Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência
14 de junho de 2013
Este protocolo descreve o procedimento experimental para a realização de Fluorescência In situ Hybridization (FISH) para a contagem de mRNAs em células individuais em resolução de uma única molécula.
O objetivo geral do experimento a seguir é detectar a presença de moléculas de mRNA com especificidade de única molécula em células individuais de levedura. Primeiro, fixe as células de levedura com tampão contendo formaldeído e lisase. Permeabilize as células até que a maioria das células não apresente brilho em fase.
Em seguida, incube as células permeabilizadas com moléculas de DNA simples fita marcadas com fluoróforo e, depois, monte as células em uma lamínula limpa com plasma. Em última análise, os resultados obtidos por microscopia de fluorescência podem detalhar a presença e a localização de moléculas de mRNA em células individuais. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como expressão gênica, microarranjos e northern blot, é que os mRNA individuais podem ser visualizados em células isoladas.
Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da transcrição. Isso inclui quantificar o número de RNAs da região do braço por célula em uma população, o que pode informar modelos de regulação no nível do promotor. Também pode ser utilizado para determinar a localização e as meias-vidas dos transcritos durante o ciclo celular.
Em uma câmara de vácuo de plasma, posicione lamínulas sobre as lâminas. Em seguida, coloque a câmara de vácuo em um micro-ondas e certifique-se de que esteja vedada. Ligue a bomba assim que o funcionamento da bomba for iniciado.
Ligue a bomba de vácuo, agora ligue o micro-ondas e pare cinco segundos após o plasma se tornar visível. Em seguida, desligue o vácuo, seguido pela bomba. Retire a câmara de vácuo.
Em seguida, transfira as lamínulas com o lado limpo voltado para cima para placas de 12 poços. Cultive as leveduras até uma A600 de aproximadamente 0,1 a 0,2 em meio mínimo. 10 mL de células fornecem quantidade suficiente para cerca de 10 hibridizações.
Adicione um décimo do volume de formaldeído a 37% diretamente ao meio de cultura e incube à temperatura ambiente por 45 minutos. Centrifugue as células a 3000 Gs por cinco minutos. Re-suspenda o pellet em um mililitro do tampão B e transfira para um tubo de microcentrífuga.
Lave duas vezes com um mililitro de tampão B gelado em um tubo de microcentrífuga. Centrifugue a 13.000 RPM por um minuto. Em seguida, adicione um mililitro de placa esférica, tamponado e incube a 37 graus Celsius por 15 minutos.
Monitore as células microscopicamente a cada poucos minutos até que a maioria das células fique preta. Em seguida, lave duas vezes com tampão gelado. B.Girando em baixa velocidade de 3.500 RPM.
Adicione um mililitro de etanol 70%. Suspenda suavemente o pellet e deixe overnight a quatro graus Celsius ou armazene indefinidamente a menos 20 graus Celsius. Para preparar a solução de hibridização, adicione um a três microlitros de sonda ao tampão de hibridização de 100 microlitros.
Em seguida, agite em vórtex e centrifugue. Imagens de três genes diferentes foram obtidas simultaneamente utilizando três conjuntos diferentes de sondas. Agora, centrifugue a amostra de levedura fixada e remova o tampão de lavagem por aspiração.
Adicione a solução de hibridização e incube no escuro com agitação suave durante a noite a 37 graus Celsius no dia seguinte. Trate as lamínulas limpas com 150 microlitros de polilisina a 0,01% durante cinco minutos. Em seguida, aspire e seque ao ar.
Lave as lâminas três vezes com água destilada e deixe secar ao ar após uma lavagem com um XSSC Resus, ressuspender as células em 150 microlitros de 0,1 microgramas por mililitro. Prepare recentemente uma alíquota da coloração dappy na suspensão celular e coloque sobre lamínulas tratadas com polilisina, incubando por 30 minutos. Em seguida, descongele o meio de montagem ProLong Gold até a temperatura ambiente.
Coloque três microlitros em uma lâmina. Em seguida, adicione cerca de 0,5 mililitros de etanol a uma lamínula. Na placa de 12 poços, remova a lamínula e seque ao ar, segurando-a com pinça.
Coloque a lamínula com o lado das células voltado para baixo sobre o meio de montagem e deixe endurecer por várias horas ou durante a noite no escuro. Selle as bordas com esmalte e prossiga para a aquisição de imagens. Capture uma série de imagens ao redor do ponto de referência, abrangendo uma distância total de cinco micrômetros com incrementos de 0,2 micrômetro.
Repita a aquisição de imagens para cada canal de corante correspondente a cada conjunto de sondas. Em seguida, prossiga conforme detalhado no texto acompanhante. Para identificar as células por segmentação de linha de nível, identifique os pontos usando um gradiente radial e meça os pontos utilizando um ajuste gaussiano.
Normalmente, histogramas são calculados a partir de imagens de FISH e utilizados para determinar o número de RNAm presentes em células individuais. Uma vantagem importante da quantificação de RNA baseada em microscopia é que se pode obter informações sobre a localização dos transcritos. Por exemplo, este FISH utiliza sondas individuais para identificar RNAm em células isoladas com um alelo CCB CBF indutível.
Como muitas moléculas de mRNA estão presentes no local da transcrição, é fácil identificar a presença e localização dos sítios de transcrição dentro do núcleo. A utilização de corantes diferentes para marcar os mRNA de diferentes genes facilita a quantificação de múltiplas espécies de mRNA nas mesmas células. Neste experimento, células de levedura foram incubadas na presença de fator alfa e sorbitol. Utilizando fish com as sondas Stelara, os dados mostram uma célula respondendo apenas ao feromônio, indicado por um sítio de início FUS vermelho.
Simultaneamente, outra célula está predominantemente respondendo ao sorbitol, onde o sítio inicial de S TL é marcado em verde. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como marcar e visualizar moléculas individuais de mRNA em levedura. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada corretamente em dois dias.
Lembre-se de ter uma concentração suficientemente densa de células. Amostras diluídas exigem que mais campos sejam imageados e armazenados.
Visão Geral
Este protocolo descreve um procedimento experimental para realização da hibridização in situ por fluorescência (FISH) para contagem de RNAm em células individuais com resolução de única molécula. O método permite a visualização de moléculas individuais de RNAm em células de levedura, fornecendo insights sobre a regulação da transcrição e o posicionamento dos transcritos.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Expressão Gênica
Antecedentes
- A hibridização fluorescente in situ (FISH) permite a detecção de mRNA com resolução de única molécula.
- Esta técnica supera métodos tradicionais como microarranjos e blotting northern ao visualizar moléculas individuais de mRNA.
- Compreender a localização e quantificação de mRNA é essencial para estudar a dinâmica da transcrição.
- Células de levedura servem como organismo modelo para esses experimentos.
Objetivo do Estudo
- Detectar e quantificar moléculas de mRNA em células individuais de levedura.
- Investigar a localização e os tempos de meia-vida dos transcritos durante o ciclo celular.
- Aprimorar a compreensão da regulação da transcrição no nível do promotor.
Métodos Utilizados
- Fixação de células de levedura utilizando formaldeído e tampão lyase.
- Permeabilização das células para acesso da sonda.
- Hibridização com sondas de DNA marcadas com fluoróforo.
- Imageamento por microscopia para visualizar e quantificar a localização de mRNA.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida de moléculas individuais de mRNA em células de levedura.
- Quantificação de espécies de mRNA em resposta a diferentes estímulos.
- Identificação de sítios de transcrição dentro do núcleo.
- Demonstração da capacidade da técnica em analisar simultaneamente múltiplas espécies de mRNA.
Conclusões
- A FISH fornece uma ferramenta poderosa para estudar a dinâmica de mRNA em células individuais.
- O método pode ser concluído em dois dias com a técnica adequada.
- Compreender a localização e a quantidade de mRNA pode auxiliar na elaboração de modelos de regulação gênica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A visualização de mRNA em nível de molécula única permite a quantificação precisa e o mapeamento espacial da dinâmica de transcritos, superando as limitações dos ensaios em populações agregadas na validação de alvos. Essa abordagem contribui para a redução de riscos mecanicistas ao revelar a heterogeneidade na expressão gênica, o que aumenta a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta. A aplicação em modelos de levedura fornece um sistema escalonável e geneticamente manipulável para o desenvolvimento de ensaios e investigação de vias antes da transposição para sistemas mamíferos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da heterogeneidade transcricional e da regulação ao nível do promotor em nível de célula única.
- Valor Operacional: Oferece visualização direta de moléculas de mRNA para esclarecer o engajamento funcional do alvo.
- Valor Científico: Apoia a desmistificação biológica ao associar a localização do transcrito ao fenótipo celular e à atividade da via.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera contagens quantitativas e resolvidas espacialmente de mRNA por célula para padronização de ensaios.
- Valor Operacional: Facilita a detecção multiplexada de múltiplas espécies de mRNA utilizando sondas fluorescentes distintas.
- Valor Científico: Permite a preparação de sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho de triagem de compostos em etapas subsequentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona a localização e as medidas de meia-vida do mRNA à estabilidade do transcrito e à regulação do ciclo celular.
- Valor Operacional: Apoia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica por meio de mecanismos transcricionais conservados.
- Valor Estratégico: Informa decisões de avanço ajustadas ao risco ao vincular a dinâmica transcricional de células individuais a resultados funcionais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método atua nas fases iniciais da descoberta, apoiando a verificação de hipóteses e a clarificação de vias antes da identificação de compostos líderes, utilizando levedura como um sistema relevante para doenças, a fim de obter insights mecanicistas.
- Biologia da Descoberta: Permite testar hipóteses sobre regulação transcricional e esclarecer vias com resolução de única molécula.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas prontas para ensaios e reprodutíveis para avaliação do efeito de compostos.
- Análises: Oferece detecção de pontos e medidas de ajuste gaussiano para quantificar e comparar a abundância de mRNA entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio de princípios conservados de localização e meia-vida do mRNA em sistemas eucarióticos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para análise multiplexada de transcritos em diversas condições experimentais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva por meio da observação direta da dinâmica do mRNA e redução da ambiguidade mecanicista em modelos de regulação gênica.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio da permeabilização de células fixadas e hibridização padronizada de sondas.
- Valor Estratégico: Decisões mais precisas de prosseguir ou interromper experimentos ao associar contagens de transcritos em nível de célula única a respostas fenotípicas em campanhas de triagem.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco com base em dados quantitativos e com resolução espacial de mRNA obtidos de populações isogênicas de levedura.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em microscopia de fluorescência, protocolos de fixação e hibridização de ácidos nucleicos.
- Depende de sistemas de imagem confocal ou de campo amplo com algoritmos de detecção de pontos para quantificação de moléculas individuais.
- Necessita padronização entre equipes no design de sondas, condições de hibridização e fluxos de análise de imagens.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes cepas de levedura, condições de crescimento e níveis de abundância de mRNA-alvo.
- Inclui limitações práticas relacionadas à acessibilidade do transcrito, eficiência de penetração da sonda e sinal de fundo em células fixadas.
