Introdução à Microscopia de Fluorescência
Fluorescência é um fenômeno que ocorre quando uma substância absorve a luz em um determinado comprimento de onda e emite luz em outro comprimento de onda. A fluorescência ocorre como um elétron, que tem sido animado para um estado de energia mais alto e mais instável, relaxa para seu estado terrestre e emite um fóton de luz. A luz responsável pela excitação, ou mover o elétron para um estado de maior energia, é de comprimento de onda mais curto e maior energia do que a emissão de fluorescência, que tem um comprimento de onda mais longo, menor energia e cores diferentes.
A microscopia de fluorescência combina as propriedades de ampliação do microscópio leve com a tecnologia de fluorescência que permite a excitação e detecção de emissões de compostos químicos fluorescentes. Com a microscopia de fluorescência, os cientistas podem observar a localização de tipos celulares específicos dentro de tecidos ou moléculas dentro das células.
Os principais componentes do microscópio fluorescente se sobrepõem muito com o microscópio de luz tradicional. No entanto, as 2 principais diferenças são o tipo de fonte de luz e o uso dos elementos especializados do filtro.
A microscopia de fluorescência requer uma fonte de luz muito poderosa, como uma lâmpada de xenônio ou arco de mercúrio como a mostrada aqui. A luz emitida da lâmpada do arco de mercúrio é 10-100 vezes mais brilhante que a maioria das lâmpadas incandescentes e fornece luz em uma ampla gama de comprimentos de onda, do ultravioleta ao infravermelho. Esta fonte de luz de alta potência é a parte mais perigosa da configuração do microscópio de fluorescência, pois olhar diretamente para a luz não filtrada pode danificar seriamente suas retinas e manusear mal as lâmpadas pode fazê-las explodir.
O princípio por trás da microscopia de fluorescência é simples. À medida que a luz sai da lâmpada de arco, ela é direcionada através de um filtro mais excitante, que seleciona o comprimento de onda de excitação.
Esta luz é refletida em direção à amostra por um espelho especial chamado espelho dicrómico, que é projetado para refletir a luz apenas no comprimento de onda de excitação. A luz refletida passa pelo objetivo onde está focada no espécime fluorescente. As emissões do espécime, por sua vez, são passadas de volta através do objetivo – onde ocorre a ampliação da imagem – e agora através do espelho dicroico.
Esta luz é filtrada pelo filtro de barreira, que seleciona para o comprimento de onda de emissão e filtra a luz contaminante da lâmpada do arco ou outras fontes que são refletidas fora dos componentes do microscópio. Finalmente, a emissão fluorescente filtrada é enviada para um detector onde a imagem pode ser digitalizada, ou é transmitida para a ocular para visualização óptica.
O filtro exciter, o espelho dicroico e o filtro de barreira podem ser montados juntos em um componente conhecido como cubo de filtro. Diferentes cubos de filtro podem ser alterados durante a visualização da amostra para alterar o comprimento de onda de excitação, e uma série de diaframas podem ser usados para modificar a intensidade da excitação.
Quando se trata de realizar microscopia de fluorescência, o fluoróforo pode ser tão importante quanto o microscópio em si, e o tipo de fluoróforo que está sendo imageado dita o comprimento de onda de excitação usado e o comprimento de onda de emissão detectado. Os comprimentos de onda de excitação contêm uma pequena gama de energias que podem ser absorvidas pelo fluoróforo e fazem com que ela transite para um estado animado. Uma vez animado, uma ampla gama de emissões, ou transições de volta para o estado de menor energia, são possíveis resultando em um espectro de emissões.
A diferença entre o pico da curva de absorção, ou excitação e o pico da curva de emissão é conhecida como Mudança de Stoke. Quanto maior a distância neste turno, mais fácil é separar os dois comprimentos de onda diferentes. Além disso, qualquer espectro sobreposto precisa ser removido pelos componentes do cubo do filtro para redução de fundo e melhor qualidade de imagem.
A exposição do fluoróforo à excitação prolongada fará com que ele fotobleach, que é um enfraquecimento ou perda de fluorescência. Para reduzir o fotobleaching, você pode adicionar um meio de montagem anti-fade ao slide e selar as bordas com esmalte. O slide também deve ser mantido no escuro quando não for imageado.
Para começar a imagem de fluorescência, ligue a fonte de luz de xenônio ou mercúrio e deixe-a aquecer por até 15 minutos para que ela atinja a iluminação constante.
Em seguida, coloque sua amostra no palco e fixe-a no lugar. Em seguida, ligue a fonte de luz branca do seu microscópio. Concentre-se na sua amostra usando o objetivo mais baixo, ajustando os botões de foco grosseiro e fino. Em seguida, use os botões de ajuste de estágio para encontrar sua área de interesse.
Em seguida, desligue a fonte de luz branca, bem como quaisquer luzes desnecessárias para reduzir o fundo.
Selecione o cubo de filtro correto para o corante que você está que está abrindo o obturador para iluminar sua amostra.
Por fim, faça ajustes finos de foco e direcione a luz de saída para a câmera de imagem. Você provavelmente precisará fazer ajustes no tempo de exposição para cada fluorohore diferente ou corante fluorescente usado. No entanto, é importante manter o tempo de exposição constante ao comparar características com o mesmo corante em diferentes amostras.
Para imaginar vários corantes na mesma amostra, altere o cubo do filtro para combinar com cada fluoróforo e registre a nova imagem.
Depois que cada corante da amostra foi imageado, imagens individuais podem ser sobrepostas e mescladas.
Muitos tipos diferentes de experimentos podem fazer uso de microscopia fluorescente e envolver diferentes tipos de fluoroforos Uma das aplicações mais comuns da microscopia fluorescente é a imagem de proteínas que foram rotuladas com anticorpos que estão ligados, ou "conjugados" a compostos fluorescentes.. Aqui, um anticorpo em direção às proteínas da superfície leptospiral foi detectado usando um anticorpo secundário conjugado ao alexafluor-488, que fluoresce verde quando animado.
Outra forma de destacar uma característica específica com fluorescência é integrar o código para uma proteína fluorescente como proteína fluorescente verde, ou GFP, no DNA de um organismo. O gene para GFP foi originalmente isolado de águas-vivas e pode ser expresso, ou produzido, por células cultivadas em resposta a gatilhos específicos ou como parte de um tipo específico de célula como as células tumorais mostradas brilhando nesta imagem
Outra aplicação da imagem de fluorescência é a Fluorescence Speckle Microscopy, que é uma tecnologia que usa conjuntos macromoleculares fluorescentes rotulados, como a rede F-actin vista aqui, para estudar o movimento e a cinética de rotatividade desta importante proteína citoesquelética.
Uma técnica avançada conhecida como recuperação da fluorescência após fotobleaching, ou FRAP, é realizada por fotobleaching intencionalmente uma pequena região de uma amostra, a fim de monitorar a taxa de difusão de moléculas fluorescentes rotuladas de volta para a região fotobleachada.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE à Microscopia de Fluorescência.
Neste vídeo aprendemos sobre o conceito de fluorescência, como a microscopia de fluorescência difere da microscopia leve e como tirar uma imagem de fluorescência através do escopo. Também aprendemos sobre algumas aplicações básicas e avançadas que usam fluorescência. Obrigado por assistir e não se esqueça enquanto fotobleaching fica ótimo em seus dentes não é tão bom para suas amostras.
A microscopia de fluorescência é uma ferramenta analítica muito poderosa que combina as propriedades de ampliação da microscopia leve com visualização…
Fluorescência é um fenômeno que ocorre quando uma substância absorve a luz em um determinado comprimento de onda e emite luz em outro comprimento de onda. A fluorescência ocorre como um elétron, que tem sido animado para um estado de energia mais alto e mais instável, relaxa para seu estado terrestre e emite um fóton de luz. A luz responsável pela excitação, ou mover o elétron para um estado de maior energia, é de comprimento de onda mais curto e maior energia do que a emissão de fluorescência, que tem um comprimento de onda mais longo, menor energia e cores diferentes.
A microscopia de fluorescência combina as propriedades de ampliação do microscópio leve com a tecnologia de fluorescência que permite a excitação e detecção de emissões de compostos químicos fluorescentes. Com a microscopia de fluorescência, os cientistas podem observar a localização de tipos celulares específicos dentro de tecidos ou moléculas dentro das células.
Os principais componentes do microscópio fluorescente se sobrepõem muito com o microscópio de luz tradicional. No entanto, as 2 principais diferenças são o tipo de fonte de luz e o uso dos elementos especializados do filtro.
A microscopia de fluorescência requer uma fonte de luz muito poderosa, como uma lâmpada de xenônio ou arco de mercúrio como a mostrada aqui. A luz emitida da lâmpada do arco de mercúrio é 10-100 vezes mais brilhante que a maioria das lâmpadas incandescentes e fornece luz em uma ampla gama de comprimentos de onda, do ultravioleta ao infravermelho. Esta fonte de luz de alta potência é a parte mais perigosa da configuração do microscópio de fluorescência, pois olhar diretamente para a luz não filtrada pode danificar seriamente suas retinas e manusear mal as lâmpadas pode fazê-las explodir.
O princípio por trás da microscopia de fluorescência é simples. À medida que a luz sai da lâmpada de arco, ela é direcionada através de um filtro mais excitante, que seleciona o comprimento de onda de excitação.
Esta luz é refletida em direção à amostra por um espelho especial chamado espelho dicrómico, que é projetado para refletir a luz apenas no comprimento de onda de excitação. A luz refletida passa pelo objetivo onde está focada no espécime fluorescente. As emissões do espécime, por sua vez, são passadas de volta através do objetivo – onde ocorre a ampliação da imagem – e agora através do espelho dicroico.
Esta luz é filtrada pelo filtro de barreira, que seleciona para o comprimento de onda de emissão e filtra a luz contaminante da lâmpada do arco ou outras fontes que são refletidas fora dos componentes do microscópio. Finalmente, a emissão fluorescente filtrada é enviada para um detector onde a imagem pode ser digitalizada, ou é transmitida para a ocular para visualização óptica.
O filtro exciter, o espelho dicroico e o filtro de barreira podem ser montados juntos em um componente conhecido como cubo de filtro. Diferentes cubos de filtro podem ser alterados durante a visualização da amostra para alterar o comprimento de onda de excitação, e uma série de diaframas podem ser usados para modificar a intensidade da excitação.
Quando se trata de realizar microscopia de fluorescência, o fluoróforo pode ser tão importante quanto o microscópio em si, e o tipo de fluoróforo que está sendo imageado dita o comprimento de onda de excitação usado e o comprimento de onda de emissão detectado. Os comprimentos de onda de excitação contêm uma pequena gama de energias que podem ser absorvidas pelo fluoróforo e fazem com que ela transite para um estado animado. Uma vez animado, uma ampla gama de emissões, ou transições de volta para o estado de menor energia, são possíveis resultando em um espectro de emissões.
A diferença entre o pico da curva de absorção, ou excitação e o pico da curva de emissão é conhecida como Mudança de Stoke. Quanto maior a distância neste turno, mais fácil é separar os dois comprimentos de onda diferentes. Além disso, qualquer espectro sobreposto precisa ser removido pelos componentes do cubo do filtro para redução de fundo e melhor qualidade de imagem.
A exposição do fluoróforo à excitação prolongada fará com que ele fotobleach, que é um enfraquecimento ou perda de fluorescência. Para reduzir o fotobleaching, você pode adicionar um meio de montagem anti-fade ao slide e selar as bordas com esmalte. O slide também deve ser mantido no escuro quando não for imageado.
Para começar a imagem de fluorescência, ligue a fonte de luz de xenônio ou mercúrio e deixe-a aquecer por até 15 minutos para que ela atinja a iluminação constante.
Em seguida, coloque sua amostra no palco e fixe-a no lugar. Em seguida, ligue a fonte de luz branca do seu microscópio. Concentre-se na sua amostra usando o objetivo mais baixo, ajustando os botões de foco grosseiro e fino. Em seguida, use os botões de ajuste de estágio para encontrar sua área de interesse.
Em seguida, desligue a fonte de luz branca, bem como quaisquer luzes desnecessárias para reduzir o fundo.
Selecione o cubo de filtro correto para o corante que você está que está abrindo o obturador para iluminar sua amostra.
Por fim, faça ajustes finos de foco e direcione a luz de saída para a câmera de imagem. Você provavelmente precisará fazer ajustes no tempo de exposição para cada fluorohore diferente ou corante fluorescente usado. No entanto, é importante manter o tempo de exposição constante ao comparar características com o mesmo corante em diferentes amostras.
Para imaginar vários corantes na mesma amostra, altere o cubo do filtro para combinar com cada fluoróforo e registre a nova imagem.
Depois que cada corante da amostra foi imageado, imagens individuais podem ser sobrepostas e mescladas.
Muitos tipos diferentes de experimentos podem fazer uso de microscopia fluorescente e envolver diferentes tipos de fluoroforos Uma das aplicações mais comuns da microscopia fluorescente é a imagem de proteínas que foram rotuladas com anticorpos que estão ligados, ou "conjugados" a compostos fluorescentes.. Aqui, um anticorpo em direção às proteínas da superfície leptospiral foi detectado usando um anticorpo secundário conjugado ao alexafluor-488, que fluoresce verde quando animado.
Outra forma de destacar uma característica específica com fluorescência é integrar o código para uma proteína fluorescente como proteína fluorescente verde, ou GFP, no DNA de um organismo. O gene para GFP foi originalmente isolado de águas-vivas e pode ser expresso, ou produzido, por células cultivadas em resposta a gatilhos específicos ou como parte de um tipo específico de célula como as células tumorais mostradas brilhando nesta imagem
Outra aplicação da imagem de fluorescência é a Fluorescence Speckle Microscopy, que é uma tecnologia que usa conjuntos macromoleculares fluorescentes rotulados, como a rede F-actin vista aqui, para estudar o movimento e a cinética de rotatividade desta importante proteína citoesquelética.
Uma técnica avançada conhecida como recuperação da fluorescência após fotobleaching, ou FRAP, é realizada por fotobleaching intencionalmente uma pequena região de uma amostra, a fim de monitorar a taxa de difusão de moléculas fluorescentes rotuladas de volta para a região fotobleachada.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE à Microscopia de Fluorescência.
Neste vídeo aprendemos sobre o conceito de fluorescência, como a microscopia de fluorescência difere da microscopia leve e como tirar uma imagem de fluorescência através do escopo. Também aprendemos sobre algumas aplicações básicas e avançadas que usam fluorescência. Obrigado por assistir e não se esqueça enquanto fotobleaching fica ótimo em seus dentes não é tão bom para suas amostras.
Iniciar sessão ou para aceder ao conteúdo completo. Saiba mais sobre o acesso da sua instituição ao conteúdo JoVE aqui
Fluorescência é um fenômeno que ocorre quando uma substância absorve a luz em um determinado comprimento de onda e emite luz em outro comprimento de onda. A fluorescência ocorre como um elétron, que tem sido animado para um estado de energia mais alto e mais instável, relaxa para seu estado terrestre e emite um fóton de luz. A luz responsável pela excitação, ou mover o elétron para um estado de maior energia, é de comprimento de onda mais curto e maior energia do que a emissão de fluorescência, que tem um comprimento de onda mais longo, menor energia e cores diferentes.
A microscopia de fluorescência combina as propriedades de ampliação do microscópio leve com a tecnologia de fluorescência que permite a excitação e detecção de emissões de compostos químicos fluorescentes. Com a microscopia de fluorescência, os cientistas podem observar a localização de tipos celulares específicos dentro de tecidos ou moléculas dentro das células.
Os principais componentes do microscópio fluorescente se sobrepõem muito com o microscópio de luz tradicional. No entanto, as 2 principais diferenças são o tipo de fonte de luz e o uso dos elementos especializados do filtro.
A microscopia de fluorescência requer uma fonte de luz muito poderosa, como uma lâmpada de xenônio ou arco de mercúrio como a mostrada aqui. A luz emitida da lâmpada do arco de mercúrio é 10-100 vezes mais brilhante que a maioria das lâmpadas incandescentes e fornece luz em uma ampla gama de comprimentos de onda, do ultravioleta ao infravermelho. Esta fonte de luz de alta potência é a parte mais perigosa da configuração do microscópio de fluorescência, pois olhar diretamente para a luz não filtrada pode danificar seriamente suas retinas e manusear mal as lâmpadas pode fazê-las explodir.
O princípio por trás da microscopia de fluorescência é simples. À medida que a luz sai da lâmpada de arco, ela é direcionada através de um filtro mais excitante, que seleciona o comprimento de onda de excitação.
Esta luz é refletida em direção à amostra por um espelho especial chamado espelho dicrómico, que é projetado para refletir a luz apenas no comprimento de onda de excitação. A luz refletida passa pelo objetivo onde está focada no espécime fluorescente. As emissões do espécime, por sua vez, são passadas de volta através do objetivo – onde ocorre a ampliação da imagem – e agora através do espelho dicroico.
Esta luz é filtrada pelo filtro de barreira, que seleciona para o comprimento de onda de emissão e filtra a luz contaminante da lâmpada do arco ou outras fontes que são refletidas fora dos componentes do microscópio. Finalmente, a emissão fluorescente filtrada é enviada para um detector onde a imagem pode ser digitalizada, ou é transmitida para a ocular para visualização óptica.
O filtro exciter, o espelho dicroico e o filtro de barreira podem ser montados juntos em um componente conhecido como cubo de filtro. Diferentes cubos de filtro podem ser alterados durante a visualização da amostra para alterar o comprimento de onda de excitação, e uma série de diaframas podem ser usados para modificar a intensidade da excitação.
Quando se trata de realizar microscopia de fluorescência, o fluoróforo pode ser tão importante quanto o microscópio em si, e o tipo de fluoróforo que está sendo imageado dita o comprimento de onda de excitação usado e o comprimento de onda de emissão detectado. Os comprimentos de onda de excitação contêm uma pequena gama de energias que podem ser absorvidas pelo fluoróforo e fazem com que ela transite para um estado animado. Uma vez animado, uma ampla gama de emissões, ou transições de volta para o estado de menor energia, são possíveis resultando em um espectro de emissões.
A diferença entre o pico da curva de absorção, ou excitação e o pico da curva de emissão é conhecida como Mudança de Stoke. Quanto maior a distância neste turno, mais fácil é separar os dois comprimentos de onda diferentes. Além disso, qualquer espectro sobreposto precisa ser removido pelos componentes do cubo do filtro para redução de fundo e melhor qualidade de imagem.
A exposição do fluoróforo à excitação prolongada fará com que ele fotobleach, que é um enfraquecimento ou perda de fluorescência. Para reduzir o fotobleaching, você pode adicionar um meio de montagem anti-fade ao slide e selar as bordas com esmalte. O slide também deve ser mantido no escuro quando não for imageado.
Para começar a imagem de fluorescência, ligue a fonte de luz de xenônio ou mercúrio e deixe-a aquecer por até 15 minutos para que ela atinja a iluminação constante.
Em seguida, coloque sua amostra no palco e fixe-a no lugar. Em seguida, ligue a fonte de luz branca do seu microscópio. Concentre-se na sua amostra usando o objetivo mais baixo, ajustando os botões de foco grosseiro e fino. Em seguida, use os botões de ajuste de estágio para encontrar sua área de interesse.
Em seguida, desligue a fonte de luz branca, bem como quaisquer luzes desnecessárias para reduzir o fundo.
Selecione o cubo de filtro correto para o corante que você está que está abrindo o obturador para iluminar sua amostra.
Por fim, faça ajustes finos de foco e direcione a luz de saída para a câmera de imagem. Você provavelmente precisará fazer ajustes no tempo de exposição para cada fluorohore diferente ou corante fluorescente usado. No entanto, é importante manter o tempo de exposição constante ao comparar características com o mesmo corante em diferentes amostras.
Para imaginar vários corantes na mesma amostra, altere o cubo do filtro para combinar com cada fluoróforo e registre a nova imagem.
Depois que cada corante da amostra foi imageado, imagens individuais podem ser sobrepostas e mescladas.
Muitos tipos diferentes de experimentos podem fazer uso de microscopia fluorescente e envolver diferentes tipos de fluoroforos Uma das aplicações mais comuns da microscopia fluorescente é a imagem de proteínas que foram rotuladas com anticorpos que estão ligados, ou "conjugados" a compostos fluorescentes.. Aqui, um anticorpo em direção às proteínas da superfície leptospiral foi detectado usando um anticorpo secundário conjugado ao alexafluor-488, que fluoresce verde quando animado.
Outra forma de destacar uma característica específica com fluorescência é integrar o código para uma proteína fluorescente como proteína fluorescente verde, ou GFP, no DNA de um organismo. O gene para GFP foi originalmente isolado de águas-vivas e pode ser expresso, ou produzido, por células cultivadas em resposta a gatilhos específicos ou como parte de um tipo específico de célula como as células tumorais mostradas brilhando nesta imagem
Outra aplicação da imagem de fluorescência é a Fluorescence Speckle Microscopy, que é uma tecnologia que usa conjuntos macromoleculares fluorescentes rotulados, como a rede F-actin vista aqui, para estudar o movimento e a cinética de rotatividade desta importante proteína citoesquelética.
Uma técnica avançada conhecida como recuperação da fluorescência após fotobleaching, ou FRAP, é realizada por fotobleaching intencionalmente uma pequena região de uma amostra, a fim de monitorar a taxa de difusão de moléculas fluorescentes rotuladas de volta para a região fotobleachada.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE à Microscopia de Fluorescência.
Neste vídeo aprendemos sobre o conceito de fluorescência, como a microscopia de fluorescência difere da microscopia leve e como tirar uma imagem de fluorescência através do escopo. Também aprendemos sobre algumas aplicações básicas e avançadas que usam fluorescência. Obrigado por assistir e não se esqueça enquanto fotobleaching fica ótimo em seus dentes não é tão bom para suas amostras.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is fluorescence and how does it occur at the molecular level?
Fluorescence occurs when a fluorophore absorbs light at a specific wavelength, exciting an electron to a higher energy state. As the electron relaxes back to its ground state, it emits a photon of light at a longer wavelength and lower energy than the absorbed light. This emission enables visualization of fluorescently labeled structures in microscopy applications.
Q2: How does fluorescence microscopy differ from light microscopy?
Fluorescence microscopy combines magnification with fluorescence detection, requiring specialized components beyond traditional light microscopy. Key differences include a powerful xenon or mercury arc lamp that is 10-100 times brighter than incandescent sources, specialized exciter and barrier filters, and a dichroic mirror to separate excitation and emission wavelengths. These additions enable detection of fluorescently labeled molecules within cells and tissues.
Q3: What is Stokes Shift and why does it matter in fluorescence microscopy?
Stokes Shift is the difference between the peak absorption wavelength and the peak emission wavelength of a fluorophore. A larger Stokes Shift makes it easier to separate excitation and emission wavelengths using filters, reducing background noise and improving image quality. This separation is critical for obtaining clear fluorescent images without contaminating light from the microscope components.
Q4: What causes photobleaching and how can you prevent it?
Photobleaching occurs when prolonged excitation weakens or eliminates a fluorophore's ability to fluoresce. To reduce photobleaching, add anti-fade mounting medium to slides and seal edges with nail polish. Additionally, keep slides in the dark when not being imaged to minimize unnecessary light exposure and preserve fluorescence intensity for accurate imaging.
Q5: What are the main components of a fluorescence microscope and their functions?
The exciter filter selects the excitation wavelength, the dichroic mirror reflects excitation light toward the sample while allowing emission light to pass through, and the barrier filter selects emission wavelength while blocking contaminating light. These three components can be assembled into a filter cube, which can be changed during imaging to accommodate different fluorophores and their specific wavelength requirements.
Q6: How do you prepare and image a fluorescence microscopy sample?
Allow the xenon or mercury light source to warm up for 15 minutes to reach constant illumination. Place the sample on the stage and focus using the lowest objective. Turn off room lights to reduce background, select the appropriate filter cube for your fluorophore, and open the shutter to illuminate the sample. Adjust exposure time as needed, keeping it constant when comparing samples with the same dye.
Q7: What are common methods for labeling samples in fluorescence microscopy?
Common labeling methods include conjugating fluorescent compounds to antibodies that target specific proteins, integrating fluorescent protein genes like GFP into organism DNA for expression in specific cell types, and labeling macromolecular assemblies such as the F-actin cytoskeletal network. Each method enables visualization of different cellular structures and molecular components for research and diagnostic applications.
Capítulos neste vídeo
0:00
Introduction to Fluorescence Microscopy
1:19
Principles and Components of the Fluorescent Microscope
2:21
Basic Principles of Fluorescence Microscopy
5:25
Fluorescence Microscopy Imaging
6:59
Applications
8:45
Summary