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Introdução à Microscopia de Fluorescência

Introduction to Fluorescence Microscopy

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Introduction to Fluorescence Microscopy

1.11: Histological Sample Preparation for Light Microscopy

1.13: Introduction to Light Microscopy

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09:22 min

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April 30, 2023

Overview

A microscopia de fluorescência é uma ferramenta analítica muito poderosa que combina as propriedades de ampliação da microscopia leve com visualização da fluorescência. Fluorescência é um fenômeno que envolve absorção e emissão de uma pequena gama de comprimentos de onda de luz por uma molécula fluorescente conhecida como fluoróforo. A microscopia de fluorescência é realizada em conjunto com o microscópio básico de luz pela adição de uma poderosa fonte de luz, filtros especializados e um meio de rotular fluorescentemente uma amostra. Este vídeo descreve os princípios básicos por trás da microscopia de fluorescência, incluindo o mecanismo da fluorescência, a mudança do Stoke e o fotobleaching. Também dá exemplos das inúmeras maneiras de rotular uma amostra fluorescente, incluindo o uso de anticorpos e proteínas fluorescentes marcadas, corantes fluorescentes de ácido nucleico com, e a adição de proteínas naturalmente fluorescentes a um espécime. Os principais componentes do microscópio de fluorescência, incluindo uma fonte de luz de xenônio ou mercúrio, filtros de luz, o espelhodicróico e o uso do obturador para iluminar a amostra são descritos. Finalmente, exemplos de algumas das muitas aplicações para microscopia de fluorescência são mostrados.

Procedure

Fluorescência é um fenômeno que ocorre quando uma substância absorve a luz em um determinado comprimento de onda e emite luz em outro comprimento de onda. A fluorescência ocorre como um elétron, que tem sido animado para um estado de energia mais alto e mais instável, relaxa para seu estado terrestre e emite um fóton de luz. A luz responsável pela excitação, ou mover o elétron para um estado de maior energia, é de comprimento de onda mais curto e maior energia do que a emissão de fluorescência, que tem um comprimento de onda mais longo, menor energia e cores diferentes.

A microscopia de fluorescência combina as propriedades de ampliação do microscópio leve com a tecnologia de fluorescência que permite a excitação e detecção de emissões de compostos químicos fluorescentes. Com a microscopia de fluorescência, os cientistas podem observar a localização de tipos celulares específicos dentro de tecidos ou moléculas dentro das células.

Os principais componentes do microscópio fluorescente se sobrepõem muito com o microscópio de luz tradicional. No entanto, as 2 principais diferenças são o tipo de fonte de luz e o uso dos elementos especializados do filtro.

A microscopia de fluorescência requer uma fonte de luz muito poderosa, como uma lâmpada de xenônio ou arco de mercúrio como a mostrada aqui. A luz emitida da lâmpada do arco de mercúrio é 10-100 vezes mais brilhante que a maioria das lâmpadas incandescentes e fornece luz em uma ampla gama de comprimentos de onda, do ultravioleta ao infravermelho. Esta fonte de luz de alta potência é a parte mais perigosa da configuração do microscópio de fluorescência, pois olhar diretamente para a luz não filtrada pode danificar seriamente suas retinas e manusear mal as lâmpadas pode fazê-las explodir.

O princípio por trás da microscopia de fluorescência é simples. À medida que a luz sai da lâmpada de arco, ela é direcionada através de um filtro mais excitante, que seleciona o comprimento de onda de excitação.

Esta luz é refletida em direção à amostra por um espelho especial chamado espelho dicrómico, que é projetado para refletir a luz apenas no comprimento de onda de excitação. A luz refletida passa pelo objetivo onde está focada no espécime fluorescente. As emissões do espécime, por sua vez, são passadas de volta através do objetivo – onde ocorre a ampliação da imagem – e agora através do espelho dicroico.

Esta luz é filtrada pelo filtro de barreira, que seleciona para o comprimento de onda de emissão e filtra a luz contaminante da lâmpada do arco ou outras fontes que são refletidas fora dos componentes do microscópio. Finalmente, a emissão fluorescente filtrada é enviada para um detector onde a imagem pode ser digitalizada, ou é transmitida para a ocular para visualização óptica.

O filtro exciter, o espelho dicroico e o filtro de barreira podem ser montados juntos em um componente conhecido como cubo de filtro. Diferentes cubos de filtro podem ser alterados durante a visualização da amostra para alterar o comprimento de onda de excitação, e uma série de diaframas podem ser usados para modificar a intensidade da excitação.

Quando se trata de realizar microscopia de fluorescência, o fluoróforo pode ser tão importante quanto o microscópio em si, e o tipo de fluoróforo que está sendo imageado dita o comprimento de onda de excitação usado e o comprimento de onda de emissão detectado. Os comprimentos de onda de excitação contêm uma pequena gama de energias que podem ser absorvidas pelo fluoróforo e fazem com que ela transite para um estado animado. Uma vez animado, uma ampla gama de emissões, ou transições de volta para o estado de menor energia, são possíveis resultando em um espectro de emissões.

A diferença entre o pico da curva de absorção, ou excitação e o pico da curva de emissão é conhecida como Mudança de Stoke. Quanto maior a distância neste turno, mais fácil é separar os dois comprimentos de onda diferentes. Além disso, qualquer espectro sobreposto precisa ser removido pelos componentes do cubo do filtro para redução de fundo e melhor qualidade de imagem.

A exposição do fluoróforo à excitação prolongada fará com que ele fotobleach, que é um enfraquecimento ou perda de fluorescência. Para reduzir o fotobleaching, você pode adicionar um meio de montagem anti-fade ao slide e selar as bordas com esmalte. O slide também deve ser mantido no escuro quando não for imageado.

Para começar a imagem de fluorescência, ligue a fonte de luz de xenônio ou mercúrio e deixe-a aquecer por até 15 minutos para que ela atinja a iluminação constante.

Em seguida, coloque sua amostra no palco e fixe-a no lugar. Em seguida, ligue a fonte de luz branca do seu microscópio. Concentre-se na sua amostra usando o objetivo mais baixo, ajustando os botões de foco grosseiro e fino. Em seguida, use os botões de ajuste de estágio para encontrar sua área de interesse.

Em seguida, desligue a fonte de luz branca, bem como quaisquer luzes desnecessárias para reduzir o fundo.

Selecione o cubo de filtro correto para o corante que você está que está abrindo o obturador para iluminar sua amostra.

Por fim, faça ajustes finos de foco e direcione a luz de saída para a câmera de imagem. Você provavelmente precisará fazer ajustes no tempo de exposição para cada fluorohore diferente ou corante fluorescente usado. No entanto, é importante manter o tempo de exposição constante ao comparar características com o mesmo corante em diferentes amostras.

Para imaginar vários corantes na mesma amostra, altere o cubo do filtro para combinar com cada fluoróforo e registre a nova imagem.

Depois que cada corante da amostra foi imageado, imagens individuais podem ser sobrepostas e mescladas.

Muitos tipos diferentes de experimentos podem fazer uso de microscopia fluorescente e envolver diferentes tipos de fluoroforos Uma das aplicações mais comuns da microscopia fluorescente é a imagem de proteínas que foram rotuladas com anticorpos que estão ligados, ou “conjugados” a compostos fluorescentes.. Aqui, um anticorpo em direção às proteínas da superfície leptospiral foi detectado usando um anticorpo secundário conjugado ao alexafluor-488, que fluoresce verde quando animado.

Outra forma de destacar uma característica específica com fluorescência é integrar o código para uma proteína fluorescente como proteína fluorescente verde, ou GFP, no DNA de um organismo. O gene para GFP foi originalmente isolado de águas-vivas e pode ser expresso, ou produzido, por células cultivadas em resposta a gatilhos específicos ou como parte de um tipo específico de célula como as células tumorais mostradas brilhando nesta imagem

Outra aplicação da imagem de fluorescência é a Fluorescence Speckle Microscopy, que é uma tecnologia que usa conjuntos macromoleculares fluorescentes rotulados, como a rede F-actin vista aqui, para estudar o movimento e a cinética de rotatividade desta importante proteína citoesquelética.

Uma técnica avançada conhecida como recuperação da fluorescência após fotobleaching, ou FRAP, é realizada por fotobleaching intencionalmente uma pequena região de uma amostra, a fim de monitorar a taxa de difusão de moléculas fluorescentes rotuladas de volta para a região fotobleachada.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à Microscopia de Fluorescência.

Neste vídeo aprendemos sobre o conceito de fluorescência, como a microscopia de fluorescência difere da microscopia leve e como tirar uma imagem de fluorescência através do escopo. Também aprendemos sobre algumas aplicações básicas e avançadas que usam fluorescência. Obrigado por assistir e não se esqueça enquanto fotobleaching fica ótimo em seus dentes não é tão bom para suas amostras.

Transcript

Fluorescence is a phenomenon that takes place when a substance absorbs light at a given wavelength and emits light at another wavelength. Fluorescence occurs as an electron, which has been excited to a higher, and more unstable energy state, relaxes to its ground state and gives off a photon of light. The light that is responsible for excitation, or moving the electron to a higher energy state, is of shorter wavelength and higher energy than the fluorescence emission, which has a longer wavelength, lower energy, and different color.

Fluorescence microscopy combines the magnifying properties of the light microscope with fluorescence technology that allows the excitation of- and detection of emissions from- fluorophores – fluorescent chemical compounds. With fluorescence microscopy, scientists can observe the location of specific cell types within tissues or molecules within cells.

The main components of the fluorescent microscope overlap greatly with the traditional light microscope. However the 2 main differences are the type of light source and the use of the specialized filter elements.

Fluorescence microscopy requires a very powerful light source such as a xenon or mercury arch lamp like the one shown here. The light emitted from the mercury arc lamp is 10-100 times brighter than most incandescent lamps and provides light in a wide range of wavelengths, from ultra-violet to the infrared. This high-powered light source is the most dangerous part of the fluorescence microscope setup as looking directly into unfiltered light can seriously damage your retinas and mishandling the bulbs can cause them to explode.

The principle behind fluorescence microscopy is simple. As light leaves the arc lamp it is directed through an exciter filter, which selects the excitation wavelength.

This light is reflected toward the sample by a special mirror called a dichroic mirror, which is designed to reflect light only at the excitation wavelength. The reflected light passes through the objective where it is focused onto the fluorescent specimen. The emissions from the specimen are in turn, passed back up through the objective – where magnification of the image occurs –and now through the dichroic mirror.

This light is filtered by the barrier filter, which selects for the emission wavelength and filters out contaminating light from the arc lamp or other sources that are reflected off of the microscope components. Finally, the filtered fluorescent emission is sent to a detector where the image can be digitized, or it’s transmitted to the eyepiece for optical viewing.

The exciter filter, dichroic mirror, and barrier filter can be assembled together into a component known as the filter cube. Different filter cubes can be changed during specimen viewing to change the excitation wavelength, and a series of diaphrams can be used to modify the intensity of excitation.

When it comes to performing fluorescence microscopy, the fluorophore can be just as important as the microscope itself, and the type of fluorophore being imaged dictates the excitation wavelength used and emission wavelength that’s detected. The excitation wavelengths contain a small range of energies that can be absorbed by the fluorophore and cause it to transition into an excited state. Once excited, a wide range of emissions, or transitions back to the lower energy state, are possible resulting in an emission spectrum.

The difference between the peak of the absorption, or excitation curve and the peak of the emission curve is known as Stoke’s Shift. The greater the distance in this shift, the easier it is to separate the two different wavelengths. Additionally, any overlapping spectrum needs to be removed by the components of the filter cube for reduced background and improved image quality.

Exposure of the fluorophore to prolonged excitation will cause it to photobleach, which is a weakening or loss of fluorescence. To reduce photobleaching, you can add an anti-fade mounting medium to the slide and seal the edges with nail polish. The slide should also be kept in the dark when not being imaged.

To begin fluorescence imaging, turn on the xenon or mercury light source and allow it to warm up for as long as 15 minutes in order for it to reach constant illumination.

Next, place your sample on the stage and secure it in place. Then, turn on the white light source of your microscope. Focus on your sample using the lowest powered objective by adjusting the coarse and fine focus knobs. Then, use the stage adjustment knobs to find your area of interest.

Next, turn off the white light source, as well as any unnecessary room lights to reduce background.

Select the correct filter cube for the dye you are imaging and open the shutter to illuminate your sample.

Finally, make fine focus adjustments and direct the output light to the imaging camera. You will likely need to make adjustments to the exposure time for each different fluorophore or fluorescent dye used. However, it is important to keep the exposure time constant when comparing features with the same dye on different samples.

To image multiple dyes on the same sample, change the filter cube to match each fluorophore and record the new image.

After each dye in the sample has been imaged, individual images can be overlaid and merged.

Many different types of experiments can make use of fluorescent microscopy and involve different types of fluorophores One of the most common applications of fluorescent microscopy is the imaging of proteins that have been labeled with antibodies that are attached to, or “conjugated” to fluorescent compounds.. Here, an antibody towards leptospiral surface proteins was detected using a secondary antibody conjugated to alexafluor-488, which fluoresces green when excited.

Another way to highlight a specific feature with fluorescence is to integrate the code for a fluorescent protein such as green fluorescent protein, or GFP, into the DNA of an organism. The gene for GFP was originally isolated from jellyfish and can be expressed, or produced, by cultured cells in response to specific triggers or as part of a specific cell type like the tumor cells shown glowing in this image

Another application of fluorescence imaging is Fluorescence Speckle Microscopy which is a technology that uses fluorescently labeled macromolecular assemblies such as the F-actin network seen here, to study movement and turnover kinetics of this important cytoskeletal protein.

An advanced technique known as Fluorescence recovery after photobleaching, or FRAP, is performed by intentionally photobleaching a small region of a sample in order to monitor the diffusion rate of fluorescently labeled molecules back into the photobleached region.

You’ve just watched JoVE’s introduction to Fluorescence Microscopy.

In this video we learned about the concept of fluorescence, how fluorescence microscopy differs from light microscopy, and how to take a fluorescence image through the scope. We also learned about some basic and advanced applications that use fluorescence. Thanks for watching and don’t forget while photobleaching looks great on your teeth it’s not so good for your samples.