Name: A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Aprenda a usar repórteres de luciferase multiplexados para analisar vias de sinalização P53, WNT e KRAS em células HCT116 de câncer colorretal. Este método permite interrogar funções gênicas em escala genômica de forma reprodutível e econômica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Reconhecemos o apoio financeiro do CPRIT (RP100119) e da Fundação Welch (I-1665).

Protocolo inteiro leva cerca de 4 dias. 1. Preparação de células para siRNA e Reporter transfecção Vamos introduzir aqui um protocolo para interrogar bibliotecas de siRNA usando um pequeno conjunto de siRNAs (384 matriz diferente piscinas siRNA em formato de 96 poços com cada conjunto constituído por siRNAs 4x destinada a um único gene) a partir de uma biblioteca de siRNA de todo o genoma para fins ilustrativos. Para este estudo particular, vamos explorar HCT116 células que apresentam sinalização Wnt e Kras desviantes e atividade p53. A linha celular adequada em estudos destinados a interrogar outros processos celulares de interesse terão de ser identificado e avaliado de uma maneira semelhante. <ol><li> Lavar 5 x 10 cm 2 placas de 80-90% confluentes, as células HCT-116 com PBS, em seguida as células por tripsinização de colheita utilizando 1 ml de solução de tripsinização / placa, seguido de neutralização com 10 mL de Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 2% feTal soro de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina / placa. </li><li> Transferência de células em suspensão para um tubo cónico de 50 ml e centrifugar a ~ 130 x g durante 5 minutos, remover o sobrenadante, e re-suspender o sedimento celular em 10 ml de DMEM / FBS a 2% / 1% de penicilina / estreptomicina. </li><li> Conte o número de células com um contador de células e em seguida, fazer uma solução de células com 10 5 células / ml, manter 150 ml de suspensão celular para o próximo passo. Placa 10 4 células (100 ul) em cada poço de uma placa de cultura de células de 96 poços utilizando um dispensador de liquido Multidrop automatizado (doravante Multidrop). A suspensão de células deve ser suficiente, neste caso, para chapeamento de 12 x placas de 96 poços. </li><li> Incubar as placas com as células a 37 ° C numa incubadora com 5% de CO 2 durante a preparação da mistura de transfecção. </li></ol> 2. Preparando-se construir o Reporter Banco Solution <ol><li> Isolar repórter de alta qualidade construir DNA usando o padrão midiprep kits (NucleoBond Xtra Midi produzido porClontech) e diluir o ADN para uma concentração final de 1 mg / ml para cada repórter. </li><li> Prepare a 100 ul de solução de reserva de construção repórter combinando 30 ul de p53-FL, 30 ul de 8X TCF-RL, 30 ul de Elk1-Gal4, 6 ul de UAS-CL e 4 mL de H 2 O para obter uma mistura de ADN com uma proporção final 1:1:1:0.2 dos repórteres. Concentração de ADN final desta solução estoque mistura de ADN é de 0,3 mg / ml. </li></ol> 3. Preparando o siRNA / DNA Mix transfecção Nesta parte do protocolo, vamos preparar siRNA / DNA misturas de transfecção, que será suficiente para a transfecção de 12 x placas de 96 poços. Para este ensaio de biblioteca de 4 x placa de 96 poços de siRNAs, vamos transfectar cada pool de siRNA em triplicado. O reagente de transfecção usaremos é chamado Effectene (Qiagen). Nas nossas mãos este é o único reagente, que funciona para a entrega simultânea de siRNA e DNA em células em cultura. <ol><li> Diluir 80 ml de repórter construção estoque soluição em 8 ml de tampão de CE (Effectene Kit) para obter uma solução de DNA com uma concentração final de 3 ng / ml. Em geral, preparar suficiente mistura solução de ADN para uso imediato. </li><li> Placa de 20 ul desta solução de ADN para cada poço de um de 96 poços / placa. O número de placas de 96 poços vai depender de quantas piscinas siRNA será testado. Por exemplo, neste caso, vamos precisar de 4 x placas de 96 poços para avaliar 384 diferentes conjuntos de siRNA. </li><li> Os siRNAs a serem testadas devem estar a uma concentração de estoque de 5 mM. Caso contrário, eles podem ser semeadas réplicas e diluída para esta concentração, utilizando o tampão de diluição recomendada associado com cada biblioteca. </li><li> Transferir 2 ul de cada unidade siRNA 5 uM para o correspondente poço da placa de PCR contendo o estoque de ADN diluída com uma Biomek Automated Liquid Handler. Dependendo da escala do estudo, uma pipeta multi-canal pode ser suficiente. </li><li> Agora, será adicionado 1 ul de solução de realçador (Effectene kit) para cada poço de DNA / siRNA plate. Isto também pode ser conseguido ou com um manipulador de líquidos ou automatizado pipetador multicanal. </li><li> Permitir que a reacção Enhancer a ocorrer à temperatura ambiente durante 5 min, em seguida, adicionar 3 ml de reagente de transfeco Effectene a cada poço e incubar à temperatura ambiente durante um adicional de 10 min. </li><li> Para parar a formação de complexos de transfecção, adicionam-se 10 ul de DMEM / FBS a 2% / 1% de penicilina / estreptomicina a cada poço da placa de PCR. </li><li> Transferem-se 10 ul da mistura de transfecção a cada poço da placa de 96 poços contendo as células (recuperados a partir da célula incubadora). À medida que cada transfecção serão realizados em triplicado, a mesma mistura será aplicada a duas placas de 96 poços contendo células adicionais. </li><li> Incubar as células com misturas de transfecção adicionados a 37 ° C num ambiente humidificado com 5% de CO 2 durante 36 horas. </li></ol> 4. Determinar as respectivas actividades de luciferase a partir de amostras de células Após 36 horas, as atividades de luciferase estão prontos para a mediçãoem células transfectadas. O desfecho deve ser determinada em uma base per-experimento. Em nosso estudo, um tempo de incubação de 36 horas já havia rendido um sinal suficientemente robusta para significando determinação resultado. Como este estudo incorpora múltiplos repórteres (um segregada para o meio de cultura, e os outros dois expresso no citoplasma da célula), vamos obter a partir de medições tanto meio de cultura, assim como um lisado celular. <ol><li> Detecção de actividade de CL no meio de cultura: <ol><li> 20 mL de meio de cultura é réplica banhado em uma placa de 96 poços opaco branco (usando o líquido Handler Biomek ou pipeta multicanal). </li><li> Adicionar 20 ul de tampão de ensaio CL (Targeting Systems) a cada poço. </li><li> Adicionar 10 ul de substrato luciferina Cypridina (Targeting Systems) a cada poço e detectar a actividade CL utilizando um luminómetro (o leitor de placas Pherastar produzido por BMG, por exemplo). </li></ol></li><li> Detecção de actividade de FL e RL: <ol><li> Lyse do cells primeiro por remoção do meio de cultura. Isto pode ser realizado rapidamente rodando placa invertida e jogando médio em uma pia. Meio restante pode ser removido batendo suavemente a placa de cabeça para baixo sobre toalhas de papel. Adicionar 30 ul de 1x tampão de lise passiva (Promega) a cada poço de células usando o Multidrop e coloque numa plataforma oscilante (Bélico é uma empresa que fabrica estes) definir uma velocidade média, durante 5 min à TA. </li><li> Adicionar 20 ul de Reagente de Ensaio da Luciferase II (parte do kit Promega Luciferase Duplo) utilizando a actividade FL Multidrop e medir imediatamente usando o luminómetro. Em seguida, adicione Stop &amp; Glo Reagente (Promega), que irá saciar a atividade FL e permitir a medição da atividade RL. Nota: a menos que você estiver usando misturas de substratos que permitem duração do sinal estendido (como Kits de luciferase Dual-Glo da Promega), o uso do flash kits exige uma rápida medição com a adição de substrato (dentro de 5 min). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+and+bioluminescent+reporter+gene+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays.</a> Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).</li>
<li>Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+light%3A+luminescent+reporter+gene+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+%26+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Seeing the light: luminescent reporter gene assays.</a> Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 14, 648-657 (2011).</li>
<li>McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+systems+in+Drosophila%3A+a+synthesis+of+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space.</a> Trends in Genetics: TIG. 20, 384-391 (2004).</li>
<li>Smirnova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Neh2-luciferase+reporter+and+its+application+for+high+throughput+screening+and+real-time+monitoring+of+Nrf2+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of Neh2-luciferase reporter and its application for high throughput screening and real-time monitoring of Nrf2 activators.</a> Chem. Biol. 18, 752-765 (2011).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-mediated+disruption+of+Wnt-dependent+signaling+in+tissue+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer.</a> Nat. Chem. Biol. 5, 100-107 (2009).</li>
<li>Tang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+for+Wnt%2Fbeta-catenin+pathway+components+identifies+unexpected+roles+for+TCF+transcription+factors+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen for Wnt/beta-catenin pathway components identifies unexpected roles for TCF transcription factors in cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9697-9702 (2008).</li>
<li>Multiplexed Luciferase Reporter Assay Systems. United States patent. , (2012).</li>
<li>Funk, W. D., Pak, D. T., Karas, R. H., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptionally+active+DNA-binding+site+for+human+p53+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes.</a> Mol. Cell Biol. 12, 2866-2871 (1992).</li>
<li>DasGupta, R., Kaykas, A., Moon, R. T., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+the+Wnt-wingless+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of the Wnt-wingless signaling pathway.</a> Science. 308, 826-833 (2005).</li>
<li>Korinek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+epithelial+stem-cell+compartments+in+the+small+intestine+of+mice+lacking+Tcf-4%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4.</a> Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).</li>
<li>Korinek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+members+of+the+Tcf+family+implicated+in+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+during+embryogenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two members of the Tcf family implicated in Wnt/beta-catenin signaling during embryogenesis in the mouse.</a> Mol. Cell Biol. 18, 1248-1256 (1998).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+characterization+of+human+colon+and+rectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer.</a> Nature. 487, 330-337 (2012).</li>
<li>Koboldt, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. , (2012).</li>
<li>Wood, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+landscapes+of+human+breast+and+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers.</a> Science. 318, 1108-1113 (2007).</li>
<li>Berndt, J. D., Biechele, T. L., Moon, R. T., Major, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+genome-wide+RNA+interference+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of genome-wide RNA interference screens.</a> Science Signaling. 2, pt4(2009).</li>
<li>Falschlehner, C., Steinbrink, S., Erdmann, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+to+dissect+cellular+pathways%3A+a+how-to+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening to dissect cellular pathways: a how-to guide.</a> Biotechnology Journal. 5, 368-376 (2010).</li>
<li>Boutros, M., Bras, L. P., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell-based+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell-based RNAi screens.</a> Genome Biology. 7, R66(2006).</li>
<li>Gilbert, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multiplex+cell+viability+assay+for+high-throughput+RNAi+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening.</a> PLoS ONE. 6, e28338(2011).</li>
</ol>

OK e LL são autores de uma patente pendente relativa ao multiplexados tecnologia luciferase.

Existem vários fornecedores de sistemas repórter baseados em luciferase (tais como Promega, Targeting Systems, New England Biolabs, e Thermo Fisher) que fornecem úteis recursos on-line para aqueles entreter uma tela de alto rendimento para a primeira vez. Além disso, uma série de excelentes comentários sobre a otimização do uso de telas de alto rendimento para a descoberta dos genes e como baseada em RNAi resultados de rastreio pode ser integrado com conjuntos de dados-omics baseados outro deve ser útil 15,16.</sup...

Uma variedade de repórteres de luciferase de base para monitorizar uma matriz diversificada de processos biológicos celulares estão comercialmente disponíveis. A maioria destas construções de ADN que codificam proteínas de luciferase são induzidas para expressar por estímulos específicos de células ou perturbações. Os sólidos repórteres maioria baseados na transcrição colocar a expressão de uma enzima da luciferase sob o controlo de elementos potenciadores sintéticos ou regiões promotoras de genes bem estabelecidos para a sua fiabilidade em um relato de eventos de transcrição 1,2 fisiologicamente relevante. Há também sistemas de trans-repórter de luciferase que utilizam GAL4-UAS para dirigir a expressão da proteína luciferase. Gal4 é um activador da transcrição de levedura e as UAS é um potenciador para o qual se liga especificamente Gal4 para activar a transcrição de sequências de genes colocados a jusante do mesmo 3. Estes tipos de sistemas de luciferase são tipicamente suportado por dois plasmídeos de ADN - uma codifica a proteína GAL4 fundido com o regulatory porção de uma proteína de interesse e o segundo codifica uma proteína da luciferase colocado sob o controlo de uma ou mais sequências UAS. Assim, o sinal de luciferase celular reflecte o nível da actividade da proteína de interesse. Outra utilização comum de repórteres de luciferase de base é para monitorizar a estabilidade da proteína em que uma proteína de interesse é fundida a uma enzima luciferase 4. Independentemente do tipo de repórter, um caveat.emptor é notado aqui como não se pode assumir a especificidade de qualquer repórter ter sido bem interrogados. Assim, due diligence é necessária a incorporação de novas construções repórter em qualquer estratégia de pesquisa. A selecção da enzima luciferase a leitura pode ser tão importante como a fiabilidade dos elementos de DNA que controlam a sua expressão. Considerando que a luciferase do pirilampo (FL) é a enzima mais utilizada em construções comercialmente disponíveis, o advento de novos sistemas de repórter da luciferase que não necessitam de ATP (como no casode reações baseadas FL) ou que incorporem enzimas mais estáveis ​​que emitem sinais mais fortes prometem melhorar a eficiência ea confiabilidade desta plataforma de pesquisa. Uma nota importante sobre a selecção de repórteres de luciferase em estudos químicos é a susceptibilidade de FL para inibição química que poderia dar origem a relatórios falsos. Na nossa experiência, outras enzimas, tais como a luciferase de Renilla, ou Gaussia (RL e GL, respectivamente), que utilizam como substrato coelenterazina são menos facilmente inibidas por moléculas pequenas 5. O formato mais comum para multiplexação de luciferase leia-outs implica a utilização de FL e RL, em grande parte devido à disponibilidade de fácil de usar kits com a capacidade de medir actividades enzimáticas sequencialmente a partir de uma única amostra. Na maioria dos jogos, as amostras são expostos primeiro a luciferina para revelar os níveis de actividade FL seguido por um reagente de extinção que é depositado simultaneamente com coelenterazina para originar um em segundasinal RL dary. Com a adição de outras luciferases de que podem ser segregadas, tais como GL ou que o uso de um outro substrato, tal como a luciferase Cypridina (CL), um maior número de possibilidades para a geração de dados de conteúdos elevados utilizando luciferases emergiram. Um exemplo de uma tela de RNAi do genoma usando esta técnica pode ser encontrada aqui 6. Estes avanços tecnológicos têm por sua vez, estimulou o desenvolvimento de mecanismos específicos para extinguir cada tipo de enzima luciferase a fim de limitar a conversa cruzada 7. Em nossas mãos, notamos uma maior freqüência de &quot;efeitos de borda&quot; (tendências inexplicáveis ​​na atividade celular associada à beira de placas de cultura de alta titulação), com luciferases secretadas como GL ou CL. Por outro lado, tais luciferases secretadas são úteis para ensaios cinéticos, pois permitem a amostragem do sinal sem adulterar a viabilidade celular. Para o nosso estudo apresentado aqui, vamos monitorar simultaneamente a atividade de três câncer relevanteprocessos celulares: o p53, Kras, e vias de sinalização Wnt. Os repórteres incorporados no nosso estudo são a FL repórter PP53-TA-Luc de Clontech (doravante referido como o repórter p53-FL) 8, um sistema repórter Elk1-GAL4/UAS-CL (doravante, Elk-1 repórter; Agilent), eo 8X TCF RL repórter que incorpora vários elementos potenciador sintéticos reconhecidos pela via Wnt reguladores de transcrição, conhecidos como fatores de células T (ou TCFs) 9-11.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>PathDetect Elk1 Trans-Reporting System</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td></td><td></td>219005</tr><tr><td>Sistema de Perfil de Caminho Luciferase 4 pp53-TA-Luc Vector</td><td>Clontech Lab Inc.</td><td></td><td></td>631914</tr><tr><td>Reagente de Transfecção Effectene</td><td>Qiagen Inc.</td><td></td><td></td>301427</tr><tr><td>Sistema de Ensaio Reporter de Luciferase Dupla</td><td>Promega Corp.</td><td>E1960</td><td></td></tr><tr><td>Cypridina Luciferase Ensaio reagente</td><td>Direcionamento Sistemas</td><td>VLAR-1</td><td></td></tr><tr><td>HCT116 células</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td></td></tr><tr><td>CytoTox-Fluo Ensaio de citotoxicidade</td><td>Promega Corp.</td><td>G9260</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>MultiFlo Dispensador de Microplacas</td><td>Labsystems Inc.</td><td>Modelo 832</td><td></td></tr><tr><td>Biomek FXP Estação de Trabalho de Automação Laboratorial</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>A31842</td><td></td></tr><tr><td>PHERAstar FS-multi-modo HTS leitor de microplacas</td><td>BMG Labtech Inc.</td><td>0471-101A</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitômetros Bright-Line Reichert</td><td>Hausser Scientific Company</td><td>1490</td><td></td></tr></tbody></table>

a plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Interrogatório da função do gene usando RNA de interferência (RNAi) genoma escala detém uma grande promessa para a rápida identificação de vulnerabilidades de células de câncer quimicamente tratáveis. Limitar o potencial desta tecnologia é a incapacidade de delinear rapidamente a base mecanicista de resultados fenotípicos e, assim, informar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas molecularmente alvo. Nós delineamos aqui métodos para desconstruir fenótipos celulares induzidas pelo gene RNAi mediado alvo usando sistemas repórter multiplexados que permitem a monitorização do câncer de processos-chave associados a células. Esta metodologia de rastreio de alto conteúdo é versátil e pode ser facilmente adaptado para o rastreio de outros tipos de grandes bibliotecas moleculares.

Apesar dos avanços no mapeamento da paisagem mutacional de vários tipos de câncer usando enormes esforços de seqüenciamento do genoma 12-14, ainda não tem em lugar de uma abordagem sistemática para traduzir estas observações em estratégias de intervenção. No câncer colorretal (CRC), as mutações que estão previstos para afetar os componentes de três processos celulares - Wnt / β-catenina, p53, e Kras sinalização - são encontrados em 99% de todos os tumores, sugerindo que eles são fatores-chave de transformação...

Alcançar um nível de compreensão dos processos celulares de sistemas é uma meta da biologia celular moderna. Descrevemos aqui as estratégias para jornalistas luciferase multiplexação de várias funções celulares de pontos finais para interrogar a função do gene usando genoma escala bibliotecas RNAi.

A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

O objetivo geral do seguinte protocolo é permitir a investigação em escala genômica da função gênica por meio do monitoramento simultâneo de múltiplas leituras celulares. Nesta demonstração, repórteres baseados na luciferase de Firefly RAN e na Cipro Dina Luciferase são utilizados para monitorar a atividade da via P 53 WINT e da via KRAS, respectivamente. Esses três repórteres são cotransfectados com irna direcionado a um gene de interesse em células HCT one 16, uma linhagem de células de câncer colorretal.Posteriormente, as atividades da luciferase de vagalume e da luciferase vanilla são medidas nos lisados celulares, enquanto a atividade da luciferase Cipro DEA, uma enzima secretada, é medida no meio de cultura. São obtidos resultados que demonstram a reprodutibilidade do sistema de ensaio, bem como a capacidade de revelar ações compartilhadas e únicas de genes dentro dessas três vias relevantes para o câncer.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como microrray ou pries multicoloridos, é que ela representa uma forma acessível, universal e economicamente eficiente de analisar os produtos transcricionais celulares. Este método pode auxiliar a responder

a-multiplexed-luciferase-based-screening-platform-for-interrogating

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Relógios circadianos funcionam no interior das células individuais, ou seja, são células-autónomo. Aqui, descrevem métodos para a geração de modelos de células autónomas relógio usando não-invasiva, com base em tecnologia de luciferase bioluminescência em tempo real. Células repórter fornecer tratáveis, sistemas modelo funcional para estudar biologia circadiano.

Monitorização das células-autônomas Ritmos relógio circadiano de expressão genética dos Repórteres Bioluminescência luciferase

Neste vídeo, descrevemos um método que destaca a utilidade do ensaio de bioluminescência para triagem sensível e rápida de medicamentos. Esses medicamentos podem ser testados sozinhos ou em combinação para avaliar o sinergismo em seu modo de ação.

Ensaio baseado em bioluminescência celular: um método de alto rendimento para triagem combinatória de drogas

Neste vídeo, demonstramos um ensaio rápido de adição única para avaliar a viabilidade celular em organoides derivados de pacientes após o tratamento com um agente de teste usando níveis de ATP intracelular como marcador de atividade metabólica celular. Os níveis intracelulares de ATP são medidos usando a reação luciferase/luciferina, onde a intensidade da luz emitida indica a viabilidade celular e, por sua vez, a potência inibidora do crescimento do agente de teste.

Ensaio de viabilidade da luciferase baseada em ATP: um método homogêneo para avaliar o potencial inibidor do crescimento de agentes de teste em organoides tumorais

O vídeo demonstra o ensaio de luciferase usado para quantificar proteínas marcadas com luciferase. O ensaio usa uma enzima luciferase projetada composta por um grande fragmento que se liga ao pequeno fragmento, que é conjugado com uma proteína de interesse. As subunidades ligadas formam uma enzima ativa que, na presença do substrato, libera um sinal luminescente. Este sinal é então quantificado usando um luminômetro.

O ensaio de luciferase: um ensaio de alto rendimento para medir sinais luminescentes usando biorepórteres baseados em sistema de nanoluciferase projetados

Apresentamos um método de triagem rápida e de baixo custo para a identificação de reguladores de transcrição usando de alto rendimento transfections robóticos e um ensaio de luciferase dual-brilho caseiro. Este protocolo gera rapidamente dados funcionais diretos side-by-side para milhares de genes e é facilmente modificável para atingir qualquer gene de interesse.

De alta capacidade de Triagem funcional usando um caseiro Dual-brilho ensaio de luciferase

Apresenta-se no presente estudo, um ensaio baseado em fluorescência de novo utilizando linfócitos derivados de um ratinho transgénico. Este ensaio é adequado para rastreio de alto rendimento (HTS) de pequenas moléculas dotadas com a capacidade de qualquer inibição ou promoção da activação dos linfócitos.

A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

Aqui nós apresentamos um biossensor baseado em luciferase para quantificar a atividade da quinase do supressor do tumor grande (LATS)-uma quinase central no Hippo via de sinalização. Este biosensor tem diversas aplicações na pesquisa básica e translacional, visa investigar hipopótamo via reguladores in vitro e em vivo.

Monitoramento de hipopótamo, sinalizando o Pathway atividade usando um Tumor grande baseado em Luciferase supressor (LATS) Biosensor

Para identificar novos reguladores de fatores de transcrição, desenvolvemos uma abordagem para tela de bibliotecas RNAi lentivirais ou retrovirais usando um ensaio de repórter transcricional baseado em dupla luciferase. Esta abordagem oferece uma maneira rápida e relativamente barata de selecionar centenas de candidatos em um único experimento.

Identificação de reguladores de fatores de transcrição usando triagem de média-duração de bibliotecas arrayed e um repórter baseado em dupla-luciferase

Este protocolo descreve um método semi-automatizado para rastreios de drogas organoides de médio a alto rendimento e software de análise de imagem automatizado e agnóstico ao microscópio para quantificar e visualizar respostas multiparamétricas de drogas organoides únicas para capturar a heterogeneidade intratumoral.

Triagem de Drogas Organoides Tumorais Multiparamétricas Usando Imagem de Células Vivas de Campo Amplo para Análise a Granel e Organoide Único

Organoides tumorais derivados de pacientes são um sofisticado sistema modelo para pesquisa básica e translacional. Este artigo de métodos detalha o uso de imagens de células vivas fluorescentes multiplexadas para avaliação cinética simultânea de diferentes fenótipos organoides.

Imagem Multiplexada de Células Vivas para Respostas a Drogas em Modelos de Câncer Organoides Derivados de Pacientes

Um grande desafio do desenvolvimento de novas terapias para o câncer de pulmão inclui a modelagem do microambiente tumoral à medida que a doença regional progride para a doença metastática. Aqui, descrevemos um método simples de estabelecer um modelo singênico ortotópico de câncer de pulmão que permite o rastreamento in vivo da doença ao longo do tempo.

Um método minimamente invasivo para gerar um modelo ortotópico singênico de câncer de pulmão em camundongos

Aprenda a usar repórteres de luciferase multiplexados para analisar vias de sinalização P53, WNT e KRAS em células HCT116 de câncer colorretal. Este método permite interrogar funções gênicas em escala genômica de forma reprodutível e econômica.

A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas (Vídeo) | JoVE Journal

A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas

Explorar mais vídeos