Implementação da braçadeira dinâmico com Condutâncias Synaptic e Artificial em células ganglionares da retina do rato

O objetivo geral do experimento a seguir é investigar os efeitos das mudanças na proporção e no tempo relativo das entradas sinápticas excitatórias e inibitórias na atividade de pico dos neurônios usando células ganglionares da retina como neurônios modelo. Isso é conseguido remendando o corpo celular de uma célula ganglionar em uma retina de montagem inteira, usando uma pipeta de vidro preenchida com uma solução intracelular que se assemelha à composição iônica fisiológica e amarelo de Lúcifer para identificar morfologicamente o tipo de célula como uma segunda etapa usando grampo dinâmico, um conjunto de formas de onda de condutância excitatória e inibitória são injetadas no corpo celular, que produzem uma mudança no potencial de membrana como resposta. Em seguida, várias formas de onda de condutância obtidas de experimentos fisiológicos em condições de controle ou na presença de drogas são injetadas no corpo celular para obter as respostas neuronais correspondentes.

Os resultados mostram os efeitos de mudanças na razão de excitação e inibição na atividade de pico das células ganglionares da retina com base na injeção de correntes compostas de condutâncias excitatórias e inibitórias por meio de registros dinâmicos de grampo. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como grampo de corrente ou grampo de tensão, é que ela fornece uma ferramenta interativa pela qual a razão e o tempo relativo das condutâncias sinápticas excitatórias e inibitórias podem ser injetados nos neurônios para investigar a influência nas respostas celulares. Essa metodologia pode fornecer informações sobre a função dos circuitos da retina, bem como de quaisquer outras redes neuronais no sistema nervoso central.

Comece este procedimento configurando o sistema de reperfusão com 250 mililitros do meio de miras carboxioxigenadas na configuração eletrofisiológica. Em seguida, espalhe uma fina camada de graxa a vácuo uniformemente no fundo da câmara de perfusão. Sele-o com uma lamínula e certifique-se de que esteja hermético.

Em seguida, coloque uma pequena quantidade de graxa nas extremidades superior e inferior da câmara. A graxa manterá a grade no lugar e evitará que ela pressione a retina com muita força. Agora fixe a câmara na plataforma e alinhe as duas aberturas depois disso.

Sacrifique um animal por luxação cervical após ser anestesiado com flúor. Remova rapidamente os olhos com uma pequena tesoura curva. Lave-os bem com fluido extracelular oxigenado em um pequeno béquer e coloque-os em uma placa de Petri cheia de fluido extracelular oxigenado com carro.

Sob o microscópio de dissecação, faça um orifício de inserção usando uma agulha de calibre 19 na córnea a cerca de dois milímetros da borda de ambos os olhos. Este passo importante deve ser rápido para permitir a oxigenação de ambas as rédeas. Depois disso, remova uma córnea com uma pequena tesoura de íris cortando paralelamente à sua borda.

Em seguida, remova a íris e o cristalino com uma pinça fina e repita os procedimentos para o outro olho. Transferir uma ocular para um copo contendo a solução extracelular oxigenada da carbox. Com a lâmina do bisturi, corte uma ocular ao meio, separe suavemente a retina do epitélio pigmentar usando uma sonda de dissecação romba ou puxando-a suavemente.

Em seguida, segure a borda do tecido retiniano descolamento perto da aura Serta com um par de pinças finas e agarre a aura serta com outro par de pinças finas. Puxe-o em direção ao centro da retina. Este é um processo delicado e pode levar algumas tentativas.

Se for bem-sucedido, a aura Serta, o corpo ciliar e o humor vítreo serão removidos e a curvatura da retina será reduzida. Em seguida, apare as bordas e transfira a retina para a câmara de perfusão com as células ganglionares voltadas para cima. Segure o tecido no lugar colocando a grade nas bolas de graxa.

Guarde o tecido restante com a outra ocular na solução extracelular oxigenada da carbox para uso posterior, monte a câmara de registro sob um microscópio vertical. Ajuste imediatamente a perfusão contínua da retina com solução extracelular oxigenada de carbox A uma taxa de três a cinco mililitros por minuto a 35.5 graus Celsius, certifique-se de que o eletrodo de aterramento esteja no lugar. Agora ligue a fonte de luz do microscópio e traga seu foco para os corpos celulares das células ganglionares através do 40 x da objetiva.

Localize o centro do suporte do orifício para gravação. Nesta etapa, fixe uma pipeta de vidro de cinco a oito mega ohms em seu suporte e mova-a sob o microscópio usando um manipulador micrométrico sob uma objetiva de 40 x. Abaixe lentamente a pipeta até que ela faça uma pequena covinha na superfície da membrana limitante interna.

Avance cuidadosamente a pipeta para frente até que ela pegue uma pequena quantidade de tecido e, em seguida, mova-a para cima e/ou para os lados para abrir um pequeno orifício para expor os corpos celulares das células ganglionares. Agora encha uma pipeta limpa com oito a 10 microlitros, uma solução intracelular à base de potássio com amarelo de Lúcifer. Insira-o no suporte, conectado ao cabeçote do amplificador stage e certifique-se de que o eletrodo de cloreto de prata clorado esteja submerso.

Selecione uma célula com um corpo celular grande. Abaixe lentamente a ponta da pipeta com pressão positiva para fazer uma pequena covinha na superfície da membrana. Em seguida, pare e solte a pressão para obter uma vedação giga.

Uma vez que uma vedação giga é alcançada, aplique suavemente pressão negativa para quebrar a membrana, a fim de obter uma configuração de grampo de remendo de célula inteira. Este procedimento é uma etapa delicada. Se muita pressão negativa for aplicada, a conexão fica com vazamento.

Se for muito pouco, a membrana permanece intacta. Com o tempo, o amarelo de Lúcifer preencherá a célula, permitindo a visualização da morfologia da célula, se estável. Essa configuração deve durar 30 minutos ou mais.

Agora realize um teste de tensão de corrente de menos 75 milivolts a 35 milivolts positivos a cada 10 milivolts usando o patch master e prossiga para testes posteriores. Somente se uma corrente de sódio maior que um nano ampere estiver presente. Em seguida, abra a visualização do laboratório e execute o programa neuro acuma escrito personalizado.

Defina o número de repetição como oito. Em seguida, defina os potenciais de reversão das condutâncias excitatória e inibitória em zero e menos 75 milivolts, respectivamente. Selecione um par correspondente de condutâncias excitatórias e inibitórias para teste e o traço de condutância excitatória verde e o traço de condutância inibitório vermelho aparecerão no painel inferior.

Depois disso, volte para o patch master e selecione o modo de grampo atual. Mude imediatamente o amplificador para corrente clamp modo em neuro acuma. Pressione o botão de gravação.

A resposta celular com explosão afásica de potenciais de ação aparecerá no painel superior. Em seguida, injete corrente na célula com baixa condutância. Primeiro, se pouca ou nenhuma resposta for observada, aumente a corrente em pequenos incrementos até que ela produza uma resposta forte.

A injeção excessiva de corrente pode matar a célula. Assim que os testes forem concluídos. Selecione um novo par de formas de onda de condutância e repita os procedimentos para todos os pares de condutâncias fisiológicas e artificiais.

Após a gravação, retraia cuidadosamente a pipeta para que o corpo celular permaneça intacto. Depois, fixe imediatamente o tecido e o formaldeído a 4% por 30 minutos, seguido de três lavagens de 10 minutos com tampão fosfato 0,1 molar, leve à geladeira e faça a coloração de anticorpos no dia seguinte ou dentro de uma semana, quando estiver pronto. Corar contra células ganglionares preenchidas com amarelo de Lúcifer à temperatura ambiente com um IgG primário de coelho amarelo anti-Lúcifer em uma diluição de um a 10.000 por cinco dias.

Então, no sexto dia, pernoitando com o secundário cabra anti coelho IgG, adicione uma diluição de um a 500 No final, monte a retina úmida em meio preservador fluorescente. Coloque a lamínula e sele com esmalte. Faça imagens confocais da morfologia celular usando um microscópio confocal Leica SPECT two.

Aqui estão as respostas de uma célula ganglionar à injeção de formas de onda de condutância excitatória e inibitória obtidas nos experimentos de controle indicados em verde e vermelho, respectivamente. E aqui estão as respostas à injeção de formas de onda de condutância registradas após a aplicação da tetrodatoxina no banho. Aqui estão as respostas de outra célula ganglionar a vários pares de braços de formas de onda de condutância.

As razões entre a condutância excitatória e a condutância inibitória foram alteradas de um para zero para um para dois. À medida que o grau de inibição aumentava, a resposta da célula diminuía, e aqui estão as respostas de uma célula ganglionar ao mesmo nível de excitação em que o início da inibição foi variado. Delta T representa a diferença de tempo entre o início das condutâncias inibitórias e excitatórias.

À medida que o atraso da inibição diminuiu, a resposta da célula tornou-se mais fraca. Este procedimento é uma técnica poderosa que ajuda a revelar as interações entre exci três e a entrada de sinap inibitória que gera a saída neuronal.