A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas

O objetivo geral do seguinte protocolo é permitir a investigação em escala genômica da função gênica por meio do monitoramento simultâneo de múltiplas leituras celulares. Nesta demonstração, repórteres baseados na luciferase de Firefly RAN e na Cipro Dina Luciferase são utilizados para monitorar a atividade da via P 53 WINT e da via KRAS, respectivamente. Esses três repórteres são cotransfectados com irna direcionado a um gene de interesse em células HCT one 16, uma linhagem de células de câncer colorretal.

Posteriormente, as atividades da luciferase de vagalume e da luciferase vanilla são medidas nos lisados celulares, enquanto a atividade da luciferase Cipro DEA, uma enzima secretada, é medida no meio de cultura. São obtidos resultados que demonstram a reprodutibilidade do sistema de ensaio, bem como a capacidade de revelar ações compartilhadas e únicas de genes dentro dessas três vias relevantes para o câncer.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como microrray ou pries multicoloridos, é que ela representa uma forma acessível, universal e economicamente eficiente de analisar os produtos transcricionais celulares. Este método pode auxiliar a responder questões na pesquisa do câncer, tais como o desenvolvimento de estratégias terapêuticas molecularmente direcionadas. Embora nosso protocolo de transfeção transitória exija pouco esforço e tempo inicial mínimo para a configuração do ensaio, é provável que aumente a variabilidade do sinal entre poços, o que pode ser compensado pela análise das razões dos relatórios em vez de examinar falhas absolutas provenientes dos poços. Para iniciar este procedimento, lave cinco placas de 10 centímetros quadrados contendo células HCT116 com 80 a 90% de confluência com PBS e, em seguida, recolha as células por tripsinização para cada placa.

Utilize um mililitro de solução de tripsina, seguido de neutralização com 10 mililitros de DMEM contendo 2% de FBS e 1% de penicilina. Transfira as células suspensas para um tubo cônico de 50 mililitros e centrifugue a aproximadamente 130 ×g por cinco minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de meio.

Conte o número de células com um contador de células e, em seguida, prepare uma solução celular com 10 elevado à quinta células por mililitro. Mantenha 150 mililitros de suspensão celular para o próximo passo, utilizando uma placa com dispensador automático de líquidos multipipeta. Adicione 100 microlitros ou 10 elevado à quarta células em cada poço de uma placa de cultura de 96 poços.

A suspensão celular neste caso deve ser suficiente para semear 1296 placas de poços. Incube as placas com as células a 37 graus Celsius em um incubador com 5% de dióxido de carbono enquanto prepara a mistura de transfeção. O DNA de alta qualidade do construto repórter utilizado aqui foi isolado utilizando kits padrão de preparação MIDI e diluído para uma concentração final de um miligrama por mililitro.

Para cada repórter, prepare 100 microlitros de solução estoque do construto do repórter combinando os seguintes componentes: 30 microlitros de P 53, 30 microlitros de FL, 30 microlitros de oito X-T-C-F-R-L, 30 microlitros de elk um G quatro, seis microlitros de U-A-S-C-L e quatro microlitros de H dois oh. Isso resultará em uma mistura de DNA com uma proporção final de um para um para um para 0,2 dos repórteres e uma concentração final de DNA de 0,3 miligramas por mililitro. Em seguida, prepare misturas de transfeção de I-R-N-A-D-N-A suficientes para transfectar 1296.

Placas de poços diluem 80 microlitros da solução estoque do construto repórter em oito mililitros de tampão EC do kit QIAGEN effecting para obter uma solução de DNA com uma concentração final de três microgramas por mililitro por placa. Adicione 20 microlitros da solução de DNA em cada poço de uma placa de PCR de 96 poços. O número de placas de 96 poços dependerá de quantas piscinas de irna serão testadas.

Por exemplo, neste caso, precisaremos de 4 placas de 96 poços para avaliação. Usando um manipulador automático de líquidos Biome, transfira dois microlitros de cada siRNA a cinco micromolar para o poço correspondente da placa de PCR contendo o estoque de DNA diluído. Em seguida, adicione um microlitro da solução de potenciador a cada poço da placa de DNA e siRNA.

Deixe a reação do potenciador ocorrer à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione três microlitros do reagente efetuador de transfeção a cada poço e incube à temperatura ambiente por mais 10 minutos. Para interromper a formação do complexo de transfeção, adicione 10 microlitros de DMEM contendo 2% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina a cada poço da placa de PCR.

Retire as placas de 1296 poços contendo células HCT 116 do incubador. Transfira 10 microlitros da mistura de transfeção para cada poço de uma placa de 96 poços contendo as células, já que cada transfeção será realizada em triplicata. A mesma mistura será aplicada a duas placas adicionais de 96 poços contendo células.

Incube as células com as misturas de transfeção a 37 graus Celsius em um ambiente umidificado com 5% de dióxido de carbono por 36 horas. 36 horas após a transfeção das células, as atividades de luciferase estão prontas para serem medidas.

Como este estudo incorpora múltiplos repórteres, um secretado no meio de cultura e dois outros expressos no citoplasma celular, as medições serão obtidas tanto do meio de cultura quanto de um lisado celular para detectar a atividade da luciferase Cipro Dina ou CL na cultura. Placa de réplica do meio.

20 microlitros de um meio de cultura em uma placa branca opaca de 96 poços. Usando o Multi Drop, adicione 20 microlitros de tampão do ensaio de quimioluminescência a cada poço. Em seguida, adicione 10 microlitros de Cipro Dina Lucifer e substrato a cada poço e detecte a atividade de quimioluminescência utilizando um luminômetro para detectar as atividades da luciferase da luciérnaga e da luciferase de vagem, sendo necessário primeiramente obter lisados celulares.

Remova o meio de cultura das células virando cada placa de cabeça para baixo e descartando o meio na pia. Remova o meio restante batendo suavemente a placa virada sobre toalhas de papel. Adicione 30 microlitros de tampão de lise passiva 1x a cada poço com células.

Coloque as placas em um agitador orbital ajustado em velocidade média por cinco minutos à temperatura ambiente. Após cinco minutos, adicione 20 microlitros do reagente do ensaio de luciferase a cada poço de células e meça imediatamente a atividade da luciferase de vagalume utilizando o luminômetro. Em seguida, adicione o reagente stop and glow para inibir a atividade da luciferase de vagalume e então meça a atividade da luciferase.

Antes da multiplexação, a robustez das três plataformas de triagem diferentes foi avaliada individualmente. Linhagens celulares de câncer colorretal indicadas foram transfectadas com os oito construtos repórter que codificam XTCF PP 53 ta Luke ou ALK um Firefly Luciferase, juntamente com pools de siRNAs direcionados a WINT beta-Catenina P 53 ou KAS, respectivamente. Os genótipos relevantes para a via em cada linhagem celular são indicados.

A força de cada plataforma de triagem foi avaliada pela reprodutibilidade desses efeitos induzidos na via de transdução de sinal relevante. Como mostrado nestes resultados representativos, a betaina e os siRNAs não têm efeito na atividade do repórter XTCF oito em células RKO. Em contraste com as células DLD um e HCT um 16, que são respectivamente deficientes na via APC, na proteína supressora e que expressam uma forma ativada da β-catenina.

Posteriormente, demonstrou-se que esses repórteres poderiam ser usados em conjunto para medições simultâneas da atividade gênica das vias de transdução de sinal de beta-catenina wind, P53 e KRAS, utilizando os pools de iRNA indicados nestes gráficos. As atividades relativas de luciferase são mostradas no eixo Y e os siRNAs direcionados ao gene de interesse indicado são mostrados no eixo X. Por exemplo, um pool de siRNA direcionado à beta-catenina reduz a atividade da via de sinalização beta-catenina wind, sem afetar significativamente as vias P53 e KRAS.

Ao tentar desenvolver um sistema de repórter multiplexo, é importante otimizar a linhagem celular de interesse para a região de transfeção e para o sinal do repórter pretendido.