Name: Análise de Proteína Viral alvejado Nanopartículas entregue para tumores HER2 + (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Aprenda a analisar a entrega sistêmica de nanopartículas HerDox em tumores HER2+ usando imagem óptica multimodal. Este método demonstra alvo e penetração quantificáveis em células tumorais.

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Este trabalho foi financiado por subvenções a LKM-K dos Institutos Nacionais de Saúde / Instituto Nacional do Câncer (R01CA129822 e R01CA140995). Dr. Medina-Kauwe graças C. Rey, M. M-Kauwe e D. Revetto para apoio contínuo.

1. Entrega sistêmica In vivo <ol><li> Misturar suficiente Herdox com solução salina estéril para equiparar 0,2 ml de uma dose de 0,004 mg / kg de Herdox por injecção durante 6-8 semanas de idade nu / nu rato rolamento tumores subcutâneos bilaterais xenoenxerto flanco. </li><li> Suavemente Herdox desenhar a mistura para uma seringa de insulina 3/10 cc com uma agulha 29G, evitando bolhas. </li><li> A anestesia é induzida por exposição breve isoflurano numa câmara de indução equipado com um sistema de limpeza de gás (taxa de fluxo de oxigénio: 0,5-1 l / min, concentração de isoflurano: 3-4% (ou inferior). </li><li> Injectar a mistura total na veia da cauda de um rato anestesiado (0,2 ml por injecção). Injecção IV também pode ser realizada em um contido, rato não anestesiados. </li><li> Repetir a injecção no mesmo rato para mais seis dias seqüenciais, uma vez por dia. </li></ol> 2. Imagens de fluorescência in vivo O acúmulo de Herdox fluorescência em tumores podeser detectáveis ​​até ao último dia da injecção (Dia 7), utilizando um gerador de imagens multimodo. Os procedimentos abaixo implica a utilização de uma macro-sistema de iluminação e de detecção de personalização (Figura 1) 8. <ol><li> Ligue o multimodo In vivo Imager Optical. </li><li> Escolha um filtro passa-banda de emissão (590 nm ± 30 nm) adequado para a detecção de fluorescência doxorrubicina. </li><li> Ligue Argon-Krypton laser e colocar um filtro passa-banda de excitação (488 nm ± 10 nm) no caminho óptico laser. </li><li> Ligue o sistema de anestesia e em seguida, coloque o mouse na câmara de anestesiante (taxas de fluxo de oxigênio: 0,5-1 L / min, concentração de isoflurano: 3-4% (ou inferior), equipados com um sistema de limpeza de gás. </li><li> Transferir o mouse da câmara de anestesiar à câmara de imagem do multimodo In vivo Imager Optical quando o mouse está anestesiado. </li><li> Coloque um nosecone sobre o nariz do mouse e abrir o fluxo de administrar anestesia contínuasia durante a aquisição de imagem (taxa de fluxo de oxigênio: 0,5-1 L / min, a concentração de isoflurano: 2-3% (ou inferior). </li><li> Adquirir imagens de fluorescência utilizando um tempo de exposição de 5-15 seg. </li><li> Realizar a análise de imagem e processamento, incluindo correção de fundo ou ajuste de contraste. </li></ol> 3. Imagem de Fluorescência ex vivo Herdox fluorescência pode ser trabalhada em tumores e órgãos específicos (incluindo o fígado, rim, baço, coração e músculo esquelético), colhidas a partir de ratinhos sacrificados às 24 horas após a última injecção (7 dias) de Herdox. <ol><li> Ligue o multimodo In vivo Imager Optical. </li><li> Escolha um filtro passa-banda de emissão (580 nm ± 20 nm) para detecção de fluorescência doxorrubicina. </li><li> Ligue Argon-Krypton laser e colocar um filtro passa-banda de excitação (488 nm ± 10 nm) no caminho óptico laser. </li><li> Tumores lugar e órgãos específicos dispostos em uma placa de Petri para a imagem da câmara of o multimodo Em Imager Optical vivo. </li><li> Adquirir imagens de fluorescência de tecidos, utilizando um tempo de exposição de 5-15 seg. Um exemplo de aquisição da imagem de fluorescência inicial é mostrado na figura 2a. Repita o mesmo usando uma placa de Petri vazia, que servirá como pano de fundo (Figura 2b). </li><li> Realizar a análise de imagem e processamento, incluindo correção de fundo ou ajuste de contraste. Um exemplo de uma imagem corrigida é mostrado na Figura 2c, resultante da subtração da Figura 2b a partir da Figura 2a. </li></ol> 4. In situ imagem confocal de Tumores Na imagem confocal situ permite a detecção e análise da acumulação tumoral Herdox ao nível celular. <ol><li> Ligue um microscópio confocal Leica SPE. </li><li> Selecione 488 luz laser nm para a excitação de doxorrubicina e emissão de comprimentos de onda (560-620 nm) para a doxorrubicinadetecção por fluorescência. </li><li> Selecione uma objetiva de 40X ou 63X e óleo de imersão queda na lente objetiva. </li><li> Extrair tumores fresco a partir de ratos sacrificados que receberam previamente tratamentos Herdox e simulada como descrito no procedimento 2. </li><li> Tumores colocar em uma placa de Petri sobre gelo para evitar a degradação do tecido e, em seguida, transferir os tumores a uma câmara Delta T para a imagem confocal. </li><li> Adquirir imagens confocal dos tumores em profundidades focais seqüenciais (tamanho do passo: 1 mícron, espessura: 20 mm). Um exemplo de imagens adquiridas sequencialmente ao longo do eixo z é mostrado na Figura 3, painel da esquerda. </li><li> Realizar intensidade máxima z projecção das imagens. Uma projecção de intensidade máxima z empilhado imagens é mostrado na Figura 3, painel da direita. </li><li> Calcular média intensidades de fluorescência de intensidade máxima Z -. Imagens de projeção média intensidades de fluorescência das imagens sobre o campo de vista global foram calculard usando ImageJ. </li></ol> 5. Spectral Imaging Ratiometric e Análise Imagem espectral Ratiometric e análise permite discriminação entre Dox fluorescência e autofluorescência. <ol><li> Energia em um microscópio confocal de varredura a laser de fluorescência. </li><li> Adquirir 15 imagens dos tumores Herdox-tratadas e não tratadas, a uma profundidade especificada no intervalo espectral de 510-650 nm, com um tamanho de passo de 10 nm, e a luz de excitação a 488 nm, utilizando um microscópio confocal Leica SPE. </li><li> Prepara-se uma solução 100 uM de doxorrubicina. </li><li> Realizar imagem espectral da solução de doxorrubicina 100 uM para obter a assinatura espectral pura de fluorescência Dox (faixa espectral: 510-650 nm, um tamanho de passo: 10 nm). Os resultados típicos de aquisição de imagem a partir de imagiologia espectral e do espectro de fluorescência resultante representada em gráfico são mostrados na Figura 4. </li><li> Adquirir a assinatura espectral autofluorescência de uma imagem cube (faixa espectral: 510-650 nm, um tamanho do passo: 10 nm) obtidos por imagem espectral de tumores não tratados. Os resultados típicos de aquisição de imagem a partir de imagiologia espectral e do espectro de fluorescência resultante representada em gráfico são mostrados na Figura 5. </li><li> Gerar quatro assinaturas espectrais de referência (puro autofluorescência, 0.1.doxorubin 0,9. Autofluorescência, 0.2. Doxorrubicina 0,8. Autofluorescência, 0.3.doxorubin 0,7. Autofluorescência) utilizando o programa que nós desenvolvemos 9. Uma curva típica que mostra quatro assinaturas espectrais de referência é mostrado na Figura 6. </li><li> Realizar classificação espectral das imagens, tal como definido pela referência de assinaturas espectrais através de medida de distância euclidiana usando o programa que anteriormente desenvolvido 9. </li><li> Realizar separação espectral linear dessas imagens usando um programa espectral desmistura (plug-in ImageJ) desenvolvemos 7, 10, para comparação com a imagem espectral e análise raciométrica. Um example de separar fluorescência Herdox de autofluorescência por separação espectral linear é mostrada na Figura 7. </li></ol>

<ol><li>Agadjanian, H., Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+Targeting+by+DNA+Capture+in+Viral+Protein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles.</a> Nanomedicine. 7 (3), 335-352 (2012).</li>
<li>Agadjanian, H., Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+detection+and+elimination+by+a+targeted+gallium+corrole%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (15), 6105-6110 (2009).</li>
<li>Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+delivery+of+corroles+to+cells+via+noncovalent+conjugates+with+viral+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins.</a> Pharm. Res. 23 (2), 367-377 (2006).</li>
<li>Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+gene+delivery+to+human+breast+cancer+cells+by+targeted+Ad5+penton+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins.</a> Gene Therapy. , 81753-81761 (2001).</li>
<li>Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3PO%2C+a+novel+non-viral+gene+delivery+system+using+engineered+Ad5+penton+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins.</a> Gene Therapy. , 8795-8803 (2001).</li>
<li>Rentsendorj, A., Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Typical+and+atypical+trafficking+pathways+of+Ad5+penton+base+recombinant+protein%3A+implications+for+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer.</a> Gene Ther. 13 (10), 821-836 (2006).</li>
<li>Hwang, J. Y., Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodality+Imaging+In+vivo+for+Preclinical+Assessment+of+Tumor-Targeted+Doxorubicin+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles.</a> PLoS ONE. 7 (4), e34463(2012).</li>
<li>Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multimode+Optical+Imaging+System+for+Preclinical+Applications+In+Vivo%3A+Technology+Development%2C+Multiscale+Imaging%2C+and+Chemotherapy+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment.</a> Mol. Imaging Biol. , (2011).</li>
<li>Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+spectral+imaging+for+fast+tumor+detection+and+chemotherapy+monitoring+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo.</a> J. Biomed. Opt. 16 (6), 066007(2011).</li>
<li>Fujimoto, J. G., Farkas, D. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFujimoto%2C+JG+%22Biomedical+Optical+Imaging%22">Biomedical Optical Imaging</a>. , Oxford University Press. New York. (2009).</li>
<li>Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimode+optical+imaging+of+small+animals%3A+development+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">Multimode optical imaging of small animals: development and applications.</a> Proc. of SPIE. 6411, (2007).</li>
<li>Ducros, M., Moreaux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+unmixing%3A+analysis+of+performance+in+the+olfactory+bulb+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo.</a> PLoS One. 4 (2), e4418(2009).</li>
<li>Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+unmixing+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. , 95245-95265 (2005).</li>
</ol>

O autor, Daniel Farkas, é presidente do espectral Molecular Imaging. Os demais autores não têm interesses conflitantes.

Dox fluorescência pode ser detectada in vivo utilizando o gerador de imagens multimodo quando os tumores são subcutâneas. No entanto, a dose terapeuticamente eficaz de Herdox (0,004 mg / kg) é inferior ao limiar de detecção, após uma única dose. Em contraste, após 7 injecções diárias (1x/dia durante 7 dias), a acumulação do tumor e retenção das partículas é suficiente para permitir a visualização de Dox fluorescência. É essencial quando se trabalha com Dox ou qualquer outro fluorófo...

Tumor-alvo de quimioterapia tem o potencial de eliminar células cancerosas com uma dose mais baixa em comparação com as drogas irrelevantes porque a maior parte da terapia administrada pode acumular-se ao seu destino pretendido, em vez de distribuir a tecido não do tumor. A última situação iria diluir a eficácia do fármaco e, assim, requerem doses mais elevadas para ser eficaz, o tumor-alvo tem vantagens terapêuticas e segurança ao longo do tratamento não específico padrão. Targeting quimioterapia por encapsulamento em nanopartículas automontadas permite que a droga permaneça quimicamente não modificado, em contraste com as drogas que são covalentemente ligados a moléculas alvo. Como tal ligação tem o potencial de alterar a actividade de ambos o fármaco e a molécula alvo; montagem não covalente permite que a potência da droga a ser retida. Nós mostramos anteriormente que o romance de três componentes, complexo de auto-montados, Herdox, visa tumores HER2 + <em&gt; In vivo e provoca a ablação de tumores de crescimento, poupando o tecido normal, incluindo o coração 1. Herdox é formado através de interacções não covalentes entre a proteína de ligação ao receptor de células-penetração, HerPBK10, e o agente quimioterapêutico, a doxorrubicina (Dox), através de um pequeno ligante de ácido nucleico. HerPBK10 se liga o factor de crescimento epidérmico humano (HER), e desencadeia a endocitose mediada pelo receptor de 2-4, enquanto que a penetração da membrana endossomal é conseguida através da incorporação do derivado de adenovírus penton base de proteína da cápside 4-6. Um domínio carregado positivamente com a proteína de ligação de ácido nucleico permite a 4, 5, através da qual o ADN-Dox intercalado pode ser transportado para a entrega alvo. Eletrofílica, intercalação e, possivelmente, as interações de oligomerização da proteína facilitar a auto-montagem em volta de 10-20 nm partículas que são estáveis ​​no sangue e sob o armazenamento prolongado em temperaturas diferentes 1. Alvo preferencial para HER2 + células tumorais é facilitada pela afinidade de ligando aumentada quando HER2 é elevado. Os nossos estudos anteriores mostraram que a administração sistémica de rendimentos Herdox acumulação preferencial em tumores de mais de tecido não-tumoral e em comparação com uma Dox irrelevantes, e a penetração de células tumorais in vivo, 7. Temos observado que as versões Herdox Dox após a entrada de células tumorais, permitindo a acumulação Dox no núcleo 1. Tumor-acumulação parece correlacionar-se com o nível do receptor, como tumores que expressam HER2 relativamente baixas acumulam menos Herdox em comparação com aqueles com níveis mais elevados comparativamente HER2 1. Além disso, a concentração efectiva de morte celular exibe uma correlação inversa com a exibição de HER2 em linhas de células de tumor que expressam superfície celular diferentes níveis de HER2 1. Herdox apresenta uma vantagem terapêutica e segurança sobre Dox irrelevantes, como a matança tumor ocorre em mais de dose de 10 vezes menor em comparação com a untarigualmente dirigido droga e não produz efeitos adversos detectáveis ​​no coração (detectado por ecocardiografia e histológica mancha) ou fígado (detectado por coloração TUNEL) do tecido, em contraste com um Dox irrelevantes. Apesar de sua derivação a partir de uma proteína do capsídeo viral, HerPBK10 não apresenta imunogenicidade detectável em níveis terapêuticos 2. Considerando anticorpos pré-existentes para adenovírus todo pode reconhecer HerPBK10, eles são incapazes de impedir a ligação de 2 celular. O volume do tumor medido ao longo do tempo é um método padrão de avaliação da eficácia terapêutica de terapêuticas específicas, e tem sido utilizada para avaliar a eficácia terapêutica do Herdox. Complementando esta abordagem com in vivo e ex vivo de imagens intensidade de fluorescência nos permitiu avaliar melhor direcionamento eficiência 7. Temos especificamente integrados in situ de imagem confocal de tumores excisados ​​com a análise espectral de Dox fluorescência para verificar que nenhum Herdoxt só acumulou em tumores in vivo, mas penetrou nas células tumorais e Dox entregue no citoplasma e núcleo 7. A análise espectral, além disso, nos permitiu distinguir Dox fluorescência da autofluorescência 7. Aqui demonstramos em maior detalhe a nossa abordagem para avaliar Herdox in vivo, após a administração sistémica, e mais importante, para avaliar a segmentação por métodos de imagem multimodo e análises.

<table><tbody><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser de fluorescência</td><td>Leica</td><td>SPE</td><td></td></tr><tr><td>In Vivo Imager Óptico</td> Imagem <td>Molecular Espectral</td><td>Multimodo In Vivo Imager</td><td></td>Óptico</tr><tr><td>Doxorrubicina-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4035</td><td></td></tr><tr><td>Nude (NU/NU) camundongo, fêmea, 6-8 semanas</td><td>Charles River</td><td>Código de cepa 088</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-435 células tumorais humanas HER2+</td><td>NCI-Frederick Cancer DCTD Repositório de Tumores/Linhas Celulares</td><td>0507292</td><td></td></tr><tr><td>seringa de insulina de 3/10 cc U-100 com agulha permanentemente anexada 29G x 1/2" Ultra-FineIV</td><td>BD</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>Câmara Delta T </td><td>Bioptechs</td><td>04200417B</td><td></td></tr></tbody></table>

análise de proteína viral alvejado nanopartículas entregue para tumores her2 +

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

A nanopartícula HER2 + tumor-alvo, Herdox, apresenta acúmulo tumor preferencial e ablação de tumores de crescimento em um modelo animal de câncer HER2 +. Herdox é formada por auto-montagem não covalente de uma proteína de penetração nas células alvo do tumor com o agente de quimioterapia, doxorubicina, através de um pequeno ligante de ácido nucleico. Uma combinação de eletrofílico, intercalação e interações oligomerização facilitar a auto-montagem em partículas redondas 10-20 nm. Herdox exibe estabilidade no sangue, bem como em armazenamento prolongado a temperaturas diferentes. Entrega sistémica de Herdox em ratos portadores de tumor resulta na morte de células de tumor, sem efeitos adversos detectáveis ​​para tecido não-tumoral, incluindo o coração e fígado (que sofrer danos marcados por doxorubicina não segmentados). HER2 elevação facilita direccionamento para células que expressam o receptor do factor de crescimento epidérmico humano, daí tumores exibindo níveis elevados de HER2 exibem uma maior acumulação de células em comparação com Herdox expressãocantar níveis mais baixos, tanto in vitro como in vivo. Imagem intensidade de fluorescência combinada com a análise espectral confocal e situ nos permitiu verificar em tumor vivo segmentação e penetração de Herdox após a entrega sistemática de células tumorais. Aqui detalhamos os nossos métodos para avaliar tumor alvo através de imagens multimodo após a entrega sistêmica.

A Figura 1 mostra o gerador de imagens in vivo protótipo óptico, o qual foi construído com o objectivo de aquisição de imagem em várias modalidades, incluindo a intensidade de fluorescência, espectral, tempo de vida, 2-fotão, confocal intra-vital, e imagem de bioluminescência. Além disso, a elevada sensibilidade da câmara de refrigeração e as linhas de laser de alta potência incorporado no presente sistema produz imagens de fluorescência de contraste mais elevados em comparação com os sistemas ...

Este artigo detalha os procedimentos para a análise das nanopartículas tumor-alvo, Herdox imageamento óptico. Em particular, o uso detalhado do aparelho de imagem para detecção do tumor multimodo alvo e avaliar a penetração do tumor é descrito aqui.

Análise de Proteína Viral alvejado Nanopartículas entregue para tumores HER2 +

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar e analisar a administração sistêmica in vivo da nanopartícula direcionada a tumores HeroX utilizando imagem óptica multimodal. Primeiro, a nanopartícula é injetada na veia caudal de um camundongo portador de tumor e imagens de fluorescência são adquiridas usando um sistema de imagem óptica multimodal. Após a eutanásia, o tumor e os órgãos são coletados e novamente submetidos à imagem para detectar partículas fluorescentes dentro das células tumorais.A imagem confocal in loco é então realizada. A análise das imagens resultantes demonstra o direcionamento e penetração quantificáveis dos herdocs nos tumores após administração sistêmica. Uma vantagem importante das técnicas de imagem multimodal em comparação com as técnicas existentes, como o modo de imagem única, é fornecer informações múltiplas e complementares que podem aprimorar a análise e a quantificação da entrega no tumor.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de liberação de fármacos, como se um medicamento direcionado não apenas é entregue aos tumores, mas também penetra efetivamente nas células tumorais. O procedimento será demonstrado pela Dra. J Yun Wang, ex-bolsista de pós-doutorado no meu laboratório, e por Janet Markman, aluna de pós-graduação atual. Neste protocolo, camundongos com seis a oito semanas de idade.Novos camundongos portadores de tumores xenografts subcutâneos bilaterais nos flancos são utilizados. Prepare a administração sistêmica misturando quantidade suficiente de HeroX com solução salina estéril para obter 0,2 mililitros de uma dose de 0,004 miligrama por quilograma de HeroX por injeção. Aspire cuidadosamente 0,2 mililitros da mistura de HeroX em uma seringa de insulina de três décimos de cc equipada com uma agulha de 29 graus.Tenha cuidado para garantir que não haja bolhas após a anestesia. Injete toda a mistura na veia da cauda após a injeção. Aperte a cauda para evitar perda sanguínea no local da injeção.Após a parada do sangramento, limpe o local da injeção com um cotonete estéril e devolva o camundongo à gaiola. Repita a injeção no mesmo camundongo por mais seis dias consecutivos. Uma vez por dia, a acumulação de fluorescência do HeroX nos tumores pode ser detectada no último dia da injeção.Dia sete, utilizando um imageador multimodal. Os procedimentos aqui empregam o uso de um sistema de imagem óptica com capacidades de intensidade de fluorescência, fluorescência espectral, tempo de vida e imagem confocal intravital. É mostrado aqui o protótipo do imageador óptico in vivo.A câmera de alta sensibilidade refrigerada e as linhas de laser de alta potência incorporadas a este sistema produzem imagens de fluorescência com maior contraste em comparação com sistemas ópticos de imagem comerciais, especialmente para a detecção in vivo da fluorescência da doxorrubicina. Ligue o sistema óptico multimodal de imagem in vivo no software. Selecione um filtro de passagem de banda de emissão adequado para a detecção da fluorescência da doxorrubicina.Ligue o laser e coloque um filtro de passagem de banda de excitação no caminho óptico do laser. Após anestesiar um camundongo na câmara de anestesia com isoflurano, transfira-o para a câmara de imagem do imagemador óptico in vivo multimodal. Coloque um cone nasal sobre o nariz do camundongo e abra o fluxo para administrar anestesia contínua.Durante a aquisição de imagens, adquira imagens de fluorescência utilizando um tempo de exposição de cinco a 15 segundos. A fluorescência da doc pode ser visualizada em tumores e órgãos específicos, incluindo fígado, rim, baço, coração e músculo esquelético coletados de camundongos eutanasiados 24 horas após o último dia de injeção. Ligue o imageador óptico multifuncional in vivo.Como antes, coloque então os tumores e órgãos específicos dispostos em uma placa de Petri. Dentro da câmara de imagemamento do imagiador óptico multimodal in vivo, adquira imagens de fluorescência dos tecidos utilizando um tempo de exposição de cinco a 15 segundos. Em seguida, repita as mesmas aquisições utilizando uma placa de Petri vazia, que servirá como fundo após a aquisição.Realize a análise e o processamento de imagens, incluindo correção de fundo ou ajuste de contraste. A imagem confocal in situ permite a detecção e análise do acúmulo tumoral em rebanho ao nível celular. Utilizando um microscópio confocal.Selecione luz laser de 488 nanômetros para excitação da doxorrubicina e comprimentos de onda de emissão de 560 a 620 nanômetros. Para detecção da fluorescência da doxorrubicina, selecione uma objetiva de 40 x ou 63 x e coloque uma gota de óleo de imersão sobre ela. Coloque os tumores do camundongo eutanasiado em uma placa de Petri para evitar degradação tecidual.Em seguida, transfira os tumores para uma câmara delta T para imagem confocal. Adquira imagens confocais dos tumores em profundidades focais sequenciais com um tamanho de passo de um mícron e espessura de 20 mícrons. Um exemplo de imagens adquiridas sequencialmente ao longo do eixo Z é mostrado aqui.Gere projeções Z de intensidade máxima das imagens. Em seguida, utilizando o ImageJ ou um programa similar, calcule as intensidades médias de fluorescência das imagens de projeção Z de intensidade máxima para a razão geral do campo de visão. A imagem espectral métrica e sua análise permitem discriminar entre doxorrubicina, fluorescência e autofluorescência.Utilizando um microscópio confocal de varredura a laser com fluorescência, adquira 15 imagens de tumores tratados e não tratados com HeroX a uma profundidade especificada, dentro da faixa espectral de 510 a 650 nanômetros, com incrementos de 10 nanômetros e excitação com luz de 488 nanômetros, usando um microscópio confocal Leica SPE. Em seguida, prepare uma solução de 100 micromolar de doxorrubicina em solução salina. Realize a imagem espectroscópica da solução de doxorrubicina a 100 micromolar.Para obter a assinatura espectral pura da fluorescência da doxorubicina. Adquira a assinatura espectral de autofluorescência a partir do cubo de imagens mediante a aquisição de tumores não tratados. Após todos os dados terem sido coletados, gere assinaturas espectrais de referência, realize a classificação espectral das imagens e execute o desmisturamento espectral linear dessas imagens para obter uma avaliação quantitativa do acúmulo de her doc em tumores.Imagens de fluorescência confocal foram obtidas em diferentes profundidades focais in situ, seguidas por projeção Z de intensidade máxima das imagens e aquisição da intensidade média de fluorescência da imagem projetada. A alta fluorescência tumoral mostrada nesta imagem é típica após a administração sistêmica do her docs e indica o direcionamento preferencial ao tumor. A fluorescência detectada no músculo esquelético é atípica e pode resultar de anomalias no procedimento de injeção.Qualitativamente, esta imagem apresenta um fundo baixo. Para análise quantitativa, realiza-se uma correção de fundo utilizando um recipiente vazio, conforme mostrado aqui. A imagem resultante, corrigida para o fundo, apresenta um sinal de fundo mais alto nas bordas da imagem em comparação com a original, porque a imagem de fundo possui intensidades mais baixas nas bordas da imagem.As imagens empilhadas mostradas à esquerda são representativas das varreduras confocais de tecido tumoral obtidas em profundidades sequenciais de um mícron. A imagem à direita mostra a compilação das imagens empilhadas à esquerda. A imagem compilada contém as informações de acumulação de HeroX ao longo das profundidades Z indicadas em cada pixel, de modo que a média das intensidades de fluorescência reflete quantitativamente a acumulação geral dos doc's em tumores a diferentes profundidades.Para distinguir a fluorescência do herd doc da autofluorescência em tumores e discriminar quantitativamente os dois com métricas de alta especificidade. É realizada a imagem espectral e análise. Esta imagem mostra as assinaturas espectrais puras para a doxorubicina.A intensidade de fluorescência da área delimitada pelo traço pontilhado nos comprimentos de onda de emissão indicados produz um histograma que mostra o perfil da doxorrubicina ao longo do espectro de comprimento de onda entre 510 e 650 nanômetros. Aqui, são mostradas as assinaturas espectrais puras da autofluorescência. A fluorescência emitida por um tumor não tratado nos comprimentos de onda de emissão indicados produz uma inclinação que representa o perfil de emissão de autofluorescência. Referência.Assinaturas espectrais também foram criadas misturando diferentes proporções das assinaturas espectrais puras. Utilizando o programa, desenvolvemos cada referência. Assinatura espectral representa aqui a fluorescência relativa das her docks acumuladas em tumores em relação à autofluorescência.Após obter as assinaturas espectrais das marcações e da autofluorescência, os sinais de marcação são separados utilizando a separação espectral linear. A figura mostra a imagem mista de autofluorescência e das marcações de Her antes da separação espectral e a imagem separada das marcações de Her após a separação espectral. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como combinar intensidade de fluorescência, Comfort Car e modalidades de imagem espectral para aprimorar a análise e a quantificação da entrega do tumor.Não se esqueça de que trabalhar com doxorubicina pode ser perigoso, e precauções como o uso de luvas duplas e a troca frequente de luvas devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Bioengineering

Bioengenharia

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