Name: Cultura primária Rat coletor medular interno células dos ductos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Aprenda a cultivar células primárias de ducto coletor da medula interna de rato para estudar a reabsorção de água mediada pela arginina-vasopressina. Este protocolo permite investigar mecanismos moleculares da fisiologia renal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, KL e KL 1415/3-2 1415/4-2).

1. Preparação <ol><li> Preparar os pratos de cultura <ol><li> Descongelar colagénio Tipo IV O / N a 4 ° C e dissolvem-se em 0,1% de ácido acético estéril. O volume a ser usado depende do tipo e número de pratos em que as células estão a ser semeadas. Use 2 mg / cm 2. </li><li> Incubar pratos, pelo menos durante 1 hora à temperatura ambiente e lava-se duas vezes com água destilada (A. tridest). </li><li> Permitir que os pratos para secar adequadamente. </li></ol></li><li> A suplementação do meio de <ol><li> Aumento do nível de glicose de até 4,5 g / l através da adição de 1,75 g de glicose a 500 ml de meio. Para ajustar o meio a 600 mosmol, adicionar NaCl 100 mM e 100 mM de ureia, para aumentar a osmolaridade de 200 mosmol e 100 mOsmol, respectivamente. </li><li> Adicionar 1% de ácidos aminados não essenciais, 1% ultroser, dbcAMP 500 uM, 20 U / ml nistatina e 0,25 ug / ml de gentamicina (diluição 1:200 de uma solução de estoque com uma concentração de 50 ug / ml) a 600 mosmol meio DMEM frescos no dia da preparação. </li></ol></li&gt; <li> Solução de enzima <ol><li> Adicionar 1 mg / ml de hialuronidase e 2,2 mg / ml de colagenase de DPBS contendo 0,25 ug / ml de gentamicina e nistatina. Prepare 1 ml desta solução de enzimas para a digestão de 2 rim medulas interior. A solução deve ser esterilizada por filtração e armazenada em tubos Falcon de 50 ml. </li></ol></li></ol> 2. Cultivo de Rat primária ducto coletor medular interno (IMCD) Células Todos os procedimentos de manuseio de animais devem ser realizadas em conformidade com a legislação local e federal. <ol><li> Anestesiar ratos em CO 2 (numa caixa saturado com CO 2) e isoflurano (U-400 Anestesia unidade, Univentor Ltd., de Malta, fluxo de ar de 350-400 ml / min, com 2-2,5% de isoflurano). Decapitar os animais para o sangramento, que permite a detecção exata da fronteira entre a esbranquiçada interior ea medula externa mais escura. Além disso, a hemorragia minimiza o número de eritrócitos isolados. Remover e rinslavá-los em DPBS estéril suplementado com gentamicina e nistatina (ver acima) em gelo. Todas as outras etapas devem ser realizadas em condições bancada limpa estéreis. </li><li> Transferir os rins a partir da solução de DPBS para uma compressa esterilizada para remover o líquido em excesso. Retire a cápsula renal graxos com uma pinça e tesouras estéreis. </li><li> Tendo o rim ainda fixado na compressa, cortar ligeiramente ao lado do eixo longitudinal do lado exterior (cortical). Certifique-se de não cortar completamente, mas para deixá-lo em uma peça, conectado na pelve renal. </li><li> Com tesoura curva dissecar cuidadosamente o medulas interior esbranquiçada, que está cercado pela rosé cintilante medula externa. Recolhe-los em DPBS contendo gentamicina e nistatina em uma placa de cultura de 60 milímetros em gelo. </li><li> Uma vez que todos medulas são isoladas e recolhidas em gelo, reduzir o volume de DPBS para um nível em que são cobertos apenas com tampão. Use uma lâmina de barbear estéril para cortar o medulas em cubos de 53 mm. </li><li> Derreta e volta a ponta de uma pipeta Pasteur estéril, segurando-o brevemente em uma chama. Certifique-se que a pipeta é resfriado antes de continuar. </li><li> Transferir a suspensão de tecido para os tubos Falcon de 50 ml contendo solução de enzima esterilizada preparados com hialuronidase e colagenase (ver 1.3.1), usando o arredondado pipeta Pasteur. Fechar hermeticamente a tampa e incubar a 37 ° C, sob agitação contínua (220 rpm) num banho de água de mesa regular para 1,5-2 horas. </li><li> Por trituração da suspensão, pipetar a mistura para cima e para baixo várias vezes, com a pipeta de Pasteur rodada (veja acima) até a suspensão se tornar homogénea turva. </li><li> Centrifugar a suspensão durante 5 min a 300 xg e 16 ° C. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o pellet cuidadosamente em DPBS contendo gentamicina e nistatina e centrifugar novamente. Repetir esta etapa de lavagem uma vez. </li><li> Ressuspender as células em meio totalmente completada e semente-los em cultura pratos e / ou chapas de microtitulação assim. A preparação de 2 medulas (1 animal) irá produzir células suficientes para um prato de cultura de 60 mm. </li><li> Após 24 horas, lave as células duas vezes com 600 mosmol DMEM e adicione meio fresco. Durante a semana seguinte as células deverão ser lavadas 2-3 vezes (Figura 1). 6-8 dias após a sementeira, as células IMCD pode ser utilizado para experiências. Recorde incubar em meio sem dbcAMP e nistatina durante 24 horas antes de começar a experiência. Caso contrário AQP2 será exclusivamente localizado na membrana de plasma. </li></ol>

<ol><li>Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mouse+cortical+collecting+duct+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line.</a> Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).</li>
<li>Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+human+cell+line+transformed+by+DNA+from+human+adenovirus+type+5%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+general+virology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5.</a> The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).</li>
<li>Gluzman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SV40-transformed+simian+cells+support+the+replication+of+early+SV40+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants.</a> Cell. 23, 175-182 (1981).</li>
<li>Ala, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+twelve+mutant+V2+vasopressin+receptors+related+to+nephrogenic+diabetes+insipidus%3A+molecular+basis+of+a+mild+clinical+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).</li>
<li>Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+strains+of+MDCK+cells+which+resemble+separate+nephron+tubule+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+2+Promotes+Cell+Migration+and+Epithelial+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).</li>
<li>Perantoni, A., Berman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+Wilms%27+tumor+line+%28TuWi%29+and+pig+kidney+line+%28LLC-PK1%29+typical+of+normal+kidney+tubular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro%22%5BJournal%5D)">Properties of Wilms' tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium.</a> In vitro. 15, 446-454 (1979).</li>
<li>Katsura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+and+regulated+membrane+expression+of+aquaporin+1+and+aquaporin+2+water+channels+in+stably+transfected+LLC-PK1+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).</li>
<li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+characteristics+of+a+pig+kidney+cell+strain%2C+LLC-PK%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro%22%5BJournal%5D)">The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK.</a> In vitro. 12, 670-677 (1976).</li>
<li>Nedvetsky, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+aquaporin-2+abundance+and+degradation+by+protein+kinase+A+and+p38-MAP+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).</li>
<li>Iolascon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Two+Novel+Missense+Mutations+in+the+AQP2+Gene+Causing+Nephrogenic+Diabetes+Insipidus%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus.</a> Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).</li>
<li>Deen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-2+transfection+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+reconstitutes+vasopressin-regulated+transcellular+osmotic+water+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).</li>
<li>Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D'Ettorre, C., Svelto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+functional+analysis+of+water+channels+in+a+stably+AQP2-transfected+human+collecting+duct+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).</li>
<li>Steele, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+immortalization+of+principal+cells+from+mouse+collecting+duct%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).</li>
<li>Bens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroid-dependent+sodium+transport+in+a+novel+immortalized+mouse+collecting+duct+principal+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).</li>
<li>Hasler, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+regulation+of+aquaporin-2+expression+in+vasopressin-responsive+renal+collecting+duct+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).</li>
<li>Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasopressin+inhibits+apoptosis+in+renal+collecting+duct+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).</li>
<li>Kleinman, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+complexes+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane complexes with biological activity.</a> Biochemistry. 25, 312-318 (1986).</li>
<li>Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmolality+and+solute+composition+are+strong+regulators+of+AQP2+expression+in+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).</li>
<li>Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-2+expression+in+primary+cultured+rat+inner+medullary+collecting+duct+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells.</a> Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).</li>
<li>Liebenhoff, U., Rosenthal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Rab3-%2C+Rab5a-+and+synaptobrevin+II-like+proteins+in+a+preparation+of+rat+kidney+vesicles+containing+the+vasopressin-regulated+water+channel%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel.</a> FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).</li>
<li>Lorenz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+is+sufficient+for+triggering+the+exocytic+recruitment+of+aquaporin-2+in+renal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells.</a> EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).</li>
<li>Tamma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prostaglandin+E2+analogue+sulprostone+antagonizes+vasopressin-induced+antidiuresis+through+activation+of+Rho%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho.</a> J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).</li>
<li>Maric, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+volume+kinetics+of+adherent+epithelial+cells+measured+by+laser+scanning+reflection+microscopy%3A+determination+of+water+permeability+changes+of+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells.</a> Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).</li>
<li>Gonzalez, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+stimulates+renin+in+inner+medullary+collecting+duct+cells+via+protein+kinase+C+and+independent+of+epithelial+sodium+channel+and+mineralocorticoid+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity.</a> Hypertension. 57, 594-599 (2011).</li>
<li>Chou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aquaporin-2+trafficking+by+vasopressin+in+the+renal+collecting+duct.+Roles+of+ryanodine-sensitive+Ca2%2B+stores+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).</li>
<li>Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+native+inner+medullary+collecting+duct+cells+from+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney.</a> Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).</li>
<li>Tchapyjnikov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+nuclei+from+native+renal+inner+medullary+collecting+duct+cells+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS.</a> Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).</li>
<li>Stefan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+cAMP-dependent+signaling+by+phosphodiesterase-4D+is+involved+in+the+regulation+of+vasopressin-mediated+water+reabsorption+in+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).</li>
<li>Klussmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitory+role+of+Rho+in+the+vasopressin-mediated+translocation+of+aquaporin-2+into+cell+membranes+of+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells.</a> J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nós apresentamos um protocolo detalhado para a preparação e cultivo de células IMCD primárias de rato. A abordagem rende até 21 cm 2 de células de um rato 20. O ensaio requer um equipamento padrão de cultura de células e pode ser realizada por uma única pessoa dentro de aproximadamente 6 horas. Por conseguinte, esta abordagem é adequada como um método padrão de laboratório. IMCD células primárias de rato podem ser semeadas em placas de cultura de diferentes tamanhos, qu...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/50366">Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells</a>. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to: Enno Klussmann instead of: Enno Klussman

A correction to author list has been made for article Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells.

Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Na recolha de células renais de condutas principais, a arginina-vasopressina (AVP) controla a reabsorção de água, estimulando a inserção do canal de água aquaporina-2 (AQP2) na membrana plasmática. AVP se liga à proteína acoplada vasopressina tipo-2, receptor de G (V2R) estimular a adenilil ciclase e assim a formação de AMPc. Iniciação desta cascata de sinalização conduz à activação da proteína quinase A (PKA). PKA fosforila AQP2 na serina 256 (S256), que é o factor chave para a sua redistribuição intracelular de vesículas na membrana plasmática. A inserção da membrana facilita a reabsorção de água ao longo de um gradiente osmótico e afina corpo homeostase da água. Desregulação da reabsorção de água AVP-mediada, devido a aberrações da secreção de AVP ou causas sinalização AVP ativados ou está associada a doenças graves. Diminuição da reabsorção de água causada por mutações de V2R ou AQP2 leva a diabetes insípido nefrogênico, enquanto um elevnível AVP plasma sanguíneo decido está associada a reabsorção excessiva de água em doenças cardiovasculares, como insuficiência cardíaca crônica ea síndrome da secreção do hormônio antidiurético inapropriado (SIADH). O significado da reabsorção de água mediada por AVP resulta não só a partir da sua implicação na doença. A translocação AVP induzida por vesículas AQP2-rolamento e fusão com a membrana plasmática representa um processo exocitica estritamente cAMP-dependente, o que atualmente não é bem compreendida. Outros exemplos de um exocitose dependente de AMPc são a secreção de renina a nível renal, secreção de H + no estômago. Portanto, a elucidação dos mecanismos moleculares que regulam a AQP2-translocação em células renais principais não só ajuda a compreender os processos moleculares semelhantes em outros tipos de células, mas também pode abrir o caminho para novas terapias para o tratamento de doenças associadas a distúrbios da reabsorção de água mediada por AVP . Elucidating AQP2 mecanismos de controle requer a coleta principais modelos de células do duto. Por isso, uma série de diferentes linhas de células de rim de mamífero estão disponíveis. No entanto, estes modelos têm vários inconvenientes. Em muitos sistemas de célula o nível de proteína AQP2 é baixa (Tabela 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, outros ectopicamente superexpressam humanos (MCD4, WT10) ou 11,12 rato (CD8) 13 AQP2. Em MCD4 e células COS-7 do receptor V2 não é expresso. Para o nosso conhecimento, não há linha de células permanente como um modelo disponível, que é derivada da recolha da medula renal conduta interior, a parte do rim onde AQP2 expressão é mais abundante, mas a partir da conduta de recolha cortical 1,11,13-16 . Tais modelos de células são por exemplo os mpkCCD imortalizada utilizada (por exemplo, 17) ou os mTERT CCD 14 linhas de células recentemente estabelecidas. Ambas as linhas de células endogenamente AQP2 expressa e V2R, mas uma vez que eles são derivados daduto coletor cortical provavelmente conter um proteoma diferente em relação ao coletor medular interno células do duto (IMCD). Eles devem, por exemplo, expressar diferente Na + sistemas de transporte. Aqui, apresentamos um protocolo de cultura de células primárias IMCD expressando V2R e AQP2 endogenamente. Este modelo, portanto, representa mais de perto a situação fisiológica no ducto coletor renal. Como estabelecer a cultura exige apenas padrão de laboratório, equipamento de outros laboratórios podem facilmente adotar essa abordagem.

<table><tbody><tr>Tipo <td>biosciences</td> <td>do BD do rato do tipo IV do colagênio</td><td>356233</td><td></td></tr> o <tr><td>tipo CLS-II da colagenase</td><td></td> SIGMA H6254 <td></td> Biochrom AG C2-22 <td></td></tr><tr><td>DMEM + GlutMAX</td><td>Invitrogen GIBCO</td><td>21885108</td><td></td></tr><tr><td>a nistatina</td><td>SIGMA</td><td>N4014</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Ultroser G Cytogen 15950-017 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais (NEA)</td> <td>Biochrom AG</td><td>K0293</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Invitrogen GIBCO</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>DBcAMP</td><td>BIOLOG</td><td>D009</td><td></td></tr></tbody></table>

cultura primária rat coletor medular interno células dos ductos

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Arginina-vasopressina (AVP), facilita a reabsorção de água por renal coletando células principais do duto e, assim, afina corpo homeostase da água. AVP se liga aos receptores de vasopressina V2 (V2R) na superfície das células e, assim, induz a síntese de cAMP. Este estimula a processos de sinalização intracelular que conduzem a alterações na fosforilação do canal de água aquaporina-2 (AQP2). Proteína cinase A phoshorylates AQP2 gerando assim a translocação de AQP2 de vesículas intracelulares para a membrana plasmática facilitar a reabsorção de água a partir da urina primária. Aberrações de libertação da AVP sinalização pituitária ou AVP-activado em células principais podem causar insipidus nefrogénica centrais ou diabetes, respectivamente, um nível elevado de AVP plasma sanguíneo está associada com doenças cardiovasculares, tais como insuficiência cardíaca crónica e síndroma de secreção inapropriada de hormona antidiurética. Aqui, apresentamos um protocolo para cultivatino de rato principal coletor medular interno células do duto (IMCD), que expressa V2R e AQP2 endogenamente. As células são adequados para a elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes ao controlo das AQP2 e, portanto, para descobrir novos alvos terapêuticos para o tratamento de doenças associadas com a desregulação da reabsorção de água mediada por AVP. IMCD células são obtidas a partir de ratos medulas interior renal e são utilizados em experiências de seis a oito dias após a semeadura. IMCD células podem ser cultivadas em placas de cultura de células normais, frascos e placas de micro-titulação de formatos diferentes, o procedimento requer apenas algumas horas, e é apropriado para laboratórios de cultura de células padrão.

O sucesso do cultivo de células primárias de rato IMCD resultará numa monocamada confluente de 6-8 dias após a sementeira (Figura 2). Por 60 milímetros prato de cultura há aproximadamente 6 x 10 6 células. As células firmemente aderir às placas de cultura, uma vez que estes foram revestidos com colagénio do tipo IV, um componente da membrana basal 18. Portanto, as células IMCD não irá separar mesmo durante vários procedimentos de lavagem cuidadosa. Até 80% das células cultivadas ex...

Arginina-vasopressina (AVP) controla o ajuste fino da homeostase de água do corpo, facilitando a reabsorção de água pelas células principais renais. Aqui, apresentamos um protocolo para o cultivo de rato principal coletor medular interno células do duto adequados para a elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes à reabsorção de água AVP-mediada.

Cultura primária Rat coletor medular interno células dos ductos

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar células primárias do ducto coletor intermedular ou células IMCD adequadas para o estudo da reabsorção de água mediada por VP. Isso é realizado primeiramente removendo os rins do rato. O segundo passo é isolar a medula interna da medula externa e do córtex circundantes.Em seguida, os melis internos são digeridos enzimaticamente para liberar células individuais. O passo final é suspender e selecionar as células principais e, então, semear-nas em placas de cultura. Em última análise, seis a oito dias após a semeadura, as células estarão prontas para serem utilizadas em experimentos.O sistema de cultura celular é adequado para a elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes à reabsorção de água mediada por VP e, possivelmente, a outros processos TIC dependentes de CAP. Além disso, o sistema pode ser utilizado para a descoberta de novos candidatos a fármacos e alvos terapêuticos para o tratamento de doenças associadas à desregulação da reabsorção de água mediada por VP. O procedimento será demonstrado por um estudante de doutorado do nosso laboratório e por Beata Eman e Andrea Giller, duas técnicas do nosso laboratório.Após a cena da linha

culturing-primary-rat-inner-medullary-collecting-duct-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este é um protocolo que descreve como isolar e cultura primária de neurônios simpáticos gânglios cervical superior (GCS) de filhotes de rato recém-nascido.

Protocolo para Neurônios Cultivar Sympathetic de Gânglios Superior Rat Cervical (SCG)

Nós descrevemos uma metodologia rápida para isolar e cultivar os neurônios do hipocampo e cortical a partir de embriões de roedores. Este protocolo permite a realização de experimentos em que quase puras culturas neuronais são necessários.

Isolamento e cultivo de células neurais embrionárias de ratos: um protocolo rápido

Neste vídeo, demonstramos as etapas para isolar e purificar células epiteliais tubulares renais para uma ampla gama de estudos de biologia molecular e cultura de células.

Isolamento de células renais murinas: uma técnica para isolar e gerar cultura primária de células epiteliais tubulares renais

Este vídeo demonstra uma técnica para isolar e cultivar células dos gânglios da raiz dorsal (DRG) da coluna vertebral de ratos. Os DRGs excisados da coluna vertebral são tratados com enzimas e dissociados mecanicamente para obter uma suspensão unicelular. As células são cultivadas em um meio contendo inibidores e fatores de crescimento que limitam a proliferação de células gliais e promovem o crescimento neuronal, respectivamente.

Estabelecendo uma cultura de células de gânglios da raiz dorsal primária a partir de uma coluna vertebral de rato

Este protocolo descreve o isolamento, cultura e calcificação de células intersticiais do rato-derivado da válvula, um modelo altamente fisiológica em vitro da doença valvar aórtica calcífica (CAVD). Exploração deste modelo de rato facilita a pesquisa CAVD em explorar a célula e os mecanismos moleculares que estão subjacentes a este complexo processo patológico.

Isolamento e caracterização de rato primário válvula células intersticiais: um novo modelo para estudar a calcificação da válvula aórtica

Este protocolo fornece uma abordagem econômica para isolar e caracterizar pilhas do rato primária renal tubular que podem posteriormente ser sub cultivadas para avaliar funções biológicas renal ex vivo, incluindo bioenergética mitocondrial.

Isolamento, caracterização e alto Throughput análise de fluxo extracelular de Mouse primária Renal Tubular as células epiteliais

O hormônio secretado pelo córtex adrenal é vital para os animais contra doenças e estresse. Aqui, apresentamos um protocolo para cultura o rato primário células adrenais. Pode ser uma boa plataforma in-vitro para investigar os mecanismos do reagente de interesse na esteroidogênese adrenal e biossíntese de lipídios.

Cultura primária de células Adrenocortical rato e ensaios das funções reguladora

Este protocolo tenta estabelecer um protocolo repetível para neurônios primários e isolamento de glia da bexiga de rato para novos experimentos celulares.

Isolamento e Cultura dos Neurônios Primários e Glia da Bexiga Urinária de Ratos Adultos

Este artigo descreve o isolamento e a culminação de neurônios simpáticos de ratos embrionários da gânglio cervical superior. Também fornece protocolos detalhados para coloração imunocitoquímica e para preparação de extratos neuronais para análise espectrométrica em massa.

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Este artigo apresenta um protocolo detalhado para isolar células primárias de Müller retinianas de ratos Sprague-Dawley (SD) neonatais. O procedimento inclui enucleação dos globos oculares, dissecção do tecido retiniano, extração e identificação de células e considerações importantes para a cultura de células subsequente.

Isolamento e cultura de células Müller primárias da retina de ratos Sprague-Dawley (SD)

Aprenda a cultivar células primárias de ducto coletor da medula interna de rato para estudar a reabsorção de água mediada pela arginina-vasopressina. Este protocolo permite investigar mecanismos moleculares da fisiologia renal.

Cultura primária Rat coletor medular interno células dos ductos

Explorar mais vídeos