Determinação da taxa de transporte de xenobióticos e nanomateriais através da placenta usando o Ex vivo Modelo de perfusão da placenta humana

O objetivo geral deste procedimento é estudar o transporte de nanopartículas ou xenobióticos através da placenta usando o modelo de profusão placentária humana ex vivo. Isso é feito pela primeira canulação, uma artéria fetal e uma veia fetal da placenta imediatamente após o parto. Na segunda etapa, a placenta é fixada na câmara de perfusão.

Cânulas rombas são então introduzidas no espaço interviloso do lado materno e um único tubo é instalado para retornar o dreno venoso. Em seguida, todo o sistema é enxaguado com meios de perfusão em uma circulação aberta para eliminar o sangue restante e permitir que o tecido se recupere da fase isquêmica após o parto. Na etapa final, os dois circuitos são fechados e as nanopartículas marcadas com fluorescência ou o xeno biótico de interesse são adicionados à circulação materna.

Por fim, as amostras da circulação fetal e materna obtidas durante as seis horas de perfusão podem ser analisadas quanto à concentração das nanopartículas ou xeno biótico de interesse medindo a fluorescência. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como experimentos com animais ou modelos de cultura de células, é que os estudos de transporte placentário podem ser feitos em um órgão completo e diretamente no tecido humano, o que é especialmente importante para a placenta, pois a anatomia do tecido é muito forte entre diferentes espécies. Após a configuração do sistema de profusão composto por um banho-maria, uma câmara de profusão, duas colunas para oxigenação, duas bombas peristálticas, dois coletores de bolhas, dois aquecedores de fluxo e um sensor de pressão.

Conecte esses componentes com seções de tubulação compostas de cloreto de polivinila de acordo com este esquema. Em seguida, ligue o banho-maria, os aquecedores de fluxo e o aquecimento da câmara de perfusão. Como o meio de perfusão está pré-aquecendo no banho-maria consecutivamente, enxágue os sistemas arteriais dos circuitos fetal e materno a uma taxa de fluxo de 15 a 20 mililitros por minuto.

Em seguida, conecte a cânula fetal ao tubo arterial fetal e enxágue os sistemas arteriais dos circuitos fetal e materno com meio de perfusão pré-aquecido até que todos os tubos contenham meio. Enquanto os tubos estão enchendo, encha as armadilhas de bolhas, remova todas as bolhas a jusante da armadilha e, em seguida, pare as bombas. Agora ligue o fluxo de gás e inicie a gravação do sensor de pressão.

A canulação da placenta é uma etapa crítica durante a perfusão. Cada pequena ruptura no tecido pode levar a um vazamento entre a circulação materna e fetal. Portanto, trabalhe com cuidado Depois de obter a placenta intacta de gestações a termo sem complicações.

Após a cesariana primária, selecione uma co-leadina intacta na zona marginal da placenta sem rupturas visíveis no lado materno. Encontre a mesma co-leadina no lado fetal. Na placa coriônica, amarre os dois ramos da artéria e da veia umbilical, que suprem a co-leadina escolhida a montante do local de canulação posterior.

Comece colocando uma sutura ao redor da artéria fetal na placa coriônica. Em seguida, segurando o vaso com uma pinça. Corte a artéria com cuidado e coloque a pequena cânula na artéria.

Amarre a sutura com dois nós usando uma cânula maior. Prossiga com a veia fetal da mesma maneira. Em seguida, ligue a bomba fetal e aumente lentamente o fluxo até quatro mililitros por minuto.

O sangue deve emanar da cânula da veia fetal e a pressão na artéria fetal não deve exceder 70 milímetros de mercúrio. Em seguida, coloque a placenta no suporte de tecido com o lado fetal para cima e puxe a membrana placentária e o tecido sobre os espinhos. A co-leadina perfundida deve estar no meio do orifício no porta-lenços.

Em seguida, usando uma membrana de silicone, estabilize o tecido onde apenas a membrana segura a placenta. Agora monte o porta-lenços completo. Certifique-se de que as cânulas venosas e arteriais não estejam comprimidas, mas sim nos pequenos canais do suporte de tecido.

Em seguida, aperte os parafusos e apare qualquer tecido saliente. O suporte de tecido placentário agora está totalmente montado. Em seguida, vire o porta-lenços de cabeça para baixo.

Coloque-o na câmara de perfusão e cubra a câmara. Confirme se o circuito fetal ainda está intacto e se a mídia está fluindo para fora do tubo da veia fetal. Agora ligue a bomba materna.

Em seguida, introduza as três cânulas rombas na extremidade do tubo da artéria materna no espaço interviloso, penetrando na placa decidual. Para retornar o Perfuse oito ao circuito materno, coloque um tubo conectado à bomba materna na posição mais baixa na parte superior da câmara de perfusão para atuar como dreno venoso. Em seguida, conecte a cânula da veia fetal ao tubo da veia fetal para permitir que o tecido se recupere do período isquêmico após o parto e para liberar o sangue no espaço interviloso.

Lave os vasos maternos e fetais com meios de perfusão por 20 minutos, coletando o fluxo venoso fetal e materno em uma garrafa. Para avaliar a integridade da perfusão, realizar outra pré-fase de 20 minutos em circuito fechado utilizando dois reservatórios separados com meios de perfusão para os circuitos fetal e materno. Feche os circuitos conduzindo o fluxo venoso fetal de volta para o reservatório fetal e o fluxo venoso materno de volta para o reservatório materno.

Para o experimento de perfusão principal, prepare dois frascos com 120 mililitros, cada um de meio de perfusão para o reservatório materno e o reservatório fetal. Adicione o anti-pireno marcado com rádio e o xeno biótico ou nanopartículas marcados com fluorescência desejados ao frasco para o reservatório materno e misture o perfu materno oito. Bem, finalmente comece o experimento trocando os meios de perfusão puros pelos dois frascos preparados.

O volume do reservatório fetal e materno deve permanecer igual durante as seis horas de perfusão. Uma perda de volume fetal superior a quatro mililitros por hora indica um vazamento e a perfusão deve ser interrompida. A taxa de sucesso de uma perfusão por seis horas sem vazamento é de cerca de 15 a 20% Neste primeiro gráfico, os perfis de perfusão de pequenas partículas de poliestireno de 80 nanômetros, que foram transportadas através da placenta em comparação com partículas maiores de poliestireno de 500 nanômetros que não foram transferidas para o compartimento fetal, são mostrados para nanopartículas de poliestireno.

A transferência placentária é dependente do tamanho após três horas de perfusão da placenta, já 20 a 30% das partículas de poliestireno de 80 nanômetros adicionadas inicialmente foram transferidas do circuito materno para o fetal, enquanto as partículas de poliestireno de 500 nanômetros não apareceram no circuito fetal, mesmo após seis horas de perfusão. O antipireno é uma pequena molécula lipofílica que é distribuída sobre a barreira placentária por difusão passiva e serve como controle para a integridade dos circuitos. Após quatro a seis horas de perfusão, o equilíbrio entre a concentração de antipira fetal e materna deve ser construído para avaliar e comparar a taxa de transporte placentário de xenobióticos.

A razão de concentração de drogas fetal para materna geralmente é exibida aqui. Um perfil de perfusão característico do anti-pyne marcado com rádio é representado através da análise da produção de hormônios placentários, bem como do consumo de glicose e produção de lactato. A viabilidade e a funcionalidade do tecido placentário durante a perfusão podem ser monitoradas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma perfusão placentária humana ex vivo, que é um método válido e confiável para prever a passagem in vivo de várias substâncias endógenas e exógenas.