1.12: Introdução à Microscopia de Fluorescência

A fluorescência é um fenômeno que ocorre quando uma substância absorve luz em um determinado comprimento de onda e emite luz em outro comprimento de onda. A fluorescência ocorre quando um elétron, que foi excitado para um estado de energia mais alto e instável, relaxa para seu estado fundamental e emite um fóton de luz. A luz responsável pela excitação, ou movendo o elétron para um estado de energia mais alto, é de comprimento de onda mais curto e energia mais alta do que a emissão de fluorescência, que tem um comprimento de onda mais longo, menor energia e cor diferente.

A microscopia de fluorescência combina as propriedades de ampliação do microscópio de luz com a tecnologia de fluorescência que permite a excitação e detecção de emissões de fluoróforos - compostos químicos fluorescentes. Com a microscopia de fluorescência, os cientistas podem observar a localização de tipos específicos de células dentro dos tecidos ou moléculas dentro das células.

Os principais componentes do microscópio fluorescente se sobrepõem muito ao microscópio de luz tradicional. No entanto, as 2 principais diferenças são o tipo de fonte de luz e o uso de elementos filtrantes especializados.

A microscopia de fluorescência requer uma fonte de luz muito poderosa, como uma lâmpada de arco de xenônio ou mercúrio como a mostrada aqui. A luz emitida pela lâmpada de arco de mercúrio é 10 a 100 vezes mais brilhante do que a maioria das lâmpadas incandescentes e fornece luz em uma ampla faixa de comprimentos de onda, do ultravioleta ao infravermelho. Essa fonte de luz de alta potência é a parte mais perigosa da configuração do microscópio de fluorescência, pois olhar diretamente para a luz não filtrada pode danificar seriamente suas retinas e o manuseio incorreto das lâmpadas pode fazer com que elas explodam.

O princípio por trás da microscopia de fluorescência é simples. À medida que a luz sai da lâmpada de arco, ela é direcionada através de um filtro excitador, que seleciona o comprimento de onda de excitação.

Essa luz é refletida em direção à amostra por um espelho especial chamado espelho dicróico, projetado para refletir a luz apenas no comprimento de onda de excitação. A luz refletida passa pela objetiva onde é focada na amostra fluorescente. As emissões da amostra são, por sua vez, repassadas através do objetivo ? onde ocorre a ampliação da imagem ?e agora através do espelho dicróico.

Essa luz é filtrada pelo filtro de barreira, que seleciona o comprimento de onda de emissão e filtra a luz contaminante da lâmpada de arco ou de outras fontes que são refletidas nos componentes do microscópio. Finalmente, a emissão fluorescente filtrada é enviada para um detector onde a imagem pode ser digitalizada ou é transmitida para a ocular para visualização óptica.

O filtro excitador, o espelho dicróico e o filtro de barreira podem ser montados juntos em um componente conhecido como cubo de filtro. Diferentes cubos de filtro podem ser alterados durante a visualização da amostra para alterar o comprimento de onda de excitação, e uma série de diafragmas pode ser usada para modificar a intensidade da excitação.

Quando se trata de realizar microscopia de fluorescência, o fluoróforo pode ser tão importante quanto o próprio microscópio, e o tipo de fluoróforo que está sendo fotografado determina o comprimento de onda de excitação usado e o comprimento de onda de emissão detectado. Os comprimentos de onda de excitação contêm uma pequena faixa de energias que podem ser absorvidas pelo fluoróforo e fazer com que ele faça a transição para um estado excitado. Uma vez excitado, uma ampla gama de emissões, ou transições de volta ao estado de energia mais baixo, são possíveis, resultando em um espectro de emissão.

A diferença entre o pico da absorção, ou curva de excitação, e o pico da curva de emissão é conhecida como Stoke's Shift. Quanto maior a distância nesse deslocamento, mais fácil é separar os dois comprimentos de onda diferentes. Além disso, qualquer espectro sobreposto precisa ser removido pelos componentes do cubo de filtro para reduzir o plano de fundo e melhorar a qualidade da imagem.

A exposição do fluoróforo à excitação prolongada fará com que ele fotobranqueie, que é um enfraquecimento ou perda de fluorescência. Para reduzir o fotobranqueamento, você pode adicionar um meio de montagem anti-desbotamento ao slide e selar as bordas com esmalte. O slide também deve ser mantido no escuro quando não estiver sendo fotografado.

Para iniciar a imagem de fluorescência, ligue a fonte de luz de xenônio ou mercúrio e deixe-a aquecer por até 15 minutos para que atinja uma iluminação constante.

Em seguida, coloque sua amostra no palco e prenda-a no lugar. Em seguida, ligue a fonte de luz branca do seu microscópio. Concentre-se em sua amostra usando a objetiva de menor potência, ajustando os botões de foco grosso e fino. Em seguida, use os botões de ajuste de estágio para encontrar sua área de interesse.

Em seguida, desligue a fonte de luz branca, bem como quaisquer luzes desnecessárias da sala para reduzir o fundo.

Selecione o cubo de filtro correto para o corante que você está criando e abra o obturador para iluminar sua amostra.

Por fim, faça ajustes finos de foco e direcione a luz de saída para a câmera de imagem. Você provavelmente precisará fazer ajustes no tempo de exposição para cada fluoróforo ou corante fluorescente diferente usado. No entanto, é importante manter o tempo de exposição constante ao comparar recursos com o mesmo corante em amostras diferentes.

Para obter imagens de vários corantes na mesma amostra, altere o cubo do filtro para corresponder a cada fluoróforo e registre a nova imagem.

Depois que cada corante na amostra foi fotografado, as imagens individuais podem ser sobrepostas e mescladas.

Muitos tipos diferentes de experimentos podem fazer uso de microscopia fluorescente e envolver diferentes tipos de fluoróforos Uma das aplicações mais comuns da microscopia fluorescente é a imagem de proteínas que foram marcadas com anticorpos que estão ligados ou "conjugados" a compostos fluorescentes.. Aqui, um anticorpo contra as proteínas de superfície da leptospira foi detectado usando um anticorpo secundário conjugado ao alexafluor-488, que fluoresce em verde quando excitado.

Outra maneira de destacar uma característica específica da fluorescência é integrar o código de uma proteína fluorescente, como a proteína fluorescente verde, ou GFP, no DNA de um organismo. O gene para GFP foi originalmente isolado de água-viva e pode ser expresso, ou produzido, por células cultivadas em resposta a gatilhos específicos ou como parte de um tipo de célula específico, como as células tumorais mostradas brilhando nesta imagem

Outra aplicação da imagem de fluorescência é a Microscopia de Manchas de Fluorescência, que é uma tecnologia que usa conjuntos macromoleculares marcados com fluorescência, como a rede de F-actina vista aqui, estudar a cinética de movimento e renovação desta importante proteína do citoesqueleto.

Uma técnica avançada conhecida como recuperação de fluorescência após fotobranqueamento, ou FRAP, é realizada por fotobranqueamento intencional de uma pequena região de uma amostra para monitorar a taxa de difusão de moléculas marcadas com fluorescência de volta à região fotobranqueada.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à Microscopia de Fluorescência.

Neste vídeo, aprendemos sobre o conceito de fluorescência, como a microscopia de fluorescência difere da microscopia de luz e como obter uma imagem de fluorescência através do osciloscópio. Também aprendemos sobre algumas aplicações básicas e avançadas que usam fluorescência. Obrigado por assistir e não se esqueça de que, embora o fotobranqueamento fique ótimo em seus dentes, não é tão bom para suas amostras.