Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência In Situ A hibridação em Saccharomyces cerevisiae

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar a presença de moléculas de mRNA com especificidade de molécula única em células de levedura únicas. Primeiro, fixe as células de levedura e o formaldeído usando tampão contendo liase. Permeável as células até que a maioria das células não esteja em fase brilhante.

Em seguida, incube as células permanentes com moléculas de DNA de fita simples marcadas com fluorescência e, em seguida, monte as células em uma lamínula limpa de plasma. Em última análise, os resultados obtidos por microscopia de fluorescência podem detalhar a presença e localização de moléculas de mRNA em células individuais. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como expressão gênica, microarrays e northern blots, é que os mRNAs individuais podem ser visualizados em células únicas.

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da transcrição. Isso inclui quantificar o número de RNAs de braço por célula em uma população que pode informar modelos de regulação no nível do promotor. Também pode ser usado para determinar a localização e meias-vidas dos transcritos durante o ciclo celular.

Em uma posição de câmara de vácuo de preen de plasma, a tampa desliza nas lâminas. Em seguida, coloque a câmara de vácuo no micro-ondas e certifique-se de que esteja selada. Ligue a bomba assim que a bomba for iniciada.

Ligue o aspirador, agora ligue o micro-ondas e pare cinco segundos depois que o plasma estiver visível. Em seguida, desligue o aspirador, seguido da bomba. Puxe a câmara de vácuo.

Em seguida, transfira as lamínulas com o lado limpo para cima em 12. As placas de poço aumentam a levedura para um A 600 de cerca de 0,1 a 0,2. Em meios mínimos, 10 mils de células produzem o suficiente para cerca de 10 hibridização.

Adicione um décimo volume de formaldeído a 37% diretamente ao meio de crescimento e incube em temperatura ambiente por 45 minutos. Centrifugar as células a 3000 Gs durante cinco minutos. Suspenda novamente o pellet em um mililitro de tampão B e transfira para um tubo de microcentrífuga.

Lave duas vezes com um mililitro de tampão gelado B em um tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 13 000 rpm durante um minuto. Em seguida, adicione um mililitro de revestimento de sphero, tampone e incube a 37 graus Celsius por 15 minutos.

Monitore as células microscopicamente a cada poucos minutos até que a maioria das células esteja preta. Em seguida, lave duas vezes com tampão gelado. B. Girando a uma velocidade baixa de 3, 500 RPM.

Adicione um mililitro de 70% de etanol resus. Suspenda o pellet suavemente e coloque durante a noite a quatro graus Celsius ou armazene indefinidamente a menos 20 graus Celsius. Para preparar a solução de hibridização, adicione um a três microlitros de sonda a 100 microlitros de tampão de hibridização.

Em seguida, vórtice e centrífuga. Visualizamos três genes diferentes simultaneamente usando três conjuntos de sondas diferentes. Agora centrifugue, a amostra de fermento fixada e aspire o tampão de lavagem.

Adicione a solução de hibridização e incube no escuro com agitação suave durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte. Trate os lábios de cobertura limpos com 150 microlitros de 0,01% de polilisina por cinco minutos. Em seguida, aspire e seque ao ar.

As lâminas lavam três vezes com água destilada e secam ao ar após uma lavagem com um XSSC Resus, suspendem as células em 150 microlitros de 0,1 microgramas por mililitro. Mancha dappy recém-preparada, uma alíquota da suspensão celular nas lamínulas tratadas com polilisina e incube por 30 minutos. Em seguida, descongele o meio de montagem de ouro prolongado à temperatura ambiente.

Coloque três microlitros em uma lâmina. Em seguida, adicione cerca de 0,5 mililitros de etanol a uma lamínula. Na placa de 12 poços, remova a lamínula e seque ao ar enquanto segura com uma pinça.

Coloque a célula de lamínula voltada para baixo no meio de montagem e deixe-a endurecer por várias horas ou durante a noite no escuro. Sele as bordas com esmalte e prossiga para a imagem. Tire um Zack de imagens ao redor do ponto de referência, onde a distância total é de cinco micrômetros com tamanho de 0,2 micrômetro.

Repita a imagem para cada canal de corante correspondente a cada conjunto de sonda. Em seguida, proceda conforme detalhado no texto que acompanha o texto. Para identificar as células por segmentação de bacias hidrográficas, identifique as manchas usando um gradiente radial e meça as manchas usando um ajuste gaussiano.

Normalmente, os histogramas são calculados a partir de imagens de peixes e usados para determinar o número de mRNAs presentes em células individuais. Uma vantagem importante da quantificação de RNA baseada em microscopia é que se pode obter informações sobre a localização dos transcritos. Por exemplo, este peixe usa sondas únicas para identificar mRNAs em células únicas com um alelo CCB CBF induzível um.

Como muitas moléculas de mRNA estão presentes no local da transcrição, é fácil identificar a presença e a localização dos locais de transcrição dentro do núcleo. A utilização de diferentes corantes para marcar mRNAs de diferentes genes facilita a quantificação de várias espécies de mRNA nas mesmas células. Neste experimento, células de levedura foram incubadas na presença de fator alfa e sorbitol Usando peixes com as sondas Stelara, os dados mostram uma célula respondendo apenas ao feromônio indicado por um local de início FUS vermelho.

Simultaneamente, outra célula está respondendo predominantemente ao sorbitol, onde o local inicial do S TL um é rotulado em verde. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rotular e visualizar moléculas únicas de mRNA em levedura Uma vez dominado. Esta técnica pode ser realizada corretamente em dois dias.

Lembre-se de ter uma concentração suficientemente densa de células. Amostras diluídas requerem mais campos para serem fotografadas e armazenadas.