Name: Cultura primária Rat coletor medular interno células dos ductos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Aprenda a cultivar células primárias de ducto coletor da medula interna de rato para estudar a reabsorção de água mediada pela arginina-vasopressina. Este protocolo permite investigar mecanismos moleculares da fisiologia renal.

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Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, KL e KL 1415/3-2 1415/4-2).

1. Preparação <ol><li> Preparar os pratos de cultura <ol><li> Descongelar colagénio Tipo IV O / N a 4 ° C e dissolvem-se em 0,1% de ácido acético estéril. O volume a ser usado depende do tipo e número de pratos em que as células estão a ser semeadas. Use 2 mg / cm 2. </li><li> Incubar pratos, pelo menos durante 1 hora à temperatura ambiente e lava-se duas vezes com água destilada (A. tridest). </li><li> Permitir que os pratos para secar adequadamente. </li></ol></li><li> A suplementação do meio de <ol><li> Aumento do nível de glicose de até 4,5 g / l através da adição de 1,75 g de glicose a 500 ml de meio. Para ajustar o meio a 600 mosmol, adicionar NaCl 100 mM e 100 mM de ureia, para aumentar a osmolaridade de 200 mosmol e 100 mOsmol, respectivamente. </li><li> Adicionar 1% de ácidos aminados não essenciais, 1% ultroser, dbcAMP 500 uM, 20 U / ml nistatina e 0,25 ug / ml de gentamicina (diluição 1:200 de uma solução de estoque com uma concentração de 50 ug / ml) a 600 mosmol meio DMEM frescos no dia da preparação. </li></ol></li&gt; <li> Solução de enzima <ol><li> Adicionar 1 mg / ml de hialuronidase e 2,2 mg / ml de colagenase de DPBS contendo 0,25 ug / ml de gentamicina e nistatina. Prepare 1 ml desta solução de enzimas para a digestão de 2 rim medulas interior. A solução deve ser esterilizada por filtração e armazenada em tubos Falcon de 50 ml. </li></ol></li></ol> 2. Cultivo de Rat primária ducto coletor medular interno (IMCD) Células Todos os procedimentos de manuseio de animais devem ser realizadas em conformidade com a legislação local e federal. <ol><li> Anestesiar ratos em CO 2 (numa caixa saturado com CO 2) e isoflurano (U-400 Anestesia unidade, Univentor Ltd., de Malta, fluxo de ar de 350-400 ml / min, com 2-2,5% de isoflurano). Decapitar os animais para o sangramento, que permite a detecção exata da fronteira entre a esbranquiçada interior ea medula externa mais escura. Além disso, a hemorragia minimiza o número de eritrócitos isolados. Remover e rinslavá-los em DPBS estéril suplementado com gentamicina e nistatina (ver acima) em gelo. Todas as outras etapas devem ser realizadas em condições bancada limpa estéreis. </li><li> Transferir os rins a partir da solução de DPBS para uma compressa esterilizada para remover o líquido em excesso. Retire a cápsula renal graxos com uma pinça e tesouras estéreis. </li><li> Tendo o rim ainda fixado na compressa, cortar ligeiramente ao lado do eixo longitudinal do lado exterior (cortical). Certifique-se de não cortar completamente, mas para deixá-lo em uma peça, conectado na pelve renal. </li><li> Com tesoura curva dissecar cuidadosamente o medulas interior esbranquiçada, que está cercado pela rosé cintilante medula externa. Recolhe-los em DPBS contendo gentamicina e nistatina em uma placa de cultura de 60 milímetros em gelo. </li><li> Uma vez que todos medulas são isoladas e recolhidas em gelo, reduzir o volume de DPBS para um nível em que são cobertos apenas com tampão. Use uma lâmina de barbear estéril para cortar o medulas em cubos de 53 mm. </li><li> Derreta e volta a ponta de uma pipeta Pasteur estéril, segurando-o brevemente em uma chama. Certifique-se que a pipeta é resfriado antes de continuar. </li><li> Transferir a suspensão de tecido para os tubos Falcon de 50 ml contendo solução de enzima esterilizada preparados com hialuronidase e colagenase (ver 1.3.1), usando o arredondado pipeta Pasteur. Fechar hermeticamente a tampa e incubar a 37 ° C, sob agitação contínua (220 rpm) num banho de água de mesa regular para 1,5-2 horas. </li><li> Por trituração da suspensão, pipetar a mistura para cima e para baixo várias vezes, com a pipeta de Pasteur rodada (veja acima) até a suspensão se tornar homogénea turva. </li><li> Centrifugar a suspensão durante 5 min a 300 xg e 16 ° C. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o pellet cuidadosamente em DPBS contendo gentamicina e nistatina e centrifugar novamente. Repetir esta etapa de lavagem uma vez. </li><li> Ressuspender as células em meio totalmente completada e semente-los em cultura pratos e / ou chapas de microtitulação assim. A preparação de 2 medulas (1 animal) irá produzir células suficientes para um prato de cultura de 60 mm. </li><li> Após 24 horas, lave as células duas vezes com 600 mosmol DMEM e adicione meio fresco. Durante a semana seguinte as células deverão ser lavadas 2-3 vezes (Figura 1). 6-8 dias após a sementeira, as células IMCD pode ser utilizado para experiências. Recorde incubar em meio sem dbcAMP e nistatina durante 24 horas antes de começar a experiência. Caso contrário AQP2 será exclusivamente localizado na membrana de plasma. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nós apresentamos um protocolo detalhado para a preparação e cultivo de células IMCD primárias de rato. A abordagem rende até 21 cm 2 de células de um rato 20. O ensaio requer um equipamento padrão de cultura de células e pode ser realizada por uma única pessoa dentro de aproximadamente 6 horas. Por conseguinte, esta abordagem é adequada como um método padrão de laboratório. IMCD células primárias de rato podem ser semeadas em placas de cultura de diferentes tamanhos, qu...

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Na recolha de células renais de condutas principais, a arginina-vasopressina (AVP) controla a reabsorção de água, estimulando a inserção do canal de água aquaporina-2 (AQP2) na membrana plasmática. AVP se liga à proteína acoplada vasopressina tipo-2, receptor de G (V2R) estimular a adenilil ciclase e assim a formação de AMPc. Iniciação desta cascata de sinalização conduz à activação da proteína quinase A (PKA). PKA fosforila AQP2 na serina 256 (S256), que é o factor chave para a sua redistribuição intracelular de vesículas na membrana plasmática. A inserção da membrana facilita a reabsorção de água ao longo de um gradiente osmótico e afina corpo homeostase da água. Desregulação da reabsorção de água AVP-mediada, devido a aberrações da secreção de AVP ou causas sinalização AVP ativados ou está associada a doenças graves. Diminuição da reabsorção de água causada por mutações de V2R ou AQP2 leva a diabetes insípido nefrogênico, enquanto um elevnível AVP plasma sanguíneo decido está associada a reabsorção excessiva de água em doenças cardiovasculares, como insuficiência cardíaca crônica ea síndrome da secreção do hormônio antidiurético inapropriado (SIADH). O significado da reabsorção de água mediada por AVP resulta não só a partir da sua implicação na doença. A translocação AVP induzida por vesículas AQP2-rolamento e fusão com a membrana plasmática representa um processo exocitica estritamente cAMP-dependente, o que atualmente não é bem compreendida. Outros exemplos de um exocitose dependente de AMPc são a secreção de renina a nível renal, secreção de H + no estômago. Portanto, a elucidação dos mecanismos moleculares que regulam a AQP2-translocação em células renais principais não só ajuda a compreender os processos moleculares semelhantes em outros tipos de células, mas também pode abrir o caminho para novas terapias para o tratamento de doenças associadas a distúrbios da reabsorção de água mediada por AVP . Elucidating AQP2 mecanismos de controle requer a coleta principais modelos de células do duto. Por isso, uma série de diferentes linhas de células de rim de mamífero estão disponíveis. No entanto, estes modelos têm vários inconvenientes. Em muitos sistemas de célula o nível de proteína AQP2 é baixa (Tabela 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, outros ectopicamente superexpressam humanos (MCD4, WT10) ou 11,12 rato (CD8) 13 AQP2. Em MCD4 e células COS-7 do receptor V2 não é expresso. Para o nosso conhecimento, não há linha de células permanente como um modelo disponível, que é derivada da recolha da medula renal conduta interior, a parte do rim onde AQP2 expressão é mais abundante, mas a partir da conduta de recolha cortical 1,11,13-16 . Tais modelos de células são por exemplo os mpkCCD imortalizada utilizada (por exemplo, 17) ou os mTERT CCD 14 linhas de células recentemente estabelecidas. Ambas as linhas de células endogenamente AQP2 expressa e V2R, mas uma vez que eles são derivados daduto coletor cortical provavelmente conter um proteoma diferente em relação ao coletor medular interno células do duto (IMCD). Eles devem, por exemplo, expressar diferente Na + sistemas de transporte. Aqui, apresentamos um protocolo de cultura de células primárias IMCD expressando V2R e AQP2 endogenamente. Este modelo, portanto, representa mais de perto a situação fisiológica no ducto coletor renal. Como estabelecer a cultura exige apenas padrão de laboratório, equipamento de outros laboratórios podem facilmente adotar essa abordagem.

<table><tbody><tr>Tipo <td>biosciences</td> <td>do BD do rato do tipo IV do colagênio</td><td>356233</td><td></td></tr> o <tr><td>tipo CLS-II da colagenase</td><td></td> SIGMA H6254 <td></td> Biochrom AG C2-22 <td></td></tr><tr><td>DMEM + GlutMAX</td><td>Invitrogen GIBCO</td><td>21885108</td><td></td></tr><tr><td>a nistatina</td><td>SIGMA</td><td>N4014</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Ultroser G Cytogen 15950-017 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais (NEA)</td> <td>Biochrom AG</td><td>K0293</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Invitrogen GIBCO</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>DBcAMP</td><td>BIOLOG</td><td>D009</td><td></td></tr></tbody></table>

cultura primária rat coletor medular interno células dos ductos

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Arginina-vasopressina (AVP), facilita a reabsorção de água por renal coletando células principais do duto e, assim, afina corpo homeostase da água. AVP se liga aos receptores de vasopressina V2 (V2R) na superfície das células e, assim, induz a síntese de cAMP. Este estimula a processos de sinalização intracelular que conduzem a alterações na fosforilação do canal de água aquaporina-2 (AQP2). Proteína cinase A phoshorylates AQP2 gerando assim a translocação de AQP2 de vesículas intracelulares para a membrana plasmática facilitar a reabsorção de água a partir da urina primária. Aberrações de libertação da AVP sinalização pituitária ou AVP-activado em células principais podem causar insipidus nefrogénica centrais ou diabetes, respectivamente, um nível elevado de AVP plasma sanguíneo está associada com doenças cardiovasculares, tais como insuficiência cardíaca crónica e síndroma de secreção inapropriada de hormona antidiurética. Aqui, apresentamos um protocolo para cultivatino de rato principal coletor medular interno células do duto (IMCD), que expressa V2R e AQP2 endogenamente. As células são adequados para a elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes ao controlo das AQP2 e, portanto, para descobrir novos alvos terapêuticos para o tratamento de doenças associadas com a desregulação da reabsorção de água mediada por AVP. IMCD células são obtidas a partir de ratos medulas interior renal e são utilizados em experiências de seis a oito dias após a semeadura. IMCD células podem ser cultivadas em placas de cultura de células normais, frascos e placas de micro-titulação de formatos diferentes, o procedimento requer apenas algumas horas, e é apropriado para laboratórios de cultura de células padrão.

O sucesso do cultivo de células primárias de rato IMCD resultará numa monocamada confluente de 6-8 dias após a sementeira (Figura 2). Por 60 milímetros prato de cultura há aproximadamente 6 x 10 6 células. As células firmemente aderir às placas de cultura, uma vez que estes foram revestidos com colagénio do tipo IV, um componente da membrana basal 18. Portanto, as células IMCD não irá separar mesmo durante vários procedimentos de lavagem cuidadosa. Até 80% das células cultivadas ex...

Arginina-vasopressina (AVP) controla o ajuste fino da homeostase de água do corpo, facilitando a reabsorção de água pelas células principais renais. Aqui, apresentamos um protocolo para o cultivo de rato principal coletor medular interno células do duto adequados para a elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes à reabsorção de água AVP-mediada.

Cultura primária Rat coletor medular interno células dos ductos

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar células primárias do ducto coletor intermedular ou células IMCD adequadas para o estudo da reabsorção de água mediada por VP. Isso é realizado primeiramente removendo os rins do rato. O segundo passo é isolar a medula interna da medula externa e do córtex circundantes.Em seguida, os melis internos são digeridos enzimaticamente para liberar células individuais. O passo final é suspender e selecionar as células principais e, então, semear-nas em placas de cultura. Em última análise, seis a oito dias após a semeadura, as células estarão prontas para serem utilizadas em experimentos.O sistema de cultura celular é adequado para a elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes à reabsorção de água mediada por VP e, possivelmente, a outros processos TIC dependentes de CAP. Além disso, o sistema pode ser utilizado para a descoberta de novos candidatos a fármacos e alvos terapêuticos para o tratamento de doenças associadas à desregulação da reabsorção de água mediada por VP. O procedimento será demonstrado por um estudante de doutorado do nosso laboratório e por Beata Eman e Andrea Giller, duas técnicas do nosso laboratório.Após a cena da linha do tempo aqui, revestir as placas de cultura com colágeno. Tipo quatro, no dia anterior ao procedimento do dia seguinte, prepare primeiro as soluções de meio e enzima. Adicione suplementos ao meio DMEM recém-preparado.Para preparar a solução enzimática, adicione hialuronidase a um miligrama por mililitro e 2,2 miligramas por mililitro de colagenase ao DPBS filtrado. Esterilize a solução e armazene-a em um tubo Falcon de 50 mililitros.Prepare um mililitro de solução enzimática para cada dois rins internos de meli digeridos. A etapa mais difícil deste protocolo é a dissecação do meli interno. Para garantir o sucesso, o sangue é drenado dos animais antes da dissecação, tornando a borda brilhante entre o interno e o modelo auto mais fácil de detectar após a eutanásia.Remova os rins e armazene-os no DPBS estéril preparado anteriormente. Trabalhando em condições estéreis. Transfira os rins da solução de DPBS, suplementada com Gentamicina e Nistatina, para uma compressa estéril a fim de remover qualquer líquido em excesso.Em seguida, com o bisturi estéril, remova a cápsula adiposa do rim enquanto ainda fixada na compressa. Faça um corte próximo ao eixo longitudinal do lado externo ou cortical. Certifique-se de não cortar completamente, mantendo-o ainda em uma peça conectada à pelve renal.Em seguida, identifique a medula externa com coloração rósea e brilhante e a medula interna esbranquiçada. Com tesoura curva, dissecar cuidadosamente a medula interna da medula externa circundante. Coloque o tecido na solução de DPBS preparada anteriormente.Após todos os Meli serem isolados e coletados sobre gelo, reduza o volume da solução de DPBS, suplementada com gentamicina e nistatina, até um nível em que fiquem apenas cobertos pelo tampão. Use uma lâmina de barbear estéril para cortar os Meli em cubos de aproximadamente cinco milímetros cúbicos. Em seguida, derreta e arredonde a extremidade afiada de uma pipeta pasteur estéril mantendo-a brevemente na chama.Uma vez resfriado, utilize esta pipeta para transferir a suspensão tecidual para um tubo Falcon de 50 mililitros contendo a solução enzimática estéril fresca, preparada anteriormente. Coloque o tubo em banho-maria e incube a 37 graus Celsius sob agitação contínua por uma hora e meia a duas horas.Após esse período, pipete a mistura para cima e para baixo várias vezes com o pipetador redondo até que a suspensão fique homogeneamente turva. Uma vez completamente homogeneizada, centrifugue a suspensão por cinco minutos. Em seguida, descarte o sobrenadante res.Suspenda o pellet e centrifugue novamente. Repita este passo de lavagem mais uma vez. Re-suspenda as células em meio completamente suplementado e semeie-as em placas de cultura ou placas de microtitulação diretamente após o semeadouro, pois células IMCD isoladas, bem como eritrócitos e debris celulares, podem ser avaliados ao microscópio.Isso fornecerá uma ideia inicial do número de células isoladas após 24 horas. Lave as células com DMEM a 600 miliosmols e adicione meio fresco. Durante a próxima semana, as células devem ser lavadas duas a três vezes.As células IMCD devem estar prontas para experimentos de seis a oito dias após a semeadura, quando cultivadas até a confluência, como pode ser visto aqui. Lembre-se de incubá-las em meio sem DBC MP e INE por 24 horas antes de iniciar o experimento. Caso contrário, a aquaporina dois estará localizada principalmente na membrana plasmática.O cultivo bem-sucedido de células IMCD primárias de rato resultará em uma monocamada confluente de seis a oito dias após a semeadura, quando estimuladas com arginina, vasopressina ou forskolina, a aqp dois transloca-se de vesículas intracelulares para a membrana plasmática, como visto aqui. Além disso, a expressão de AQP dois em células IMCD aumenta após um desafio de 30 minutos com VP ou forolina, conforme mostrado neste western blot. Após este procedimento, isolamento de D-N-A-R-N-A, experimentos de R-T-P-C-R e imunoprecipitação.A análise de sangue ocidental e a microscopia de imunofluorescência podem ser realizadas para analisar genes e produtos gênicos de células do ducto coletor. Este sistema de cultura celular, que expressa proteínas endógenas, é particularmente atrativo para uso em abordagens de triagem imparcial.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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