Name: O Flybar: Administração álcool para Moscas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Aprenda a medir comportamentos induzidos por álcool em Drosophila usando um protocolo acessível para pesquisa de graduação. Este método explora ritmos circadianos e sensibilidade genética ao álcool em moscas.

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O financiamento para esta pesquisa foi fornecido por um programa em Neurociências Prêmio da Florida State University College of Medicine e apoio do Departamento de Ciências Biológicas da FSU. Financiamento adicional foi fornecida por um Grant-in-Aid do Fundo de Investigação do Álcool Bebidas Fabricante.

1. Assembleia da Flybar Fundamentação e visão geral: O sistema é projetado para administrar porcentagens controladas de vapor de álcool às moscas. Nota: A Figura 1 fornece uma visão esquemática do Flybar set-up, conforme descrito abaixo em três etapas (montagem do fluxo de ar, set-up do álcool e garrafas de água, e montagem dos frascos de observação). Em suma, um fluxo de ar constante é dividido em duas frações que são borbulhar álcool e água, respectivamente, misturados e administrados a 4 frascos de observação. <ol><li> Assembleia da Airflow <ol><li> Conecte um pequeno pedaço de tubo de silicone flexível a qualquer edifício de ar ou um aerador de aquário para gerar um fluxo de ar consistente e divisão por meio de conector y. Ligue o primeiro ramo do regulador de fluxo de ar que controla a quantidade total de ar através do sistema (normalmente de 1.000 ml / min durante 4 frascos de observação). </li><li> Insira um conector de engate rápido no segundo tubode modo que o fluxo de ar pode ser interrompido no começo do ensaio, sem afectar o fluxo de ar calibrado. Adicionar um conector y e conectar cada tubo de ramificação para o regulador de fluxo de ar. </li><li> Conecte tubulação para os reguladores de fluxo de ar e, em seguida, conectar dois metros de fluxo de ar. </li></ol></li><li> Set-up das garrafas de álcool e água <ol><li> Adicionar tubo flexível para a saída dos medidores de fluxo de ar e inserir um tubo de vidro fino (secções de 1 ml de pipetas de vidro) com um ângulo de 90 ° para dentro da extremidade de cada troço de tubo. Isto servirá como o fluxo de ar de entrada para as garrafas de água e álcool. </li><li> Coloque tampas de borracha com 2 buracos através deles para as garrafas cheias de álcool e água. Manter ambos os frascos a uma temperatura constante da temperatura de 2 ° C acima da temperatura do ar ambiente, utilizando um banho de água. Nas nossas experiências, o quarto meio ambiente é mantida a 25 ° C, enquanto que o banho de água é a 27 ° C. </li><li> Insira a pipeta de vidro direto para o umri admissão através da rolha de borracha e se estender para o fluido até cerca de 1 cm a partir do fundo da garrafa. </li><li> Insira uma secção em cotovelo de uma pipeta de vidro para dentro do buraco remanescente na rolha de borracha até à extremidade do vidro é nivelada com o fundo da rolha para dentro da garrafa. Insira esta saída de ar em outro comprimento da tubulação. </li><li> Reunir as correntes de ar usando um conector-Y e usar um outro comprimento de tubagem de silicone para dirigir o fluxo de ar através de um frasco de mistura vazio ou garrafas com secções de pipetas de vidro dobradas inseridos através de uma rolha de borracha de dois furos. Use outro pedaço de tubo de silicone para a corrente de ar misturado tomada. </li></ol></li><li> Assembleia da Observação Vial <ol><li> Dividir a corrente de ar de saída que emerge a partir da mistura de frasco 2-3x obter quatro ou oito fluxos de ar mais pequenas, de modo que vários frascos de observação pode ser utilizado em cada experiência. Conecte o tubo de silicone flexível para os frascos de observação. </li><li> Configure o observatiem frascos utilizando frascos vazios fechados com uma rolha de borracha que contém dois orifícios através dos quais os tubos de vidro proporcionam uma entrada e uma saída para o vapor de álcool. </li><li> Cobrir a extremidade do primeiro tubo de vidro com rede e manter a rede no lugar, usando uma pequena peça de tubagem de plástico flexível. Inserir este tubo através do primeiro furo, até que se estende até cerca de metade do comprimento do tubo. Se necessário, use fita de teflon para obter um ajuste confortável. </li><li> Insira o segundo tubo de vidro também com o fim coberto por compensação até que ela fique nivelada com a borda interna da tampa de borracha. </li><li> Colocar os tubos na horizontal em um pedaço de papel branco para maximizar o contraste com as moscas sob fracas condições de luz vermelha. </li><li> Misture fracções apropriadas da corrente de ar borbulhada através de álcool e a corrente de ar borbulhada através de água. Monitorar a pressão de ar de forma contínua e fazer os ajustes necessários para manter a mistura desejada dos fluxos de ar. Nota: O funcionamento contínuode vários ensaios Fly Bar em paralelo ou mesmo um único ensaio em uma pequena sala pode levar a uma acumulação considerável de vapor de álcool. Para evitar a libertação contínua de vapor de álcool que pode potencialmente afetar o pesquisador em uma sala fechada, um sistema adequado precisa ser colocado no lugar que remove adequadamente vapor de álcool gerado durante o experimento. Para remover vapores de álcool, ligar um pedaço de tubo de 6-12 polegadas para o segundo tubo de vidro salientes de cada frasco, e empacotá-los directamente para um sistema de vácuo em forma de funil. Os investigadores devem também assegurar que a sala de ensaio experimental é adequadamente ventilado. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de Animais Experimentais Fundamentação e visão geral: a cultura adequada e habitação das moscas vai reduzir a variabilidade nos dados. Isto é conseguido através da normalização e minimização do esforço experimentado pelas moscas. Por esse motivo, sem anestesia (CO 2 ou alternativas) é usado during de qualquer um dos seguintes passos do protocolo. Além disso, as moscas deve ser a mesma faixa etária em todo experiências e pontos de tempo para minimizar a variabilidade como é padrão para outras análises comportamentais, incluindo experiências de aprendizagem e memória 17. Luz diferente: condições de escuridão pode ser usado para sondar a função do relógio circadiano em resposta comportamental de etanol. Para determinar se um ritmo diurno existe, os experimentos podem ser realizados no âmbito de um ciclo LD definido para medir o desempenho em específico Zeitgeber Times (ZT). ZT 0 representa madrugada e é definido como o tempo de luzes acesas em ciclos LD, enquanto ZT 12 é as luzes de tempo estão desligados com um ciclo CE 12:12 h. Sob as condições constantes, o tempo circadiano (CT) mede o tempo para que o animal, na ausência de sinais do ambiente, ou seja, o tempo de funcionamento livre, e é relacionada com o ciclo LD arrastamento anterior. Em tipo selvagem Drosophila, CT reflete a ZT anterior pela primeira vários diass em condições constantes como o período circadiano free-running e ritmos são ~ 24 horas. Para medir a modulação circadiano e eliminar efeitos de luz agudas sobre o comportamento, as moscas são arrastadas para claro e escuro e, em seguida, transferido para constantes condições de pouca luz (DD) antes de experimentos. Experimentos circadianos são realizadas no segundo dia de DD para medir o desempenho em específico circadiano Times (CT). Em Drosophila, luz contínua (LL) condições resultar em disfunção circadiana com oscilações moleculares umedecido ou abolida de genes circadianos centrais e perturbação dos ritmos circadianos comportamentais como evidenciado pela atividade locomotora arrítmico 18-21 e memória arrítmico de curto prazo 17. O protocolo é otimizado para estudos circadianos e pode ser simplificada para outros experimentos. Todos os experimentos circadianos são realizados utilizando pouca luz vermelha (sobrecarga ambiente luz vermelha &lt;1 lux em bancada; pequenas luzes vermelhas usadas em 12 polegadas de tubos~ 1 lux de luz). <ol><li> Traseiros as moscas a 25 ° C sob 0:12 hr luz: as condições de arrastamento escuros (LD). </li><li> Recolhe moscas recém eclosed no final do período de luz do dia, no dia 1 e armazená-los durante 24 horas sob condições de LD em segurando frascos contendo uma pequena quantidade de alimento de alto concentração agar, para minimizar a viscosidade dos alimentos. Nota: Para garantir saudáveis, moscas normalmente desenvolvidos são coletados, apenas usar moscas coletadas nos primeiros dias após a eclosão começa em um frasco de cultura. </li><li> Recolhe lotes de cerca de 30 (25-35) opera através de um aspirador no dia 2, para o fim do período de luz, e transferência para ampolas de detenção frescos. </li><li> Use uma fonte de luz forte para dirigir moscas até o final do frasco. Dentro desta gama, o número exacto de moscas em cada frasco não é crítica como as observações comportamentais são relatados em percentagem com o número total de moscas contadas no fim de cada experiência. </li><li> Manter moscas sob condições DD a 25 ° C for dois dias. </li><li> No dia da experiência, coloca todas as moscas alojados em condições diferentes ou outras do que o quarto comportamento experimental no ambiente durante, pelo menos, 1 hora antes da experiência incubadoras. Aclimatação reduz a variabilidade devido a mudanças na temperatura ou umidade. </li><li> Fazer observações em pontos de tempo de seis por dia (CT 1, 5, 9, 13, 17 e 21), a fim de testar a modulação do comportamento circadiano. </li><li> Compare vários pontos de tempo dentro de um único conjunto de experimentos comportamentais para aumentar a robustez do desenho experimental e minimizar a variabilidade específica para um único experimento. Por exemplo, observações de um CT e CT 13 podem ser obtidos simultaneamente se duas incubadoras com horários claro-escuro opostos são usados ​​para o arrastamento. Nota: O procedimento anterior descreve a preparação dos animais experimentais para ensaios realizados em condições de escuridão constante circadiano. Luz diferente: condições de escuridão pode ser usado para sondar a função do relógionas respostas comportamentais ao álcool. Para determinar se existe um ritmo diurno os experimentos podem ser realizados no âmbito de um ciclo de LD para medir o desempenho em específico Zeitgeber Times (ZT). Além disso, o protocolo pode ser utilizado com moscas criadas sob condições de luz constante para testar experimentos disfunção circadiano. Para protocolos alternativos que testam moscas alojados em condições de luz, ensaios comportamentais ainda deve ser realizado sob condições de pouca luz. Moscas devem ser transferidas para o escuro durante 1 hora antes da experiência, para minimizar a variabilidade comportamental devido aos efeitos agudos de luz sobre o comportamento. </li></ol> 3. Observações comportamentais Fundamentação e visão: O seguinte protocolo de administração de álcool é otimizado para observações sob fraca condição de luz vermelha. O Lorr duas medidas comportamentais e sedação representam dois pontos distintos de mosca embriaguez. Lorr representa um ponto final de embriaguez incorporando a perda of do motor e controle postural, que as medidas de sedação um ponto final muito tarde de intoxicação. Genótipo ou modulação circadiano podem afetar estas duas medidas de forma diferente; portanto, pode-se desejar examinar ambos. Em suma, as moscas são carregados nos frascos, o número de moscas que exibem Lorr ou sedação estão marcados a cada 5 min durante exposição ao vapor de álcool, e o número total de moscas contadas no fim da experiência. <ol><li> Antes de iniciar a experiência, executar o ar através do sistema (ar borbulhado através de garrafas de água e álcool), durante pelo menos 10 minutos e usar esse tempo para calibrar os fluxos de ar. </li><li> Desligue a liberação rápida para parar o fluxo de ar. Coloque as moscas nos frascos, e volte a ligar o fluxo de ar e iniciar os temporizadores. Nota: Se as moscas que não respondem ou moscas mortas são deixados nos frascos de retenção, isso pode ser um indicativo de condições de estresse. Em geral, estas condições podem ser aliviados, alojando menos moscas nos frascos que prendem ou diminuir a viscosidade de alimentos usando um ligeiroly maior concentração de ágar durante a preparação de alimentos. Para as análises comportamentais ideais e variabilidade mínima entre os experimentos, as moscas deve ser saudável antes de experimentos. </li><li> Para manter o tempo exato, utilize um cronômetro para controlar o tempo total de exposição ao álcool e usar um segundo temporizador de contagem de volta para marcar os 5 minutos de intervalo. </li><li> Coloque um pedaço de papel branco sob os frascos para aumentar o contraste e visibilidade voar, especialmente sob condições de iluminação vermelha. </li><li> Verifique o fluxo de ar regularmente durante um experimento para manter níveis constantes. Geralmente, uma vez que os fluxos de ar ter estabilizado, que se mantêm estáveis ​​durante a duração da experiência. </li><li> Contar o número de moscas que perderam o reflexo de endireitamento uma vez a cada 5 min por um período hr 1. Como a sensibilidade do álcool varia entre os genótipos e origens genéticas, pode ser desejável para realizar avaliações mais frequentes ou a realizar o ensaio para um longo período de tempo. </li><li> Levante a slightl frascoy a partir da superfície, e dirigir a luz a partir de uma lanterna de luz vermelha para o papel por detrás do frasco. Mantenha as lanternas de mão vermelho a uma distância de pelo menos 12 polegadas para o frasco experimental para manter os níveis de luz não superiores a 1 lux para todos os experimentos sob condições de iluminação vermelha. </li><li> Medir os níveis de luz usando um medidor de luz para estabelecer padrões para todos os experimentos. </li><li> Determinar o número de moscas que perderam o reflexo de endireitamento, aplicando um toque firme para o frasco e contar quantas moscas não conseguem endireitar-se dentro de aproximadamente 4 segundos. Moscas que exibem Lorr ainda pode mover as pernas e asas, mas não pode transformar-se em pé. </li><li> No fim da sessão, contar o número total de moscas em cada frasco. Nota: Às vezes, uma única mosca pode ser preso entre a tampa eo lado quando a carga voa para os frascos experimentais. Como isto é feito no escuro, pode não ser facilmente notado por isso, é necessário contar o total de dormenteser de moscas no fim da experiência para calcular corretamente percentagens. </li></ol> Além disso, este procedimento também pode ser utilizado para medir a sedação de moscas, que representa um ponto de extremidade de comportamento diferente. Enquanto moscas sedados perderam seu reflexo direito, sedação exige uma maior exposição ao álcool. Em termos de comportamento, a sedação pode ser caracterizado pela completa falta de atividade motora aparente com moscas permanecendo imóvel no frasco seguinte empresa aa torneira para o frasco. Para sedação, contar o número de moscas que permanecer imóvel sem perna balançando após a entrega de um toque firme do frasco. Além disso, o frasco pode ser rolado lado para o outro para determinar se as moscas individuais ainda mantêm o seu reflexo agarrando. 4. Análise de Dados <ol><li> Determinar a percentagem LORR em cada tempo avaliado com base no número total de moscas em cada frasco. </li><li> Estimativa diferenças entre momentos de tempo circadiano ou estirpes por calculating a Lorr 50% para cada amostra, que cai dentro da porção linear da curva sigmóide (veja a Figura 2 abaixo). </li><li> Estatísticas alternativas: <ol><li> Se as comparações entre genótipos são planejadas, é desejável para analisar todo o curso do tempo usando medidas repetidas ANOVAand para determinar o intervalo de pontos no tempo que as diferenças são significativas com testes post-hoc (Figura 3). Para estes testes, é preferível utilizar um valor de 0,001. Isso permite que as diferenças de tempos de exposição individuais a serem avaliadas, bem como as diferenças entre os genótipos na inclinação da curva. </li><li> As diferenças na sensibilidade para pode ser determinada por períodos específicos de exposição do álcool para uma resposta específica, tais como a sedação a partir da porção linear do gráfico (Figura 4). </li><li> As diferenças entre estirpes ou pontos de tempo circadiano pode ser estimada utilizando padrão F-estatísticas e testes post-hoc. </li></ol></li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os custos de abuso de álcool e alcoolismo para a sociedade é enorme, tanto em termos de custos humanos e econômicos 30,31 29. Drosophila como modelo oferece um sistema rápido e versátil para examinar rapidamente as respostas comportamentais de um grande número de indivíduos e, como tal, tem sido amplamente utilizado tanto para álcool 5,7,32-34 e pesquisa circadiano 35-37. Aqui, descrevemos um protocolo simples para a administração controlada de vapor...

Drosophila melanogaster demonstrar respostas comportamentais bifásicos ao álcool 1, que são análogas às respostas humanas a este fármaco 2,3. Após a exposição inicial a baixas concentrações de álcool, moscas apresentam aumento da atividade locomotora, substituído por uma falta de coordenação motora, a perda de controle postural e reflexos de endireitamento (perda do reflexo de endireitamento: Lorr) e sedação (completa falta de atividade motora em resposta a estimulação mecânica) como a exposição ao álcool progride 4-9. O relógio circadiano endógeno é um forte modulador de álcool sensibilidade e toxicidade, como observado em ratinhos, ratos 10,11 12, 13 e os seres humanos. Os recentes avanços na pesquisa Drosophila mostraram o relógio circadiano modula a sensibilidade aguda de álcool, mas não de álcool tolerância 1. As poderosas abordagens genéticas disponíveis em Drosophila através de estudos mutantes e manipulações transgênicas de espaciale expressão gênica temporal, fornecer um sistema que permite um progresso rápido na identificação dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes para comportamentos complexos. O uso de Drosophila como ferramenta de investigação tem permitido avanços substanciais na compreensão da neurobiologia de álcool que podem ser rapidamente convertidos em mamíferos 14-16. A fim de facilitar a compreensão dos mecanismos moleculares pelos quais o relógio circadiano modula a sensibilidade do álcool e para medir respostas comportamentais uniformemente em toda a pontos de tempo circadiano, um protocolo de administração do álcool apropriado para o uso em fracas condições de luz vermelha não é requerida. Para Drosophila, o álcool pode ser administrado por meio de suplementação alimentar para a exposição crônica ou de forma confiável através de administração de álcool na forma de vapor para exposições agudas. Aqui, descrevemos um protocolo de administração de álcool adequado para a avaliação da modulação circadiana da Loss-of-reflexo de endireitamento (Lorr) 1, bem comosedação. As moscas são arrastadas com 12 horas: 12 horas LD ciclos a uma temperatura constante e, em seguida, transferida para um regime de luz controlada durante 2-5 dias, dependendo da questão experimental. As moscas são expostas a vapor de etanol, em um aparelho conhecido como o Flybar. Neste dispositivo, quantidades controladas de ar são borbulhar na água e álcool; Os vapores são então misturados e dirigido para uma caixa de frasco, as moscas. Cada 5 min as moscas são marcados para o número que não consegue exibir corrigir reflexos ou tornaram-se sedado. Percentagens Lorr para cada ponto de tempo é calculado e comparado entre os pontos de tempo circadianos ou entre estirpes de moscas. A simplicidade e confiabilidade do fornecimento de álcool com a entrega de álcool Flybar combinado com opções de análise de comportamento proporciona um benefício significativo para os experimentos realizados circadianos em ambientes escuros.

<table><tbody><tr><td>Álcool 190 prova</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aerator</td><td>Loja</td><td></td> de animais local <td>Usamos tubos de silicone Whisper 60</td></tr><tr><td>1/8"</td><td>VWR</td><td>408060-0030</td><td></td></tr><tr><td>120&deg; Conector Y</td><td>VWR</td><td>82017-256</td><td></td></tr><tr><td>Desconexões rápidas</td><td>VWR</td><td>46600-048</td><td></td></tr><tr><td>Braçadeiras de tubo de plástico</td><td>Produtos Bell-art</td><td>132250000</td><td>Este ou o próximo</td></tr><tr><td>Regulador de ar miniatura</td><td>McMaster-Carr</td><td>8727K11</td><td>Este ou o anterior</td></tr><tr><td>Suporte de montagem do regulador de ar miniatura</td><td>McMaster-Carr</td><td>9891K66</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de vazão Gilmont tamanho 12</td><td>VWR</td><td>29895-242</td><td></td></tr><tr><td>Clipes</td><td>de ferramentas McMaster-Carr</td><td>1722A43</td><td>Para segurar medidores de vazão</td></tr><tr><td></td><td>Frasco VWR</td><td>89092-722</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de borracha com dois furos</td><td>VWR</td><td>59585-186</td><td>Cabe em frascos</td></tr><tr><td>Tubos de vidro Pyrex de 5 mm</td><td>Trikinetics</td><td>PGT5x65</td><td>Cabe melhor na rolha anterior</td></tr><tr><td>Fita de Teflon</td>Loja <td></td><td>de ferragens</td><td>Para conseguir um ajuste confortável nas rolhas, se necessário</td></tr><tr><td>Rolha de borracha com dois furos</td><td>VWR</td><td>59582-122</td><td>Serve para as nossas garrafas</td></tr><tr><td>Pipetas de vidro descartáveis</td><td>VWR</td><td>53283-768</td><td>Cortadas no comprimento e dobradas por aquecimento</td></tr><tr><td>Rede de nylon muito fina</td><td>VWR</td><td>Várias</td><td></td></tr><tr><td>lâmpadas de 15 watts</td><td>Loja</td><td></td> de ferragens <td>Luz vermelha</td></tr> <tr><td>no tetoFiltros</td><td></td><td></td><td></td>de luz seguros vermelhos</tr><tr><td>fotográficos Mini lanternas elétricas com filtros vermelhos</td><td>Mag-light</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

o flybar: administração álcool para moscas

The FlyBar: Administering Alcohol to Flies

Moscas de frutas (Drosophila melanogaster) são um modelo estabelecido para a pesquisa de álcool e biologia circadiano. Recentemente, mostramos que o relógio circadiano modula sensibilidade ao álcool, mas não a formação de tolerância. Aqui, descrevemos nosso protocolo em detalhe. O álcool é administrado às moscas usando flybar. Nesta configuração, o vapor de álcool saturado é misturado com o ar umidificado em proporções definidas e administradas às moscas em quatro tubos simultaneamente. As moscas são criadas sob condições padronizadas, a fim de minimizar a variação entre as repetições. Três dias de idade moscas de diferentes genótipos ou tratamentos são utilizados para os experimentos, de preferência por moscas de dois pontos diferentes de tempo (por exemplo, CT 5 e CT 17) fazendo comparações diretas possível combinar. Durante a experiência, as moscas são expostos durante 1 hora a percentagem pré-determinada de vapor de álcool e o número de moscas que exibem a perda do reflexo de endireitamento (LORR) ou sedção são contados a cada 5 min. Os dados podem ser analisados ​​utilizando-se três abordagens estatísticas diferentes. A primeira é a de determinar o tempo em que 50% das moscas têm perdido o reflexo de endireitamento e usar uma análise da variância (ANOVA) para determinar se existem diferenças significativas entre pontos de tempo. O segundo é o de determinar as moscas percentuais que mostram Lorr após um determinado número de minutos, seguido de uma análise ANOVA. O último método é analisar toda a série vezes utilizando estatística multivariada. O protocolo também pode ser usado para as experiências não circadianos ou comparações entre genótipos.

Modulação circadiano de Álcool Sensibilidade usando o Lorr 50% como um marcador. Um exemplo representativo, mostrando a modulação circadiana na sensibilidade do álcool durante o dia é apresentada na Figura 2. LORR foi medida a seis pontos de tempo durante o 2o dia de DD em Canton-S e a 50% LORR foi determinada para cada ponto de tempo. A análise mostrou um efeito significativo da hora do dia (ANOVA: F 5,45 = 7.39, p &lt;0,001, N = 6-10 por temp...

Drosophila surgiu como um sistema modelo importante para dissecar as bases celulares e moleculares de respostas comportamentais ao álcool. Aqui é apresentado um protocolo para a recolha de dados de sensibilidade do álcool em um contexto circadiano que pode ser facilmente aplicado a outros ensaios e é bem adequada para a pesquisa de graduação.

O Flybar: Administração álcool para Moscas

Fruit flies (Drosophila melanogaster) are an established model for both alcohol research and circadian biology. Recently, we showed that the circadian ...

O objetivo geral deste procedimento é medir comportamentos induzidos pelo álcool em Drosophila, utilizando um equipamento de baixo custo e de fácil montagem, ideal para pesquisas de graduação ou pesquisadores novos em estudos circadianos. Isso é realizado primeiramente montando a barra de moscas, permitindo comparações simultâneas de múltiplos grupos de moscas.O próximo passo do procedimento é cultivar drosófilas em ciclos luz-escuro específicos e coletar moscas de idades correspondentes para o experimento. Em seguida, as moscas são expostas a concentrações definidas de vapor de álcool e os dados são coletados. Por fim, a medição da perda do reflexo de escrito ou da sedação pode revelar diferenças na sensibilidade ao álcool entre os grupos, seja com base no horário do dia ou na genética.A demonstração visual deste método é essencial porque os passos de observação são difíceis de aprender devido às dificuldades em observar o comportamento e à luz vermelha fraca, além de determinar quais voos perderam o reflexo de escrita e quais não perderam. Primeiro, monte a barra de moscas. Comece montando o fluxo de ar.Conecte um pequeno pedaço de tubo de silicone flexível a uma tomada de ar da instalação ou a um aerador de aquário para fornecer fluxo de ar. Divida o fluxo de ar com um conector em Y. Conecte o primeiro ramo a um regulador.Ele controlará a quantidade total de ar que passa pelo sistema. Conecte o segundo ramo a um conector rápido. Isso permitirá que o fluxo de ar seja interrompido conforme necessário, sem afetar o fluxo de ar calibrado.Adicione um conector em Y e conecte cada tubo ramificado a um regulador de fluxo de ar. Em seguida, conecte cada regulador a um medidor de fluxo de ar. Agora, corte pipetas de vidro de um mililitro e dobre um ângulo reto em cada seção.Esses atuarão como tubos rígidos em ângulo no conjunto. Insira a pipeta de vidro reta para a entrada de ar por um dos orifícios e estenda-a até o fluido, a um centímetro acima do fundo. Insira um trecho em ângulo de vidro pelo outro orifício até que entre ligeiramente no frasco.Use essas saídas para unir o fluxo de ar de cada frasco em um conector em Y. Usando tubos flexíveis, conecte os medidores de fluxo de ar à seção reta de uma pipeta. Esses servirão como as entradas de ar nos dois frascos de solução.Água ou álcool, mantenha ambos os frascos de solução em banho-maria ajustado a dois graus acima da temperatura ambiente. Tampe os frascos com rolhas de borracha que possuam dois orifícios com tubos de silicone. Conecte a outra extremidade do tubo em Y a um frasco com rolha de borracha de dois orifícios.A corrente de ar proveniente deste frasco de mistura fornecerá álcool vaporizado e água para os frascos de observação. Divida a corrente de ar de saída do frasco de mistura duas ou três vezes para obter quatro ou oito correntes menores de ar, uma para cada frasco de observação.Continue usando tubos de silicone. Os frascos de observação são frascos para moscas vazios vedados com uma rolha de borracha com dois orifícios, um para entrada e outro para saída do vapor de álcool. Tubos de vidro se encaixam nos orifícios da rolha.Cubra as extremidades do tubo de vidro com uma tela. Mantenha a tela no lugar usando um pequeno pedaço de tubo plástico flexível. Insira este tubo através do primeiro orifício até que se estenda por aproximadamente metade do comprimento do frasco.Se necessário, use fita de teflon para obter um encaixe firme. Insira o segundo tubo de vidro com a tela até que fique alinhado com a borda interna da rolha de borracha. Misture as frações apropriadas das duas correntes de ar borbulhadas através de álcool ou água.Monitore continuamente a pressão do ar e faça ajustes conforme necessário para manter a mistura desejada de álcool e vapor de água no frasco de mistura. Para esse tipo de experimento, certifique-se sempre de que o ambiente esteja adequadamente ventilado. Para minimizar a variação entre réplicas, é necessário prestar a máxima atenção às condições de criação das moscas.As moscas precisam ser cultivadas em condições de baixa densidade populacional e com um ciclo de luz muito estranho sincronizado, de modo que moscas da mesma idade e coorte possam ser testadas umas contra as outras. Aproxime-se das moscas ao entardecer. Colete animais recém-emergidos e armazene-os por 24 horas em frascos de contenção com uma pequena quantidade de alimento com alta concentração de ágar, ao mesmo tempo.No dia seguinte, subdivida as moscas coletadas em grupos de aproximadamente 30 moscas utilizando um aspirador e transfira os grupos para tubos novos para testar a modulação circadiana do comportamento. Prepare um número suficiente de grupos para testar cada condição em seis pontos de tempo igualmente espaçados no dia de teste, a fim de avaliar o comportamento de modulação circadiana. Mantenha também as moscas em escuridão constante a 25 graus Celsius por dois dias antes do teste.Independentemente do desenho experimental, pelo menos uma hora antes do ensaio comportamental, transfira as moscas para a sala de comportamento experimental iluminada apenas por luz vermelha fraca. Realize os experimentos sob luz vermelha fraca para que a estimulação fotossensível não interfira nos resultados. Antes do experimento, passe ar pelo sistema por pelo menos 10 minutos e calibre os fluxos de ar.Sob as provetas de observação, coloque um pedaço de papel branco para aumentar a visibilidade das moscas com contraste adicional. Uma vez que o fluxo de ar tenha se estabilizado, desconecte o engate rápido e carregue uma coorte de 30 moscas em cada proveta de observação.Durante cada execução da barra de moscas, teste cada condição experimental. Isso aumentará a robustez do experimento e minimizará o impacto das variações diárias. Depois que todos os frascos de observação forem carregados, reconecte o fluxo de ar e inicie os cronômetros.Use um cronômetro para acompanhar o tempo total de exposição ao álcool e o outro para contar os intervalos de cinco minutos ao longo do experimento. Monitore os fluxos de ar e faça os ajustes necessários para que permaneçam constantes. Geralmente, os fluxos de ar se estabilizam a cada cinco minutos utilizando uma lâmpada de luz vermelha.Conte o número de moscas que perderam o reflexo de escrita. Mantenha a lâmpada a pelo menos 30 centímetros dos frascos. Dê uma batida firme no frasco e conte quantas moscas deixam de se reorientar dentro de aproximadamente quatro segundos.Essas moscas podem ainda mover as pernas e as asas, mas não serão capazes de se virar para a posição ereta. Se a mosca não mover nenhum membro, ela está completamente sedada. Isso pode ser pontuado como um critério diferente da ausência de reflexo de escrita.A sessão terá duração de cerca de uma hora; ao final, conte o número total de moscas em cada arquivo utilizando o protocolo descrito. Foi medida uma modulação circadiana na sensibilidade ao álcool. A ausência do reflexo de escrita foi avaliada em seis pontos temporais durante o segundo dia de escuro em Canton S; o horário do dia teve um efeito significativo sobre o tempo. Metade das moscas não conseguiu escrever-se. A porcentagem de moscas de cantão sedadas após 40 minutos com álcool a 30% foi medida no dia subjetivo CT cinco e na noite CT 17.Verificou-se que significativamente menos moscas foram sedadas durante o dia subjetivo em comparação com a noite. A utilização de uma série temporal ilustrou diferenças no reflexo de escrita e na sedação quando moscas Canton S foram comparadas com moscas portadoras da mutação white 1 1 1 8. No background Canton S, as moscas white 1 1 1 8 apresentaram melhor reflexo de escrita em resposta ao vapor de etanol do que as Canton S. Também foram observadas diferenças entre os mutantes white 1 1 1 8 e as moscas selvagens na taxa de sedação.A diferença é mais provavelmente devida aos níveis alterados de inimigos biogênicos com a mutação white 1 1 1 8. Assim, é necessário controlar as respostas comportamentais decorrentes da mutação white 1 1 1 8 presente em muitas linhagens transgênicas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como administrar álcool a moscas utilizando o fly barn.É essencial que as moscas sejam coletadas de maneira metódica e que as observações sob luz vermelha fraca sejam padronizadas o máximo possível.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um ensaio simples para medir os efeitos sedativos do etanol...

Uma maneira simples para medir a sensibilidade de etanol no Flies

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Injeção de moscas adultas de Drosophila: um método de administração de compostos ou rótulos

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Ensaios simples para medir a sensibilidade ao etanol e a tolerância rápida em Drosophila facilitam o uso deste organismo modelo para investigar esses importantes comportamentos relacionados ao etanol. Aqui, um ensaio relativamente simples e escalável para medir a sensibilidade ao etanol e a tolerância rápida em moscas é descrito.

Um Ensaio Behavioral Barato, escalável para medição Ethanol Sedação sensibilidade e tolerância rápida em<em&gt; Drosophila</em

Descrito aqui é o uso de várias ferramentas caseiras para transferir, Chill, e matar a Drosophilaadulta, bem como para limpar frascos de cultura de vidro e coletar ovos. Estas ferramentas são fáceis de fazer e são bastante eficientes no manuseio da Drosophila.

Ferramentas caseiras simples para lidar com moscas de frutas —Drosophila melanogaster

Os métodos atuais para medir a sensibilidade ao álcool em Drosophila são projetados para testar grupos de moscas. Apresentamos um ensaio simples, de baixo custo e de alto custo para avaliar a sensibilidade à sedação de álcool em um grande número de moscas simples. O método não requer ferramentas especializadas e pode ser realizado em qualquer laboratório utilizando materiais comuns.

Método de alta duração para medir o tempo de sedação de álcool de melanogaster individual drosophila

O ensaio Flypub mede os comportamentos que a mosca da fruta Drosophila melanogaster exibe sob a influência do etanol. O ensaio pode ser facilmente dominado por experimentadores em todos os níveis e aplicado a vários estímulos vaporizados, facilitando o abuso de substâncias e estudos de dependência.

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A mosca-da-fruta (Drosophila melanogaster) é amplamente utilizada para pesquisas biológicas e toxicológicas. Para expandir a utilidade das moscas, desenvolvemos um instrumento, o serial anesthesia array, que expõe simultaneamente múltiplas amostras de moscas a anestésicos gerais voláteis (AGV), tornando possível investigar os efeitos colaterais (tóxicos e protetores) dos AGVs.

O arranjo de anestesia seriado para a investigação de alto rendimento de agentes voláteis usando Drosophila melanogaster

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