Name: Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência In Situ A hibridação em Saccharomyces cerevisiae (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Aprenda a técnica de hibridização in situ por fluorescência (FISH) para visualizar e quantificar moléculas de mRNA em células individuais de Saccharomyces cerevisiae. Este método permite analisar a localização e dinâmica transcricional em nível de molécula única.

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Esta pesquisa foi suportada por concessões GM046406 (a DB) e pelo Instituto Nacional de General Medical Sciences Center para Quantitative Biology (GM071508). RSM reconhece financiamento do NSF Graduate Research Fellowship. MNM é apoiado por um Lewis-Sigler Fellowship. Gostaríamos de agradecer os membros do laboratório Botstein para discussões úteis e ex-membros Allegra Petti e Nikolai Slavov por suas contribuições para o projeto ciclo metabólico. Agradecemos a Daniel Zenklusen e Robert Singer para obter nós começou com o método FISH.

Figuras 1 e 2 são esquemas dos procedimentos experimentais peixes e dutos de análise de imagem utilizado para quantificar as imagens dos peixes. 1. Soluções para preparar * As soluções abaixo são para uso com sondas cantor. Se estiver usando sondas Stellaris, substituir &quot;40% formamida&quot; com &quot;10% de formamida&quot; tanto Tampão de Hibridização e tampão de lavagem. Alterações adicionais Tampão de Hibridização quando utilizando sondas Stellaris são: (1) adicionar 1 g de sulfato de dextrano e (2) não incluem 10 mg ssDNA. Tampão B 8 ml de 1 M de KH 2 PO 4 41,5 ml de 1 M de K 2 HPO 4 109,3 g Sorbitol Tampão Spheroplasting 890 mL de buffer B VRC 100 mL 10 ul de 25.000 U / ml de liticase 2 ul β-mercaptoetanol &lt;strong&gt; tampão de hibridação (10 ml de volume final) 10 mg de E. coli tRNA 10 mg de ssDNA * 100 l mM estoque 200 VRC 40 ul de 50 mg / ml de BSA 1 ml de SSC 20X 4 ml de formamida a 40% * Nuclease de água livre (a 10 ml de volume final) 1 g de sulfato de dextrano * * Tampão de hibridização pode ser mantido em alíquotas de 0,5 ml a -20 ° C por conveniência. Tampão de Lavagem (50 ml de volume final) 5 ml de 20X SSC 20 ml de formamida a 40% * Nuclease de água livre (a 50 ml de volume final) Rotulagem de buffer 1,06 g de carbonato de sódio 100 ml de água DEPC pH 9 2. Sonda-rotulagem (Sondas Cantor Only) Nós obtemos estas sondas por síntese em casa usando um aparelho síntese de oligonucleotídeos ABI. Distróficoaliado, 4-5 ~ 50 pb são sintetizados oligonucleótidos que são homólogos ao gene de interesse, substituindo-alil-amino-timidina por vários thymidines espaçadas de pelo menos 8, de preferência de + 10 pb separadas. Por causa de sua sensibilidade ao ozônio, nós trabalhamos em uma instalação livre de ozono ao usar tinturas CY. <ol><li> Obter ~ 5 sondas e ressuspender em 100 mL de água - as concentrações de seleção na Nanodrop. </li><li> Dependendo de quantas sondas / gene, combine total de 10 mg / oligonucleotídeos gene (por exemplo, se tiverem 5 sondas / gene, então quero 2 mg / sonda). </li><li> Use colunas QIAquick para purificar as sondas de acordo com o Kit QIAquick Nucleotide remoção protocolo. </li><li> Adicionar 10 volumes de tampão PN ao volume total de sondas combinadas e misture. </li><li> Aplicar a amostra para a coluna QIAquick - se o volume total é superior a 750 mL, spin para baixo duas vezes com metade do volume em cada rodada </li><li> Deixe repousar por 1 min. </li><li> Centrifugar 1 min a 6000 rpm. </li><li> Lavar com 750 mL de tampão PE. </li><li> Centrifugador1 min a 6000 rpm. </li><li> Elimine o fluxo através da coluna e re-centrifugação durante 1 min a 13.000 rpm a secar. </li><li> Coluna QIAquick lugar no novo tubo de microcentrífuga e DNA eluir com 50 mL H 2 O - Certifique-se de H 2 O pH está dentro de 7.0 e 8.5 e é colocado diretamente na membrana. </li><li> Deixe repousar por 1 min. </li><li> Centrifugar durante 1 minuto a 13000 rpm, para eluir o DNA. </li><li> Liofiliza-se o ADN a 45 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento em 10 ul de tampão de marcação e adicionar ao tubo do corante sem tocar no corante. </li><li> Repita com outro buffer rotulagem 10 ml. </li><li> Vortex e spin para baixo tubo de tinta e DNA. </li><li> Cubra os tubos com papel alumínio e manter no escuro, a RT O / N para rotular. </li><li> Repita QIAquick Nucleotide Removal Kit protocolo. Execute com duas diferenças: - Adicionar 200 mL de tampão PN sondas e colocar sondas marcadas através de colunas de 2x. - Realizar três lavagens com tampão PE, a fim de lavar qualquer corante solto antes de eluição. </li><li> After eluição obter concentração via NanoDrop. A eficiência de marcação é tipicamente ~ 0,25 pmol / ng de ADN de cadeia simples. </li></ol> 3. Lamela Preparação <ol><li> Coloque lamelas em slides em Plasma-preen câmara de vácuo ( <a href="http://www.plasmapreen.com/" target="_blank">http://www.plasmapreen.com/</a> ) (o mais próximo do centro, melhor). </li><li> Coloque câmara de vácuo no microondas e verifique se ele está selado. </li><li> Ligue a bomba primeiro e depois ligar a bomba de vácuo apenas uma vez é iniciado. </li><li> Ligue o forno de microondas, e parar de 5 segundos após plasma é visível. </li><li> Desligue o vácuo depois da bomba. </li><li> Retire a câmara de vácuo e remover lamelas com uma pinça (aqueles que caíram precisam ser limpos novamente). </li><li> Lugar Lamelas lado limpo em placas de 12 poços. </li></ol> 4. Procedimento de fixação <ol><li> Levedura crescer a uma DO600 de cerca de 0,1-0,2 em meio mínimo. 10 ml de células produz suficiente for ~ 10 hibridações separadas. </li><li> Adicione 1/10 volume 37% de formaldeído diretamente para a mídia de crescimento (10 ml de cultura + 1 ml de 37% de formaldeído) e deixe descansar por 45 min. </li><li> Lavar 2x com 1 ml de tampão B gelado num tubo de microcentrífuga (pode girar a 13.000 rpm durante 1 min.) </li><li> Adicionar 1 ml de tampão spheroplasting. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 15 min. Confira as células a cada poucos minutos, sob microscópio até a maioria das células são negros (ou seja, não phase-brilhante). </li><li> Lavar 2x com tampão B gelado, girando a uma velocidade baixa (~ 3500 rpm). </li><li> Adicione 1 ml de EtOH a 70%, ressuspender cuidadosamente e deixar durante a noite a 4 ° C (pode armazenar indefinidamente a -20 ° C). </li></ol> 5. Procedimento de Hibridação <ol><li> Preparar a solução de hibridização: para 100 ul de tampão de hibridação, adicionar 1-3 mL de detecção, depois vórtice e centrifuga-se. Sondas Cantor usar 8-10 total de ng por conjunto da sonda (ou seja, por gene). Temos fotografada até três genes simultaneamente com três difsonda marcada rente define. </li></ol> Certifique-se de aquecer a solução de hibridização à temperatura ambiente antes de abri-lo. Para sondas Stellaris, recomenda-se iniciar quatro reacções de hibridação em separado pela adição de 1 ul de cada uma de 1:10, 1:20, 1:50 e 1:100 diluições de trabalho de sondas para ver qual é óptima. Diluições de trabalho de sondas Stellaris são preparadas em tampão de hibridação. <ol start="2"><li> Centrífuga (para todos os passos subsequentes, 3.500 rpm, 5 min) as células fixas (por exemplo, 200 ul) e aspirar para fora do etanol. </li><li> Suavemente ressuspender em 1 ml de tampão de lavagem que contém a mesma percentagem de formamida como tampão de hibridização. Deixe repousar por 2-5 min. </li><li> Centrifugar amostra e tampão de lavagem aspirado, em seguida, adicionar solução de hibridização. Incubar no escuro, com agitação suave, O / N a 37 ° C. </li></ol> Nota: o procedimento a seguir é para a aplicação de células / Imagem em lamelas. Para wcalcinação / células de imagens em placas de 96 poços, incluindo limpador solução alternativa espécies reativas de oxigênio ver <a href="http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols" target="_blank">http://www.biosearchtech.com/stellarisprotocols.</a> <ol start="5"><li> No dia seguinte, ou antes, limpo (ver procedimento) e tratar lamelas com 150 ul de 0,01% de poli-L-lisina, durante 5 min. Aspirar, deixe secar, lave 3x com dH 2 O e deixe secar. </li><li> Na manhã seguinte, adicionar 1 ml de tampão de lavagem para a amostra, ressuspender cuidadosamente, de centrifugação e aspiração, ressuspender em seguida mais 1 ml de tampão de lavagem e incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Lava-se com 2X SSC + 0,1% de Triton X-100 à temperatura ambiente no agitador de 15 min. </li><li> Tome meio de montagem de freezer para permitir que ele venha até RT antes da montagem. </li><li> Lava-se com 1X SSC a RT 15 min, em agitador. </li><li> Diluir DAPI em PBS (0,1 ug / ml final) e ressuspender as células em 150 ul. </li><li> Solução local para limpeza / poli-Lys-tesouroted tampa desliza na placa de 12 poços, de pelo menos 30 minutos sem ser perturbado. </li><li> Remova a solução (você pode colocá-lo em uma lamínula de reposição como um backup) e lavar 3x com 1 ml de 1X PBS. </li><li> Coloque 3 ml de prolongar meio de montagem de ouro em um slide (Invitrogen P36934). Faça isso um de cada vez se você tiver vários deslizamentos de cobertura para evitar a secagem do meio de montagem. </li><li> Adicionar ~ 0,5 ml de etanol a lamela na placa de 12 poços, remover a lâmina de cobertura e de ar seco, mantendo, com uma pinça. </li><li> Coloque a tampa do lado da cela de deslizamento para baixo em meio de montagem e deixar endurecer várias horas ou O / N no escuro. </li><li> Selar as bordas com unha polonês e proceder à imagem. </li></ol> 6. Imagem de células com Olympus IX-81 Visão geral microscópio invertido <ol><li> Para a aquisição de imagens que utilizam software Slidebook (inteligente-imaging.com) e 100X, 1,45 NA, objetivo petróleo TIRFM. Para a série GFP, DAPI, Cy3, Cy5 Cy3.5 e imagem: conjuntos de filtros Chroma (ver reagentes). </li><li> Use filtro DAPIpara encontrar e concentrar células. </li><li> Definir isso como ponto de referência. </li><li> Tome uma z-stack de imagens ao redor do ponto de referência onde a distância total é de 5 mm com tamanho de 0,2 mM (25 aviões). Repita para cada canal de corante (ou seja, conjunto de cada sonda). </li><li> Exportar como um TIFF de 16 bits para análise de imagem. </li></ol> 7. Resumo Análise de Imagem (Sondas cantor) Abaixo fornecemos um esboço de métodos computacionais que usamos para a análise de imagens de peixes em MATLAB. As funções do MATLAB relevantes utilizados estão entre colchetes à direita. Os algoritmos e limites estão ajustados para dados de sondas estilo cantor. Usando sondas estilo Stellaris exigirá algum ajustamento, particularmente para o passo final de filtragem (7.8). Identificação de células 15 <ol><li> Celas separadas de fundo usando um limiar global sobre DAPI imagens de 16 [graythresh]. </li><li> Identificar núcleos usando a função maxima estendida [imextendedmax]. </li><li> Células segmento usando núcleos como sementes para um algoritmo de watershed [divisor de águas]. </li></ol> Encontrar pontos em cada canal de fluorescência <ol start="4"><li> Executar a transformação cartola para normalizar fundo e melhorar a relação sinal-ruído [bwmorph]. </li><li> Encontrar máximos para identificar a camada de focagem (no plano z) para cada mancha [imregionalmax]. </li><li> Filtrar pontos potenciais usando um modelo de ajuste linear a um gradiente radial. </li></ol> Intensidade da mancha medida e sinais de filtro simples vs múltipla sonda <ol start="7"><li> Montar um perfil gaussiano 2D para o local na camada de focagem previamente identificados e intensidade de estimativa 17. </li><li> Filtrar os pontos fracos que utilizam um limiar (baseado em um histograma). Para o tipo de cantor sondas isso é importante, mas é menos para as sondas Stellaris. </li><li> Contagem de pontos em cada célula. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Até à data, FISH tem sido principalmente um método de baixo rendimento. O uso de Cy3, Cy3.5, Cy5 e corantes limita o número de genes pode-se investigar em células individuais ou três de cada vez. Algumas sondas adicionais têm sido desenvolvidos (Stellaris), mas o número de sondas distinguíveis é ainda, no máximo sete. Para ultrapassar esta limitação, as estratégias de rotulagem combinatórias usando vários fluoróforos têm sido usados ​​para criar os códigos de barras para as diferentes espécies de ARNm 19,20. Mais recentemente, Lubeck e Cai usado barcoding óptica e espectral para quantificar 32 espécies diferentes em simultâneo com FISH em células de levedura único 19. Uma das limitações dessa abordagem combinatória recente é que ele requer a utilização de microscopia de super-resolução. A análise necessária para distinguir as sondas de código de barras é também bastante complexa. Descobrimos que Cy3 e Cy3.5 são preferíveis para Cy5 para experiências de FISH. Uma das limitações do corante Cy5 é a sua sensibilidadea fotodegradação. No entanto, Stellaris desenvolveu recentemente Cy5 variantes que são anunciados como mais resistentes à fotodegradação, e pode aliviar este problema técnico. É importante notar também que o peixe é um método caro de implementar e que tanto o cantor e Stellaris sondas normalmente custam US $ 700 - US $ 1.000 por conjunto da sonda, embora os preços para sondas disponíveis no mercado devem diminuir no futuro. Poupadores de reagentes e rotulagem eficiente traz sondas cantor até a faixa mais baixa de preço. Um dos grandes desafios técnicos é a separação dos pontos de sonda única versus múltiplas, o que requer a implementação de sofisticados algoritmos de ponto-determinantes. Isso pode levar extensa revisão manual para ajustar os parâmetros de análise de imagem para montagens experimentais específicos. Um esboço de nosso pipeline computacional com funções MATLAB relevantes é fornecida na Seção 7 do protocolo. Esta questão é um pouco aliviado pelas sondas Stellaris que apenas têm<html> uma etiqueta por sonda. É, portanto, requer a co-localização de várias sondas para ver um sinal. Porque FISH requer a fixação de células, isso não facilitar o rastreamento de células individuais ao longo do tempo. Anteriormente, foram utilizados dados instantâneos peixe para reconstruir a dinâmica da expressão gênica em metabolicamente populações de leveduras de ciclismo individuais 6. Ciclismo metabólica é observada no pré-esfomeados, culturas contínuas, e é caracterizada por em toda a população oscilações coletivas no consumo de oxigênio. Essas oscilações estão associadas com o genoma de toda oscilações de transcrições que ocorrem por meio de todos os genes de leveduras em diferentes fases do consumo de oxigênio. Buscou-se determinar se ciclismo metabólica esteve presente em culturas de leveduras não sincronizadas contínuas. Se estiverem presentes, os transcritos que são anti-correlacionados em populações síncronas também deve ser anti-correlacionados em células individuais não sincronizadas, e vice-versa para as transcrições de correlacionadas. ent &quot;&gt; Para reconstruir dinâmica da produção de ARNm de tempo, os dados observados instantâneo deve ser comparado com o que é esperado a partir de um modelo de comportamento subjacente. existem limitações teóricas ao quando tais&quot; instantâneos &quot;de dados de expressão de genes podem ser usadas para determinar a dinâmica de expressão de genes subjacentes e que tipos de modelos podem ser distinguidos 21. Pelos dados do ciclo metabólicos, ao invés de mostrar diretamente a presença de oscilações temporais, medidas estatísticas foram implementadas para comprovar que realmente existe uma célula de programa oscilatório autônoma consistente com microarray massa medições.

Utilizando técnicas de medição de massa, não é possível ensaiar a quantidade de transcritos ou atividade transcricional dentro de células individuais 1. Usando proteínas fluorescentes dirigidos por promotores de interesse como repórteres de expressão do gene pode resolver este problema, em certa medida, mas o tempo necessário para as proteínas fluorescentes para dobrar obscurece dinâmica precoces. Proteínas fluorescentes de longa duração também não pode relatar vidas de mRNA. O método de peixe pode ser usado para ensaio de ARNm durante o seu ciclo de vida completo, desde o início da transcrição no núcleo para a maturação e posterior deterioração das células individuais, com a resolução de uma única molécula. O original experimentos in situ para a visualização de ácidos nucléicos utilizadas sondas de RNA radiomarcados para sondar elementos de DNA. Estes incluíram visualizando ADN ribossomal em ovários da rã Xenopus laevis e 2 de ADN em tecido de rato por satélite 3. O primeiro fluorescente in situ em experiment usada uma molécula de ARN marcado com um fluoróforo para sondar as sequências de ADN específicas 4. A primeira aplicação de sondas fluorescentes para a visualização de RNA in situ foi a visualização da expressão do gene de actina de galinha em cultura de tecido muscular 5. Mais recentemente, na levedura de brotamento, FISH tem sido utilizada para investigar as oscilações na transcrição durante o ciclo metabólico levedura 6, o decaimento do ARNm durante a progressão do ciclo celular 7, e localização espacial dos transcritos de ARNm durante a mitose 8. FISH tem sido utilizado em fermento para mostrar que as flutuações não correlacionadas em genes constitutivamente transcritos, que constituem mais de metade de todos os genes de levedura, surgem uncorrelated iniciação da transcrição 9. Nas espécies não-levedura, FISH foi usado para identificar os marcadores de células-tronco no intestino do rato 10 e para determinar que a penetrância incompleta dos destinos de células pode resultar de flutuações de expressão de genes em C. estocásticoselegans embriões 11. O método descrito aqui funciona FISH por hibridização marcados com corante, as sondas de ADN de cadeia simples com o ARNm mensagens. As células são fotografadas e os mRNAs são contadas usando um algoritmo local de detecção. Sondas de cadeia simples podem ser gerados com um sintetizador de ADN e, em seguida rotulado (aqui referida como sondas de Singer) ou ordenados comercialmente como sondas de pré-marcadas (Stellaris sondas) 12,13. Uma diferença importante entre o cantor e Stellaris sondas é que as sondas são mais Cantor (~ 50 pb), e são multi-rotulado, enquanto as sondas são curtas Stellaris (~ 20 pb), com apenas uma etiqueta por sonda, tal como descrito por Raj et al 14. Além disso, a abordagem Stellaris utiliza sondas por muitos mais genes do que a de Cantor (~ 30 contra 5 sondas por gene, respectivamente). Abaixo é proporcionado um protocolo que descreva o uso de qualquer tipo de sonda. Na seção 2, apresentamos um protocolo para a rotulagem de amino-alil sondas thymidine contendo wom um corante Cy escolhido. Uma visão geral dos passos computacionais necessários para identificar pontos de mRNA individuais é fornecida na Seção 7.

<table><tbody><tr><td>Complexo de Ribonucleosídeo Vanadil</td>: <td>NEB</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>, Liticase</td><td>Sigma</td><td>L5263</td><td></td></tr><tr><td>E. coli tRNA</td>, <td>Roche</td><td>1010954001</td><td></td></tr><tr><td>BSA (sem RNase)</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercapt&#8211; thanol</td><td>Fisher</td><td>03446l</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, dilactato</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10X (livre de RNase)</td> <td>Ambion</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Shelton Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulfato</td><td>Sigma</td><td>D6001</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Citrato de sódio-solução salina (SSC) 20X</td><td>VWR</td><td>82021-484</td><td></td></tr><tr><td>Formamida (deionizada)</td> <td>Ambion</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Alfa-D-glicose</td><td></td><td>Sigma 158968</td><td>para solução GLOX</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 8,0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicose oxidase</td><td>Sigma</td><td>G0543</td><td>Para solução</td></tr> <tr>GLOX<td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C3155</td><td>Para solução GLOX</td></tr><tr><td>Concanavalina A</td><td>MP Biomedicals</td><td>150710</td><td></td></tr><tr><td>Polilisina (0,01%)</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas</td> Warner <td>Instruments</td><td>Cs-18R15</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Montagem Média</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de Remoção de Nucleotídeos</td><td>QIAGEN</td><td>28304</td><td></td></tr><tr><td>Sondas FISH</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>Pedido personalizado para a sequência de mRNA desejada</td></tr><tr><td>Placas de 96 poços com fundo de vidro</td><td>Nunc</td><td>265300</td><td>Alternativa às lamínulas</td></tr><tr><td>Placas de 12 poços</td><td>BD Falcon</td><td>351143</td><td></td></tr><tr><td>Cy3, Cy3.5, Cy5 corantes</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>monofuncional NHS-ester</td></tr><tr><td colspan="4"> EQUIPAMENTO</td></tr><tr><td>Plasma-Preen I Cleaner</td><td>Terra Universal</td><td>9505-00</td><td>Controller (Cat #9505-17 opcional)</td></tr><tr><td>Bomba de vácuo</td><td>Alcatel</td><td>205SDMLAM</td> Para operar o microscópio de fluorescência de campo amplo <td>Plasma-Preen</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>Ou</td></tr><tr><td>equivalente 100X objetiva</td><td>Olympus</td><td>1-UB617R</td><td></td></tr><tr><td>Fonte</td> <td>de luzX-Cite</td><td>XCT 10-A</td><td>ou conjuntos</td>de</tr><tr><td>filtros equivalentes</td><td>Chroma</td><td>U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR, U-NSP104V2-SPR.</td><td></td></tr><tr><td>Cooled CCD ou EMCCD Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C4742-98-24ER</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização e análise de moléculas de mrna usando fluorescência<em&gt; in situ</em&gt; a hibridação em<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

A hibridação in situ fluorescente (FISH), o método permite a detecção de ácidos nucleicos no ambiente celular nativo. Aqui nós fornecemos um protocolo para a utilização de FISH para quantificar a quantidade de ARNm em células de levedura individuais. As células podem ser cultivadas em qualquer condição de interesse e, em seguida, fixado e tornado permeável. Posteriormente, vários deoxyoligonucleotides single-stranded conjugado com corantes fluorescentes são usados ​​para rotular e visualizar mRNAs. Difracção de fluorescência limitada a partir de moléculas de mRNA individuais é quantificada utilizando um algoritmo de detecção de ponto de identificar e contar o número de mRNAs por célula. Enquanto os métodos de quantificação mais padrão de manchas de Northern, RT-PCR e microarrays de expressão do gene de informação sobre os mRNAs da população média em grandes quantidades, PEIXE facilita tanto a contagem e localização destes ARNm em células individuais com uma resolução de uma única molécula.

A figura 3 mostra histogramas típicos calculado a partir de imagens FISH e utilizada para determinar a quantidade de ARNm presente nas células individuais. Uma vantagem importante da microscopia baseado quantificação de ARN é que se pode obter informação sobre a localização de transcritos. Por exemplo, foi utilizado para identificar mRNAs FISH em células individuais com uma indutível CBF1 alelo (Figura 4). Como muitas moléculas de mRNA estão presentes no local da transcrição, que são capazes de identificar a presença e localização de sítios de transcrição no núcleo. Através da utilização de diferentes corantes de etiquetas de mRNAs de genes diferentes, pode-se quantificar a múltiplas espécies de mRNA nas mesmas células. Para demonstrar isto, as células de levedura foram incubadas na presença de factor-α e sorbitol. FUS1 transcrição (corante Quasar670, vermelho) é induzida por α-fator. Transcrição STL1 (tintura 570 Quasar, verde) é induzida pelo aumento da osmolaridade extracelular ( <strong&gt; Figura 5). Figura 4 é um exemplo de FISH com as sondas cantor. Figura 5 é um exemplo de FISH com as sondas Stellaris. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de procedimento experimental FISH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50382/50382fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig2.jpg" /> Figura 2. Esquemático do gasoduto de análise de imagem. Os pontos finais são determinados na figura da direita. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig3.jpg" /> Figura 3. Histograma de intensidades local para um gene em particular usando sondas cantor </strong&gt;. Intensidades de sonda são computados dentro (vermelho) e fora das células (azuis). Pontos de baixa intensidade são ou ruído ou sondas individuais. Mensagens de mRNA reais são rotulados com várias sondas. Ao usar sondas Stellaris, sondas individuais são menos detectáveis ​​e, portanto, os limites e filtragem deve ser ajustada em conformidade. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig4.jpg" /> Figura 4. Os resultados representativos do procedimento FISH cantor. Nesta experiência, CBF1 transcrição é activada com um promotor indutível 18. Núcleos estão manchadas azul com DAPI. CBF1 mRNAs são marcados com sondas Cy3-marcadas. As setas brancas, evidenciar a presença de CBF1 sítios de transcrição no núcleo. Transcritos de mRNA individuais são visíveis no citoplasma. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50382/50382fig5.jpg" /> Figura 5. Os resultados representativos do procedimento FISH Stellaris. As células de levedura foram expostas simultaneamente Mata a 30 ng / ml de factor-α e 0,75 M de sorbitol durante 10 minutos e, simultaneamente, foram sondadas para FUS1 (Quasar 670, vermelho) e STL1 (Quasar 570, verde) transcrições. Na caixa de destaque, podemos ver uma célula responder apenas ao feromônio (FUS1 local de início, vermelho) e outro predominantemente respondendo ao sorbitol (local de início STL1, verde).

Este protocolo descreve o procedimento experimental para a realização de Fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH) para a contagem de mRNAs em células individuais em resolução de uma única molécula.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar a presença de moléculas de mRNA com especificidade de única molécula em células individuais de levedura. Primeiro, fixe as células de levedura com tampão contendo formaldeído e lisase. Permeabilize as células até que a maioria das células não apresente brilho em fase.Em seguida, incube as células permeabilizadas com moléculas de DNA simples fita marcadas com fluoróforo e, depois, monte as células em uma lamínula limpa com plasma. Em última análise, os resultados obtidos por microscopia de fluorescência podem detalhar a presença e a localização de moléculas de mRNA em células individuais. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como expressão gênica, microarranjos e northern blot, é que os mRNA individuais podem ser visualizados em células isoladas.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da transcrição. Isso inclui quantificar o número de RNAs da região do braço por célula em uma população, o que pode informar modelos de regulação no nível do promotor. Também pode ser utilizado para determinar a localização e as meias-vidas dos transcritos durante o ciclo celular.Em uma câmara de vácuo de plasma, posicione lamínulas sobre as lâminas. Em seguida, coloque a câmara de vácuo em um micro-ondas e certifique-se de que esteja vedada. Ligue a bomba assim que o funcionamento da bomba for iniciado.Ligue a bomba de vácuo, agora ligue o micro-ondas e pare cinco segundos após o plasma se tornar visível. Em seguida, desligue o vácuo, seguido pela bomba. Retire a câmara de vácuo.Em seguida, transfira as lamínulas com o lado limpo voltado para cima para placas de 12 poços. Cultive as leveduras até uma A600 de aproximadamente 0,1 a 0,2 em meio mínimo. 10 mL de células fornecem quantidade suficiente para cerca de 10 hibridizações.Adicione um décimo do volume de formaldeído a 37% diretamente ao meio de cultura e incube à temperatura ambiente por 45 minutos. Centrifugue as células a 3000 Gs por cinco minutos. Re-suspenda o pellet em um mililitro do tampão B e transfira para um tubo de microcentrífuga.Lave duas vezes com um mililitro de tampão B gelado em um tubo de microcentrífuga. Centrifugue a 13.000 RPM por um minuto. Em seguida, adicione um mililitro de placa esférica, tamponado e incube a 37 graus Celsius por 15 minutos.Monitore as células microscopicamente a cada poucos minutos até que a maioria das células fique preta. Em seguida, lave duas vezes com tampão gelado. B.Girando em baixa velocidade de 3.500 RPM.Adicione um mililitro de etanol 70%. Suspenda suavemente o pellet e deixe overnight a quatro graus Celsius ou armazene indefinidamente a menos 20 graus Celsius. Para preparar a solução de hibridização, adicione um a três microlitros de sonda ao tampão de hibridização de 100 microlitros.Em seguida, agite em vórtex e centrifugue. Imagens de três genes diferentes foram obtidas simultaneamente utilizando três conjuntos diferentes de sondas. Agora, centrifugue a amostra de levedura fixada e remova o tampão de lavagem por aspiração.Adicione a solução de hibridização e incube no escuro com agitação suave durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte. Trate as lamínulas limpas com 150 microlitros de polilisina a 0,01% durante cinco minutos. Em seguida, aspire e seque ao ar.Lave as lâminas três vezes com água destilada e deixe secar ao ar após uma lavagem com um XSSC Resus, ressuspender as células em 150 microlitros de 0,1 microgramas por mililitro. Prepare recentemente uma alíquota da coloração dappy na suspensão celular e coloque sobre lamínulas tratadas com polilisina, incubando por 30 minutos. Em seguida, descongele o meio de montagem ProLong Gold até a temperatura ambiente.Coloque três microlitros em uma lâmina. Em seguida, adicione cerca de 0,5 mililitros de etanol a uma lamínula. Na placa de 12 poços, remova a lamínula e seque ao ar, segurando-a com pinça.Coloque a lamínula com o lado das células voltado para baixo sobre o meio de montagem e deixe endurecer por várias horas ou durante a noite no escuro. Selle as bordas com esmalte e prossiga para a aquisição de imagens. Capture uma série de imagens ao redor do ponto de referência, abrangendo uma distância total de cinco micrômetros com incrementos de 0,2 micrômetro.Repita a aquisição de imagens para cada canal de corante correspondente a cada conjunto de sondas. Em seguida, prossiga conforme detalhado no texto acompanhante. Para identificar as células por segmentação de linha de nível, identifique os pontos usando um gradiente radial e meça os pontos utilizando um ajuste gaussiano.Normalmente, histogramas são calculados a partir de imagens de FISH e utilizados para determinar o número de RNAm presentes em células individuais. Uma vantagem importante da quantificação de RNA baseada em microscopia é que se pode obter informações sobre a localização dos transcritos. Por exemplo, este FISH utiliza sondas individuais para identificar RNAm em células isoladas com um alelo CCB CBF indutível.Como muitas moléculas de mRNA estão presentes no local da transcrição, é fácil identificar a presença e localização dos sítios de transcrição dentro do núcleo. A utilização de corantes diferentes para marcar os mRNA de diferentes genes facilita a quantificação de múltiplas espécies de mRNA nas mesmas células. Neste experimento, células de levedura foram incubadas na presença de fator alfa e sorbitol. Utilizando fish com as sondas Stelara, os dados mostram uma célula respondendo apenas ao feromônio, indicado por um sítio de início FUS vermelho.Simultaneamente, outra célula está predominantemente respondendo ao sorbitol, onde o sítio inicial de S TL é marcado em verde. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como marcar e visualizar moléculas individuais de mRNA em levedura. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada corretamente em dois dias.Lembre-se de ter uma concentração suficientemente densa de células. Amostras diluídas exigem que mais campos sejam imageados e armazenados.

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Research

JoVE Journal

Biology

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