A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas

O objetivo geral do protocolo a seguir é permitir a interrogação em escala genômica da função gênica, monitorando simultaneamente várias leituras celulares. Nesta demonstração, os repórteres baseados em Firefly RAN e Cipro Dina Luciferase são usados para monitorar a atividade da via P 53 WINT e KRAS, respectivamente. Esses três repórteres são seccionados com irna visando um gene de interesse em HCT one 16 células, uma linha celular de câncer colorretal.

Posteriormente, as atividades de vaga-lume e luciferase de baunilha são medidas nos lisados celulares enquanto a atividade da cipro DEA luciferase. Uma enzima secretada é medida na cultura. São obtidos resultados médios que mostram a reprodutibilidade do sistema de ensaio, bem como a capacidade de revelar ações compartilhadas e únicas de genes dentro dessas três vias relevantes para o câncer.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como microray ou multicolor pries, é que é uma maneira acessível, universal e econômica de olhar para as saídas celulares de transcrição. Este método pode ajudar a responder a perguntas na pesquisa do câncer, como o desenvolvimento de estratégias terapêuticas molecularmente direcionadas. Embora nosso protocolo de transfecção transitória esforce IL e compromisso mínimo de tempo inicial para configuração de tela, provavelmente aumentará a variabilidade do sinal de poço para poço, o que pode ser combatido observando as taxas de relatório em vez de olhar para falhas absolutas dos poços Para iniciar este procedimento, lave cinco placas quadradas de 10 centímetros de HCT confluente de 80 a 90% de 16 células com PBS e, em seguida, colha as células por tripsina para cada placa.

Use um mililitro de solução de tripsina seguido de neutralização com 10 mililitros de DMEM contendo 2% de FBS e 1% de penicilina. A estreptomicina transfere as células em suspensão para um tubo cônico de 50 mililitros e centrifuga a aproximadamente 130 G por cinco minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de meio.

Conte o número da célula com um contador de células e, em seguida, faça uma solução celular com 10 elevado à quinta células por mililitro. Mantenha 150 mililitros de suspensão celular para a próxima etapa usando uma placa dispensadora de líquido automatizada multigota. 100 microlitros ou 10 elevado à quarta célula em cada poço de uma placa de cultura de 96 poços.

A suspensão da célula, neste caso, deve ser suficiente para o revestimento 1296. As placas de poços incubam as placas com células a 37 graus Celsius em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono enquanto preparam a mistura de transfecção. O DNA de construção repórter de alta qualidade usado aqui foi isolado usando kits de preparação MIDI padrão e diluído para uma concentração final de um miligrama por mililitro.

Para cada repórter, prepare 100 microlitros de solução de estoque de construção de repórter combinando os seguintes 30 microlitros de P 53, FL 30 microlitros de oito X-T-C-F-R-L, 30 microlitros de alces um G quatro seis microlitros de U-A-S-C-L e quatro microlitros de H dois oh. Isso resultará em uma mistura de DNA com uma proporção final de um para um para um para 0,2 dos repórteres e uma concentração final de DNA de 0,3 miligramas por mililitro. Em seguida, prepare misturas de transfecção I-R-N-A-D-N-A suficientes para a transsecção 1296.

As placas de poço diluem 80 microlitros da solução de estoque de construção repórter em oito mililitros de tampão EC do kit de efeito QIAGEN para obter uma solução de DNA com uma concentração final de três microgramas por placa de mililitro. 20 microlitros da solução de DNA em cada poço de uma placa de PCR de 96 poços. O número de placas de 96 poços dependerá de quantas piscinas de irna serão testadas.

Por exemplo, neste caso, precisaremos de 4 placas de 96 poços para avaliar. 384 pools diferentes de SIR A usando um manipulador automatizado de líquidos de bioma transferem dois microlitros de cada cinco siRNA micromolar para o poço correspondente da placa de PCR contendo o estoque de DNA diluído. Em seguida, adicione um microlitro de solução intensificadora a cada poço da placa de siRNA de DNA.

Deixe a reação do intensificador ocorrer em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione três microlitros de reagente de transfecção a cada poço e incube em temperatura ambiente por mais 10 minutos. Para interromper a formação do complexo de transfecção, adicione 10 microlitros de DMEM contendo 2% de FBS e 1% de estreptomicina de penicilina a cada poço da placa de PCR.

Recupere as placas de 1296 poços contendo HCT 16 células da incubadora. Transfira 10 microlitros da mistura de transfecção para cada poço de uma placa de 96 poços contendo as células, pois cada transfecção será realizada em triplicata. A mesma mistura será aplicada a duas placas adicionais de 96 poços contendo células.

Incubar as células com misturas de transfecção a 37 graus Celsius em ambiente umidificado com 5% de dióxido de carbono por 36 horas. 36 horas após a transfecção das células. As atividades da luciferase estão prontas para medição.

Como este estudo incorpora vários repórteres, um secretado no meio de cultura e outros dois expressos no citoplasma da célula. As medições serão obtidas tanto do meio de cultura quanto de um lisado celular para detectar a atividade da Cipro Dina luciferase ou CL na cultura. Placa de réplica média.

20 microlitros de um meio de cultura para uma placa branca opaca de 96 poços. Usando a gota múltipla, adicione 20 microlitros de tampão de ensaio CL a cada poço. Em seguida, adicione 10 microlitros de Cipro Dina Lucifer e substrato a cada poço e detecte a atividade de CL usando um luminômetro para detectar as atividades de luciferase de vaga-lume e luciferase de baunilha, os lisados celulares devem primeiro ser feitos.

Remova o meio de cultura das células virando cada placa de cabeça para baixo e jogando o meio em uma pia. Remova o meio restante batendo suavemente na placa de cabeça para baixo em toalhas de papel. Adicione 30 microlitros de um tampão de lise passivo a cada poço de células.

Coloque as placas em um balancim de plataforma em velocidade média por cinco minutos em temperatura ambiente. Após cinco minutos, adicione 20 microlitros do reagente de ensaio de luciferase a cada poço de células e meça imediatamente a atividade da luciferase do vaga-lume usando o luminômetro. Em seguida, adicione o reagente de parada e brilho para extinguir a atividade da luciferase do vaga-lume e, em seguida, meça a atividade da luciferase.

Antes da multiplexação, a robustez das três diferentes plataformas de triagem foi avaliada individualmente. As linhagens celulares de câncer colorretal indicadas foram transfectadas com as oito construções repórter codificadoras XTCF, PP, 53 ta, Luke ou ALK, uma Firefly Luciferase, juntamente com pools de siRNAs direcionados a WINT, beta-catenina P 53 ou KAS, respectivamente. Os genótipos relevantes para cada linha celular são indicados.

A força de cada plataforma de triagem foi avaliada pela reprodutibilidade desses efeitos induzidos na via de transdução de sinal relevante. Conforme mostrado nesses resultados representativos, a betaína e os siRNAs não têm efeito sobre a atividade repórter de oito XTCF nas células RKO. Em contraste com DLD um e HCT um 16 células, que são respectivamente deficientes na via A PC, proteína supressora e expressam uma forma ativada de beca tenina.

Posteriormente, foi demonstrado que esses repórteres poderiam ser usados juntos para medições simultâneas da atividade gênica das vias de transdução de sinal de beta-catenina P 53 do vento e KRAS usando os pools IRNA indicados nesses gráficos. As atividades relativas da luciferase são mostradas no eixo Y e os siRNAs direcionados ao gene de interesse indicado são mostrados no eixo X. Por exemplo, um pool de siRNA direcionado à betacatenina reduz a atividade da via de betacatenina do vento, embora não afete significativamente as vias P 53 e KRA S.

Ao tentar desenvolver um sistema repórter multiplex, é importante otimizar a linha celular de interesse para a região de transfecção e a intenção do sinal repórter.