidados com animais. Em seguida, limpe ambas as patas traseiras e remova a tíbia e o fêmur enquanto trabalha em condições assépticas. Remova todos os tecidos em excesso dos ossos.

Em seguida, remova as placas finais de ambas as extremidades dos quatro ossos extraídos. Lave-os com uma agulha de 22 gauge e um mililitro de PBS estéril. Eles ficarão transparentes assim que toda a medula óssea tiver sido lavada.

Em seguida, misture bem a suspensão de medula óssea extraída. Ela deve conter aproximadamente 20 milhões de células, quantidade suficiente para a reconstituição de três camundongos hospedeiros. A seguir, prepare 3 agulhas tuberculínicas de calibre 27 e aspire 300 microlitros da suspensão de medula óssea para cada uma delas.

Enquanto o camundongo estiver posicionado no restritor, marque a superfície dorsal da cauda para se orientar. Em seguida, injete a suspensão na veia lateral da cauda de três camundongos previamente irradiados.

Utilize camundongos Nod skid neste procedimento, trabalhando sob condições assépticas. Anestesie os camundongos Nod skid com medula óssea quimérica e administre analgesia profilática aprovada pelo IACUC. Aplique gel lacrimal para prevenir a desidratação da córnea.

Limpe a cabeça primeiro com solução de Betadine, depois com álcool e remova os pelos em excesso. Em seguida, limpe o couro cabeludo subjacente novamente com álcool. Faça uma incisão do ponto médio das orelhas até logo acima dos olhos.

Remova o couro cabeludo em ambos os lados da primeira incisão para expor cerca de cinco milímetros do crânio subjacente. Em seguida, identifique os marcos anatômicos da superfície do crânio. A seguir, identifique e levante o periósteo injetando solução de lidocaína 2% com epinefrina.

Posteriormente, dissecar o periósteo da superfície do crânio com um instrumento afiado. Em seguida, usar uma broca TR refine de 2,7 milímetros para enfraquecer um retalho ósseo circular de 2,7 milímetros no hemisfério direito do crânio, equidistante de Lambda e bgma. Não penetrar o osso com a broca, a fim de proteger a dura-máter e os tecidos subjacentes.

Agora, remova o retalho ósseo enfraquecido utilizando a dissecação, pinça e gancho dental com força deliberada, mas controlada. Em seguida, carregue uma seringa Hamilton de calibre 30 com 10 microlitros de suspensão celular e posicione a agulha no suporte estereotáxico. Então, posicione o camundongo no suporte estereotáxico.

Alinhe a agulha com o ponto central da janela gerada após isso, abaixe a agulha até que toque a superfície cortical. Em seguida, redefina as coordenadas digitais. Agora, abaixe a agulha 3,2 milímetros no tecido cortical.

Em seguida, recolha 0,2 milímetros e injete a três milímetros. A injeção em profundidade deve ser realizada a uma taxa de 10 microlitros por minuto. Ao concluir a injeção, mantenha a agulha no local por um minuto antes de recolhê-la lentamente.

Em seguida, remova o camundongo da estrutura. Posteriormente, mantenha a superfície do cérebro hidratada utilizando gotas de PBS estéril.

Coloque um lamínula de três milímetros sobre a superfície do cérebro para selar a janela de 2,7 milímetros. Em seguida, seque o osso do crânio ao redor. Aplique, então, vet bond para colar o tecido do couro cabeludo ao osso do crânio e manter o lamínula no lugar.

Não aplique em excesso, pois o material vazará sob o vidro e reduzirá o potencial de imagem. Em seguida, misture o pó e a solução de acrílico odontológico frescos na capela e aplique a mistura sobre o vet bond usando uma agulha de 22 g. Para garantir um selamento adequado, aplique o acrílico de modo que sobreponha ligeiramente a borda do lamínula de vidro, mas sem cobrir o lamínula de vidro.

Nesta etapa, posicione um camundongo anestesiado em um suporte personalizado para a cabeça dentro do irradiador estereotáxico XAD 2 25 projetado na casa. Obtenha uma tomografia computadorizada por feixe cônico de 360 graus com o tubo de raios X operando em 40 quilovolts de pico e 0,05 miliampères através de um filtro de alumínio de dois milímetros. Utilize a imagem para posicionar a plataforma de modo que o centro ISO da radiação seja direcionado ao hemisfério direito e fique centralizado na direção dorsal-ventral.

Existe uma grande variedade de colimadores disponíveis para direcionar a radiação, o que demonstra a adaptabilidade do modelo. Neste caso, utilizamos um colimador de oito milímetros por 11 milímetros para irradiação hemisférica. Insira o colimador hemisférico no irradiador estereotáxico X RAD 2 25.

Obtenha as imagens ortogonais únicas de TC tanto de cima quanto de baixo por meio do colimador para garantir o posicionamento correto da cabeça, localizando as estruturas ósseas anatômicas e ajustando manualmente a posição do estágio no monitor. Substitua o filtro de alumínio do IRRADIADOR XAD 2 25 por um filtro de tratamento de cobre de 0,93 milímetro. Em seguida, execute o programa do tubo de raios X em 225 quilovolts de pico e 13 miliampères e administre metade da dose de radiação de cima, na direção ântero-posterior (AP).

Retorne o gantry à posição inferior e administre a segunda metade da dose de radiação a partir da parte inferior, em direção PA. Neste procedimento, anestesie o camundongo com janela intracraniana previamente gerada e limpe a janela utilizando spray de álcool. Configure os canais no microscópio confocal conforme determinado pelos fluorocromos integrados ao camundongo quimérico gerado.

Alternativamente, reutilize configurações anteriores para reduzir a variabilidade entre sessões de imagem. Injete quaisquer marcadores necessários para a aquisição de imagens na veia lateral da cauda, neste caso, dextrana para a vasculatura. Inverta o camundongo sobre o suporte personalizado para a cabeça, apoiando-o com massinha moldável, garantindo que a cabeça esteja perpendicular ao laser e plana; posicione o suporte na platina móvel do microscópio.

Ative o laser do primeiro canal e posicione-o no centro da janela intracraniana observando diretamente o ponto de interseção do feixe laser na janela da câmara. Capture uma imagem de cada canal para toda a janela com uma lente de 5 x e utilize-a como mapa para outras imagens de maior resolução obtidas com lentes de longo alcance de 0 x e 20 x. Este esquema destaca os erros técnicos associados ao processo cirúrgico e demonstra o efeito que cada um terá nas imagens produzidas.

O ar aprisionado sob a janela será visível como bolhas nas imagens. O acúmulo de acrílico no vidro é autofluorescente no canal vermelho distante e bloqueará parte do campo de visão. Da mesma forma, a sujeira na janela durante a aquisição de imagens aparece como fluorescência espúria nas imagens.

Até a janela intracraniana perfeita pode apresentar problemas quando está sob o microscópio. Artifatos provocados pela respiração resultam em imagens com linhas, enquanto o posicionamento inadequado do camundongo na platina leva a uma imagem segmentada. Como o laser atravessa apenas uma parte do tecido, sendo posteriormente processada por software, é possível adicionar um canal adicional para células marcadas com CFP, no qual as imagens GFP podem ser subtraídas das imagens CFP para revelar o sinal CFP verdadeiro.

Além disso, utilizando a característica de autofluorescência da geração de segundo harmônico das fibras de colágeno tipo IV, somos capazes de imaginar a membrana basal da vasculatura. A disponibilidade de cinco canais fluorescentes permite ao usuário uma grande flexibilidade e adaptabilidade do novo modelo de espelhamento descrito neste artigo. Ao realizar este procedimento, é importante ter em mente os produtos perigosos utilizados durante os procedimentos cirúrgicos.

Também é essencial ser meticuloso e prestar atenção específica aos detalhes para garantir que o tecido cerebral permaneça intacto durante todo o processo de imagem de longo prazo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar um camundongo quimérico com células progenitoras fluorescentes e, por sua vez, ser capaz de capturar imagens em tempo real de alta resolução da vasculatura intracraniana após o implante de células tumorais, com ou sem intervenção terapêutica.