Name: A estimulação mecânica induzida por cálcio Propagação de Ondas em monocamadas de células: O Exemplo de Bovinos endotélio corneano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprenda a estudar ondas de cálcio intercelulares em células endoteliais corneanas bovinas usando estimulação mecânica e microscopia confocal. Este método revela a comunicação celular via junções comunicantes.

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O trabalho de investigação realizado em laboratório foi apoiada por doações da Fundação de Pesquisa - Flandres (FWO; números concessão G.0545.08 e G.0298.11), o Programa Interuniversitário poloneses Atração (Ciência Política belga; número de concessão P6/28 e P7/13) e está inserida em uma comunidade de investigação FWO apoiado. CDH é uma bolsa de pós-doutorado da Fundação de Pesquisa - Flandres (FWO). Os autores são muito gratos a todos os membros atuais e antigos do Laboratory of Molecular and Cellular Signaling (KU Leuven), Dr. SP Srinivas (Indiana Escola de Optometria University, EUA), o laboratório de Dr. Leybaert (Universidade de Ghent) e de Dr. Vinken (VUB), que proporcionou discussões úteis, procedimentos otimizados ou estavam envolvidos no desenvolvimento de ferramentas para o estudo de hemichannels conexina.

1. Isolamento de células endoteliais da córnea Antes de começar: Isole as células dos olhos frescos, obtidos a partir de um matadouro local, logo que possível após a enucleação dos olhos. Certifique-se de que foi submetida à enucleação de uma vaca máximas de 18 meses de idade, cinco minutos após o abate e preservados em solução salina equilibrada de Earle - solução de iodo a 1% a 4 ° C durante o transporte para o laboratório. <ol><li> Pegue o olho de Solução Salina Balanceada do Earle - solução de iodo 1% e colocá-lo em uma placa de Petri (100 x 20 mm). </li><li> Esteriliza-se o olho com uma solução contendo etanol a 70% e lavagem com solução salina equilibrada de Earle contendo 1% de iodo. </li><li> A partir deste passo, trabalhar em uma capa estéril. Dissecar cuidadosamente a córnea do olho e coloca-se numa placa de Petri (35 x 10 mm), contendo solução salina equilibrada de Earle, com a camada de células epiteliais voltada para cima. Remova cuidadosamente qualquer sti tecido da íris remanescentell fixada na córnea, se necessário. </li><li> Transferir a córnea para a Solução Salina Equilibrada de Earle contendo um outro prato de Petri com a camada de células endoteliais para cima e lavar duas vezes com Solução Salina Balanceada de Earle. </li><li> Transferir a córnea, com a camada endotelial voltada para cima para uma ampulheta, o qual é um prato em forma de taça, e cobri-lo com um meio de crescimento. O meio de crescimento constituído por Meio de Eagle Modificado por Dulbecco contendo glucose 25 mM, 10% de soro fetal bovino, 6,6% de L-glutamina, 2,5 ug / ml de anfotericina-B e 1% de mistura de antibiótico-antimicótico contendo 10.000 unidades / ml de penicilina, 10.000 ug / ml de estreptomicina, e 25 ug / ml de anfotericina B. </li><li> Remover o meio com uma pipeta de aspiração. </li><li> Aplicar 300 ul de uma solução de tripsina (0,5 g / L) para a camada endotelial da córnea (todos os passos que incluem a tripsina são feitas usando a mesma concentração). </li><li> Coloque a ampulheta contendo a córnea em uma placa de Petri coberta e colocá-lo no incubator durante 30 min a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Raspe as células endoteliais da córnea de distância com um incêndio polido gancho em forma de pipeta de Pasteur de vidro numa câmara estéril. </li><li> Chupam a solução contendo as células endoteliais e adicioná-lo para frascos de cultura (25 cm 2), contendo 4 ml de meio de cultura. </li><li> Aplicar 300 l de meio de crescimento para a córnea e repetir o desbaste, e adicionar a solução contendo as células endoteliais para o balão de cultura. </li><li> Repetir esta etapa final (1,11) mais uma vez. </li><li> Coloque a frascos de cultura contendo as células endoteliais corneanas no meio de crescimento na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Após dois dias, adicionar 6 mL de meio de cultura. </li><li> Recarregar o meio de crescimento a cada segundo dia. </li></ol> 2. Cultura de Células <ol><li> Remover o meio de cultura e lava-se as células duas vezes com Solução Salina Balanceada de Earle, quando for atingida a confluência (dentro About 10 dias após o isolamento). </li><li> Adicionar 1,5 ml de solução de tripsina às células para separar os e colocar o balão na incubadora (37 ° C, 5% CO2) durante 3-4 min. </li><li> Adicionar 12 ml de meio de crescimento. Pipeta as médias de três vezes dentro e fora para dispersar as células e contagem das células. </li><li> Semente as células com uma fração variável dependendo da densidade celular e colocá-los na incubadora. Prepara duas lâminas bem septadas (com uma área de 4,2 cm2), com uma contagem de células de 165.000 células (densidade de 39.286 células por cm2). Preparar 80 centímetros 2 frascos de cultura de uma nova passagem a uma densidade de 6,250 por cm 2, e adiciona-se meio de cultura fresco a um volume total de 25 ml. </li><li> Atualizar o meio a cada dois dias. </li><li> Confluência da camada de células é alcançada após 3 a 4 dias. Usar células para experimentos. </li><li> Quando a confluência da camada de células nos frascos é atingido, repetir os passos 2.1 a 2.6. Culturas de células até a passagem 2 pode ser usado fou experimentação. </li></ol> 3. Estimulação mecânica para induzir ondas de cálcio <ol><li> Carregar as células na lâmina câmaras com 10 pM de Fluo-4 AM no salino tamponado com fosfato durante 30 min a 37 ° C, agitando suavemente. </li><li> Remover o Fluo-04:00 solução, lavar as células cinco vezes com solução salina tamponada com fosfato, incubar as células com solução salina tamponada com fosfato e deixar as células durante pelo menos 5 min à temperatura ambiente antes da medição. </li><li> Excite a 488 nm com laser de argônio e uso divisor de feixe HFT 488, recolher a emissão de fluorescência em 530 nm usando um filtro de emissão longpass LP 505, definir o pinhole, no mínimo. Use uma imersão objetiva de 40X petróleo (Air, 1,2 NA). Em experimentos com ARL-67156, use uma objetiva de 10X (Air, 0,3 NA). </li><li> Procurar um campo em que as células estão confluentes no microscópio confocal. </li><li> Posição da pipeta de modo que é de 45 ° em relação à corrediça compartimentado e tocando a membrana celular.Provocar uma pequena estimulação mecânica (≈ 1 seg) para uma única célula. A estimulação mecânica consiste numa deformação aguda de curta duração, da célula ao tocar rapidamente inferior a 1% da membrana celular com uma micropipeta de vidro (diâmetro da ponta &lt;1 mm) acoplado a um nanopositioner cristal piezoeléctrico, operado através de um amplificador que está montado um micro-manipulador. As micropipetas de vidro são feitos com um puxador de microeléctrodos. Certifique-se de que o nanopositioner é operado por uma tensão entre 0,2 e 1,5 V durante a estimulação mecânica. Uma tensão mais elevada do que 1,5 V pode resultar em danos nas células. Para cada tipo de célula e da condição, a tensão óptima para a estimulação mecânica sem danos das células deve ser cuidadosamente determinada mediante a aplicação de uma série de tensões a partir de baixo (0,2 V) a elevada (1,5 V) de tensão. A tensão é uma medida da força do estímulo uma vez que este determina a tensão de tensão mecânica e de tensão que são aplicados à membrana celular. Oforça da estimulação mecânica pode ser calculada multiplicando a tensão mecânica com a área. Uma vez que tanto a área (&lt;3,14 mM 2) e a tensão mecânica é muito baixa, a força do estímulo mecânico é baixa. (Note-se que quando uma célula é danificada, as fugas de fluorescência para fora da célula e a célula torna-se escura.) </li><li> Medir as mudanças espaciais em [Ca 2 +] i após a estimulação mecânica com o microscópio confocal. </li><li> Coletar e armazenar as imagens. </li><li> Desenhar uma região poligonal de interesse para definir a área de superfície total de células que respondem (área activa, AA), utilizando o software do microscópio confocal. </li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste artigo, nós descrevemos um método simples de medir intercelular Ca 2 + de propagação de ondas em monocamadas de células endoteliais corneanas bovinas primárias, fornecendo uma estimulação mecânica localizada e controlada usando uma micropipeta. Mecanicamente estimuladas células respondem com um aumento local intracelular IP3 e Ca 2 +, ambos os quais são moléculas de sinalização intracelular que conduzem essenciais intracelular de Ca 2 + de propagação de onda 11,67.<...

Comunicação intercelular e de sinalização são essenciais para a coordenação dos processos fisiológicos em resposta aos agonistas extracelulares no tecido e nível de 1,2-órgão inteiro. A maneira mais direta de comunicação intercelular é criado pela ocorrência de junções. Junções são placas de canais de junção gap, que são canais protéicos formados pelo acoplamento cabeça-de-cabeça de dois (Cx) hemichannels conexina de células adjacentes 3,4 (Figura 1). Junções de hiato permitir a passagem de pequenas moléculas de sinalização, com um peso molecular de menos de 1,5 kDa, incluindo Ca 2 + ou de IP 3 5, causando modulação e Ca 2 + de libertação a partir das reservas intracelulares das células vizinhas 6 (Figura 2). Canais de junções são fortemente regulados por intra e intermolecular interações proteína e por processos de sinalização celular, como modificação redox efosforilação 7. GJS facilitar a resposta coordenada de células conectadas, agindo assim como um sincício elétrica e química. Por exemplo, a propagação do potencial de acção cardíaca entre os miócitos atriais e ventriculares é mediada pelos canais GJ baseados Cx 85. Cxs não só tem um papel como canais de junções de hiato, mas também formar hemichannels desemparelhados, funcionando desse modo como os canais de membranas de forma semelhante aos canais de iões regulares 8-10 (Figura 1). Hemichannels participar na sinalização parácrinas entre células vizinhas por controlar a troca de iões e moléculas de sinalização entre o ambiente intra-e extracelulares. Em muitos tipos de células (como células epiteliais, células osteoblásticas, astrócitos, células endoteliais, etc) e órgãos (como o cérebro, o fígado, retina, cóclea e na vasculatura), intercelular Ca 2 +-ondas são fundamentais para a coordenação das respostas multicelulares <sup&gt; 11. Aumentos nos níveis de Ca2 + intracelular em células de um determinado não estão limitados a esta célula, mas para propagar as células vizinhas adjacentes, estabelecendo assim uma intercelular Ca 2 + onda 12,13. Estes intercelular Ca 2 +-ondas são importantes para a regulação fisiológica normal de camadas de células como um sincício e sua desregulação tem sido associado com os processos patofisiológicos 11. No endotélio corneano e epitélio, diferentes grupos 14-24, incluindo o nosso próprio 25-33, estudou os mecanismos e as funções de comunicação intercelular. Em células não-excitáveis, como as células endoteliais corneanas, dois modos distintos de comunicação intercelular ocorrer 28,29, nomeadamente lacuna juncional comunicação intercelular e comunicação intercelular parácrina. Gap juncional comunicação intercelular envolve uma troca direta de moléculas de sinalização via junções gap 7. Gap junccomunicação intercelular internacional é fundamental para a manutenção da homeostase do tecido, controle da proliferação celular, e estabelecer uma resposta sincronizada ao estresse extracelular 10,34,35. Em uma série de patologias, acoplamento junção gap é reduzida devido à Cxs com defeito, e vem afetando lacuna juncional comunicação intercelular 36. Isto enfatiza a importância ea influência do fosso juncional comunicação intercelular em organismos multicelulares. Em contraste com a abertura juncional comunicação intercelular, a comunicação intercelular parácrina não é dependente de aposição célula-célula, uma vez que implica a libertação de mensageiros extracelulares difusíveis (Figura 2). Diferentes tipos de moléculas sinalizadoras são libertadas no meio extracelular pelas células de sinalização. A molécula é então transportado para a célula alvo, onde é detectado por uma proteína receptor específico. Subsequentemente, o complexo receptor de sinal induz uma resposta celular, queé terminada por remoção do sinal, ou inactivação de dessensibilização. Lançamentos lipofílicos mensageiros de sinalização extracelular penetrar a membrana e agem sobre os receptores intracelulares. Em contraste, os mensageiros hidrofílicas não atravessar a membrana plasmática da célula responder, mas actuar como um ligando que se liga a proteínas receptoras expressas na superfície, que então retransmitem o sinal para o ambiente intracelular. Três grandes famílias de proteínas receptoras de superfície celular participar neste processo: canais de íons ligados, enzyme-linked e proteína G ligada. A molécula mensageira libertados podem actuar sobre os receptores da mesma célula (autócrino), sobre as células-alvo, em estreita proximidade (parácrina), ou nas células alvo distantes que exigem que o sistema circulatório (endócrina). Em muitos tipos de células, incluindo endotélio corneano 28,29, o ATP é um dos principais factores parácrinos, hidrofílicos que conduzem à propagação intercelular da Ca2 +-ondas 37-40. During deformação mecânica, a hipoxia, a inflamação ou a estimulação por vários agentes, o ATP pode ser libertado a partir de células saudáveis ​​41-44, em resposta à tensão de corte, estiramento, ou inchaço osmótico 44,45. Mecanismos de libertação de ATP diferentes têm sido postulada, incluindo exocitose vesicular 44 e uma multiplicidade de mecanismos de transporte, tais como a cassete (ABC) transportadores de ligação a ATP, canais dependentes da voltagem aniónica plasmalemmal 46 canais dos receptores P2X7, 47,48, bem como conexina hemichannels 49-52 e pannexin hemichannels 43,49,53. O ATP extracelular pode ser rapidamente hidrolisado para o ADP, AMP e adenosina 54,55 por ectonucleotidases que estão presentes no ambiente extracelular. O ATP extracelular liberado e seu metabólito ADP 56 vai se espalhar por meio de difusão. A interacção subsequente destes nucleótidos com receptores purinérgicos nas células vizinhas tem sido implicada na propagation intercelular de Ca 2 +-ondas 28,37,51. Duas classes diferentes de receptores purinérgicos estão presentes: adenosina é o principal ligando natural para P1-purinoceptors, enquanto ambos purina (ATP, ADP) e pirimidina (UTP, UDP) nucleótidos actuar em mais purinoceptors P2-57. Comunicação intercelular pode ser investigada por vários métodos, tais como a carga raspagem, a transferência de corantes, uncaging locais de agonistas como IP3 e Ca 2 +, estimulação mecânica, etc. Aqui descrevemos o estudo de Ca 2 + de propagação da onda induzida por estimulação mecânica de uma única célula. A vantagem de se estudar Ca 2 + de propagação da onda de estimulação mecânica é que ela fornece uma ferramenta fácil de quantificar a propagação do Ca 2 + onda ao longo do tempo e que permite comparar quantitativamente diferentes pré-tratamentos das células. Nas endotélio corneano, estes intercelular Ca 2 +-ondas permitir um coresposta coordenada a partir da monocamada, actuando por este meio como um possível mecanismo de defesa do endotélio corneal não regenerativos ajudando o endotélio para suportar tensões extracelular durante a cirurgia intra-ocular, ou por exposição a mediadores inflamatórios, durante a rejeição imunológica ou uveíte 58,59.

<table><tbody><tr><td>Solução salina balanceada de Earle (EBSS)</td><td>Sondas Invitrogen-Gibco-Molecular (Karlsruhe, Alemanha)</td><td>14155-048</td><td></td></tr><tr><td>Iodo</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Alemanha)</td><td>38060-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Sondas Invitrogen-Gibco-Molecular (Karlsruhe, Alemanha)</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (Glutamax)</td><td>Sondas Invitrogen-Gibco-Molecular (Karlsruhe, Alemanha)</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina-B</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Alemanha)</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Mistura antibiótica-antimicótica</td><td>Sondas Invitrogen-Gibco-Molecular (Karlsruhe, Alemanha)</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Sondas Invitrogen-Gibco-Molecular de Tripsina (Karlsruhe, Alemanha)</td><td>25300-054</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DulbeccoSondas PBS</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular (Karlsruhe, Alemanha)</td> <td>14190-091</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Alemanha)</td> <td>F14217</td><td></td></tr><tr><td>ARL-67156 (6-N, N-Dietil-b, g-dibrometileno-D-ATP) </td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Alemanha)</td> <td>A265</td><td></td></tr><tr><td>Apirase VI</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Alemanha)</td> <td>A6410</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase VII</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Alemanha)</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td><td>Síntese</td><td></td><td></td>de peptídeos personalizados</tr><tr><td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td>Peptídeo de controle de <td>síntese</td><td></td><td></td>de peptídeos personalizado</tr><tr><td>(SRGGEKNVFIV)</td><td>Síntese</td><td></td><td></td>de peptídeos personalizados</tr><tr><td>siRNA1 Cx43 (sentido: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td><td>O siRNA recozido foi adquirido em Eurogentec (Luik, Bélgica)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA2 Cx43 (sentido: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td><td>O siRNA recozido foi comprado na Eurogentec (Luik, Bélgica)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Embaralhamento de siRNA: sequência embaralhada de siCx43-1 (sentido: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) </td><td>O siRNA recozido foi comprado na Eurogentec (Luik, Bélgica)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td><td>Thermo Electron (Ulm, Alemanha)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td><td>Thermo Electron (Ulm, Alemanha)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duas lâminas de vidro com câmara</td><td>Laboratório-Tek Nunc (Roskilde, Dinamarca)</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal </td><td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Alemanha)</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>Piez&#8211; nanoposicionador de cristal elétrico (Piezo Flexure NanoPositioner)</td><td>PI Polytech (Karlsruhe, Alemanha)</td><td>P-280</td><td></td></tr><tr><td>HVPZT-amplificador</td><td>PI Polytech (Karlsruhe, Alemanha)</td><td>E463 HVPZT-amplificador</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de vidro (substituição de vidro 3,5 nanolitros)</td><td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Flórida, EUA</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>Micr&#8211; extrator de leitura </td><td>Zeitz Instrumente (München, Alemanha)</td><td>WZ DMZ-Universal Extrator</td><td></td></tr></tbody></table>

a estimulação mecânica induzida por cálcio propagação de ondas em monocamadas de células: o exemplo de bovinos endotélio corneano

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Comunicação intercelular é essencial para a coordenação dos processos fisiológicas entre as células de uma variedade de órgãos e tecidos, incluindo o cérebro, o fígado, a retina, na cóclea e vasculatura. Em condições experimentais, intercelular Ca 2 +-ondas pode ser obtida através da aplicação de um estímulo mecânico para uma única célula. Isto conduz à libertação das moléculas sinalizadoras intracelulares de IP 3 e Ca 2 + que iniciam a propagação do Ca 2 + onda concêntrica a partir da célula estimulada mecanicamente para as células vizinhas. As principais vias moleculares que controlam intercelular Ca 2 + propagação de ondas são fornecidos por canais de derivação lacuna através da transferência direta de IP 3 e por hemichannels através da liberação de ATP. A identificação e caracterização das propriedades de regulação e das diferentes isoformas de conexinas e pannexin como canais de junções de hiato e hemichannels são permitidas pelo quantification da disseminação intercelular do Ca 2 + onda, siRNA, e o uso de inibidores dos canais de junções de hiato e hemichannels. Aqui, nós descrevemos um método para medir intercelular Ca 2 + onda em monocamadas de células endoteliais da córnea primárias carregado com Fluo4-AM em resposta a um estímulo mecânico controlado e localizado provocado por uma deformação aguda de curta duração, da célula como resultado de tocar na membrana celular com uma micropipeta de vidro controlada por micromanipulador com um diâmetro de ponta de menos de 1 um. Descrevemos também o isolamento de bovinos células endoteliais corneanas primários e sua utilização como sistema modelo para avaliar a atividade Cx43-hemichannel como a força orientada para intercelular Ca 2 +-ondas através da liberação de ATP. Finalmente, discute-se a utilização, vantagens, limitações e alternativas deste método no contexto do canal de junção gap e pesquisa hemichannel.

Todos os experimentos são executados em conformidade com todas as diretrizes, regulamentos e agências reguladoras e do protocolo que está sendo demonstrado é realizada sob a orientação e aprovação do comitê de cuidados com os animais e uso da KU Leuven. Em células endoteliais da córnea de bovino (BCEC), para junções de hiato funcionais e ambos são expressos lacuna juncional comunicação intercelular e comunicação intercelular parácrina contribuir significativamente para a comunicação intercel...

Intercelular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Ondas são conduzidos por canais de junção gap e hemichannels. Aqui, descrevemos um método para medir intercelular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Ondas em monocamadas de células em resposta a um estímulo mecânico de uma única célula local e sua aplicação a investigar as propriedades e regulação dos canais de junções gap e hemichannels.

A estimulação mecânica induzida por cálcio Propagação de Ondas em monocamadas de células: O Exemplo de Bovinos endotélio corneano

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar a comunicação intercelular por meio de canais de junções comunicantes e canais HEMI mediante a quantificação da propagação da onda intercelular de cálcio provocada por estimulação mecânica em monocamadas de células endoteliais corneanas primárias. Isso é alcançado primeiramente isolando-se as células endoteliais corneanas primárias de olhos bovinos frescos. Em um segundo passo, dois a três dias após a semeadura em lâminas com câmara, a monocamada confluente de células é carregada com o corante fluorescente sensível ao cálcio flu O 4:00 AM. Em seguida, aplicamos um estímulo mecânico controlado e localizado a uma única célula da monocamada para provocar uma onda intercelular de cálcio, que é visualizada no microscópio confocal.Os resultados mostram a propagação da onda intercelular de cálcio. A inibição final dos canais de junções comunicantes e canais HEMI é utilizada para desvendar as propriedades e regulação de diferentes isoformas de conexinas e panexinas que formam canais de junções comunicantes e canais HEMI. A principal vantagem da propagação da onda intercelular de cálcio induzida por estimulação mecânica é que fornece um método simples e confiável para examinar a contribuição e as propriedades dos canais de conexão e axiais de maneira não invasiva.Além disso, o método baseia-se nas moléculas e cascatas de sinalização fisiológicas presentes nos sistemas celulares estudados. Por fim, é facilmente adaptável a uma variedade de sistemas celulares, incluindo células primárias e modelos celulares que expressam ectopicamente certas isoformas de conexina ou PanIN. Este método pode fornecer informações sobre a função e a regulação dinâmica dos canais de junção do tipo conexina e PanIN e canais HEMI, por meio do uso de RNA de interferência mediado por silenciamento gênico de conexinas ou isoformas de PanIN endógenas e pelo uso de inibidores seletivos de canais de junção do tipo conexina e canais HEMI.Este sistema certamente não se limita apenas às células endoteliais corneanas. É adaptável a praticamente qualquer tipo celular e também a tecidos mais complexos. Este procedimento utiliza um olho recém-enucleado de bovino com no máximo 18 meses de idade e não mais do que cinco minutos pós-morte.Isso foi transportado para o laboratório em solução salina balanceada de Earl e solução de iodo a 1% a quatro graus Celsius. Primeiro, transfira o olho para uma placa de Petri de 100 milímetros por 20 milímetros. Em seguida, lave o olho com EBSS contendo iodo a 1%.Em seguida, esterilize com uma solução contendo 70% de etanol a partir deste ponto. Trabalhe em uma câmara de fluxo laminar estéril. Disseque cuidadosamente a córnea do olho e coloque-a em uma placa de Petri de 35 milímetros por 10 milímetros contendo EBSS, com a camada de células epiteliais voltada para cima.Remova cuidadosamente qualquer tecido da íris ainda aderido à córnea. Se necessário, transfira a córnea para outro recipiente com EBSS, com a camada de células endoteliais voltada para cima, e depois lave duas vezes com EBSS. Em seguida, posicione a córnea com a camada endotelial voltada para cima em um vaso em forma de ampulheta e cubra com meio de crescimento.Para enxaguar, remova o meio com uma pipeta de sucção. Aplique 300 microlitros de solução de tripsina a 0,5 grama por litro na camada endotelial da córnea. Coloque o relógio de areia contendo a córnea em uma placa de Petri tampada e transfira para a incubadora por 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Após recuperar o relógio de areia, remova suavemente as células endoteliais da córnea com uma pipeta de Pasteur de vidro em forma de gancho polido ao fogo. Aspire a solução contendo as células endoteliais e adicione-a a um frasco de cultura quadrado de 25 centímetros quadrados contendo quatro mililitros de meio de cultura. Em seguida, aplique 300 microlitros de meio de crescimento à córnea.Repita a raspagem e adicione a solução contendo as células endoteliais ao frasco de cultura. Repita este passo mais uma vez, então coloque os frascos de cultura contendo as células endoteliais da córnea no meio de crescimento dentro da incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Dois dias depois, adicione seis mililitros de meio de cultura e renove o meio de crescimento a cada dois dias.As células devem atingir confluência entre sete a dez dias após o isolamento até a repicagem. Primeiro, aspire o meio de cultura e depois enxágue duas vezes com EBSS. Em seguida, adicione dois mililitros da solução tripsina à cultura celular e coloque o frasco no incubador por três a quatro minutos.Em seguida, adicione 12 mililitros de meio de crescimento e pipete o meio três vezes para dentro e para fora para dispersar as células. Em seguida, conte as células utilizando um hemocitômetro ou contador celular automatizado. Adicione 165.000 células a lâminas de cultura de duas cavidades.Em seguida, prepare frascos de cultura quadrados de 75 centímetros quadrados para uma nova passagem numa densidade de 6.250 células por centímetro quadrado e adicione meio de cultura fresco até um volume total de 25 mililitros; coloque os frascos e as lâminas com câmara no incubador. O meio é renovado a cada dois dias e a confluência da camada celular deve ser atingida em três a quatro dias. Primeiro, carregue as células na lâmina com câmara com 10 micromolar de fluo-4 AM em solução salina tamponada com fosfato durante 30 minutos a 37 graus Celsius com agitação suave enquanto as células estão incubando em fluo-4 AM. Acople uma micropipeta de vidro com diâmetro da ponta inferior a um micrômetro a um nano posicionador piezelétrico e conecte a um amplificador montado em um micromanipulador.Defina a tensão do nano posicionador entre 0,2 e 1,5 volts. Remova o flu da solução das 4:00 AM. Em seguida, lave as células cinco vezes com solução salina tamponada com fosfato e, depois, incube as células com PBS por pelo menos cinco minutos à temperatura ambiente antes da medição.Excite com 488 nanômetros utilizando laser de argônio e use o divisor de feixe HFT 48. Colete a emissão fluorescente em 530 nanômetros utilizando um filtro de emissão passa-longa, LP 5 0 5, com o diafragma de pinhole ajustado no mínimo; aqui, utiliza-se uma objetiva de imersão a óleo de 40 x. Coloque a lâmina com câmara sobre a platina de um microscópio confocal e localize uma região com células confluentes.Em seguida, mova o micromanipulador para posicionar a micropipeta de vidro de modo que toque a membrana celular em um ângulo de 45 graus. Opere o micromanipulador para tocar brevemente menos de 1% da membrana de uma única célula com a micropipeta de vidro e provocar uma estimulação mecânica de um segundo na célula. Em seguida, meça as alterações espaciais na concentração de íons cálcio após a estimulação mecânica, coletando e armazenando imagens com um microscópio confocal.Por fim, desenhe uma região de interesse poligonal para definir a área superficial total de células responsivas utilizando o software do microscópio confocal. Transientes de cálcio induzidos por estimulação mecânica são mostrados em diferentes pontos de tempo em condições controle em células endoteliais corneanas bovinas por meio de imagens representativas de fluorescência com pseudo cores; as intensidades de fluorescência antes da estimulação são mostradas na primeira imagem. A seta branca na segunda imagem identifica a célula estimulada mecanicamente.A onda de cálcio propaga-se por seis camadas celulares vizinhas, atingindo uma área total de células que resulta em uma área ativa de 62.870 micrômetros quadrados. O gráfico de linhas mostra a evolução temporal do valor de fluorescência normalizado ou FN na célula mecanicamente estimulada, identificada como ms, e o valor médio do FN nas camadas celulares vizinhas de um a cinco, rotuladas no gráfico como MB um a MB cinco. Essas imagens mostram alterações significativas na propagação das ondas de cálcio intercelulares após tratamento com nucleotídeos exógenos no gráfico à esquerda e após tratamento com inibidores da ectonucleotidase no gráfico à direita. Em maior detalhe, o gráfico à esquerda mostra uma diminuição significativa da área ativa após o tratamento de células endoteliais corneanas bovinas com a ectonucleotidase exógena Aras seis e sete, que hidrolisam ATP e ADP, inibindo assim a via de comunicação intercelular paracrina.O asterisco indica um valor de P inferior a 0,001 na presença versus ausência de ace. O gráfico à direita mostra um aumento significativo na área ativa após o tratamento de BCEC com um inibidor seletivo de ectonucleotídeo, A RL 6 7 1 56, potencializando assim a via de comunicação intercelular pericrina. O asterisco indica um valor de P inferior a 0,001 na presença versus ausência de a RL Uma vez dominado.Essa técnica pode ser realizada em cinco a 10 minutos para um experimento em uma condição, quando realizada corretamente. Realizar uma série completa de experimentos, a partir dos quais seja possível comparar diferentes condições, leva um dia para se obter conclusões estatísticas. Devem ser utilizados experimentos independentes realizados em dias diferentes e a partir de diferentes lotes de células isoladas.A medição e a quantificação da propagação da onda de cálcio intracelular permitem a identificação e a caracterização da regulação biológica celular de diferentes conexões e isoformas de canais de junção do tipo gab e canais HEMI. Gostaria também de destacar que este método não é isolado, mas deve ser complementado por outras abordagens moleculares e funcionais, que vão da transferência de dieta à liberação de TP e à eletrofisiologia.

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Biologia

Este artigo descreve a técnica usada para realizar o mapeamento óptico de canal duplo em monocamadas de células atriais HL-1 cultivadas. Este protocolo exclusivo permite a visualização simultânea da atividade de cálcio (Ca) e voltagem (Vm) na mesma área para a detecção e análise detalhadas das propriedades eletrofisiológicas das monocamadas de cultura.

Tensão e cálcio Dual Channel Mapping Optical do Cultivadas HL-1 Atrial miócitos Monolayer

Usando contraste de interferência diferencial (DIC) microscopia de alta resolução, uma observação ex vivo do espancamento de cílios ependymal móveis localizados dentro dos ventrículos do cérebro do rato é demonstrado pelo live-imagiologia. A técnica permite que uma gravação da frequência de batimento ciliar ângulo único e batendo bem como as suas propriedades de estimulação do cálcio intracelular oscilação.

Imagens ao vivo da ependimária Cilia nas laterais ventrículos do cérebro do rato

Canais mechanosensitive bacterianas podem ser utilizados como transdutores mecanoelétrica em dispositivos biomoleculares. Bilayers de interface de gotículas (DIBs), de inspiração celulares blocos de construção para tais dispositivos, representam novas plataformas para incorporar e estimular canais mechanosensitive. Aqui, demonstramos um novo método baseado na micropipeta de formar DIB, permitindo que o estudo de canais mechanosensitive sob estimulação mecânica.

Método multifuncional, baseado em Micropipeta de Incorporação e estimulação do bacteriana Mechanosensitive canais iônicos em gotículas de interface Bicamadas

A cultura primária de células endoteliais da córnea de bovino foi utilizada para investigar o mecanismo de transição endotelial-mesenquimais da córnea. Além disso, um modelo criolesão endotélio corneano de rato foi utilizado para demonstrar transição endotelial-mesenquimais da córnea in vivo.

In vitro e in vivo em modelos para o Estudo de Transição da córnea endotelial-mesenquimal

Demonstrado aqui são protocolos para isolar (1) recém endoteliais cerebrais intactos "tubos" e medições (2) simultâneas de cálcio endotelial e potencial durante o endotélio-derivado hiperpolarização de membrana. Além disso, esses métodos permitem a otimização farmacológica de cálcio da célula endotelial e sinalização eléctrica como variáveis experimentais individuais ou interativas.

Medições simultâneas de cálcio intracelular e potencial de membrana no endotélio Cerebral rato recém isoladas e intacta

Aqui, apresentamos um protocolo para desprender as células endoteliais da córnea (CEC) da membrana de Descemet (DM) usando um laser de neodímio:YAG (Nd:YAG) como um modelo de doença ex vivo para ceratopatia bânouca (BK).

Desenvolvimento de um modelo experimental não invasivo, assistido a laser de perda de células endoteliais córneas

Este protocolo descreve os passos críticos necessários para estabelecer e cultivar culturas de células endoteliais da córnea a partir de explantas de tecido humano ou ovino. Também é apresentado um método para subculindo células endoteliais córneas em biomateriais membranrosas.

Crescimento de Camadas de Células Endoteliais De Córnea Humana e Ovelha em Membranas Biomateriais

Este protocolo descreve o uso de nanofios de silício para bio modulação óptica intracelular de células em um método simples e fácil de executar. A técnica é altamente adaptável a diversos tipos de células e pode ser usada para aplicações in vitro e in vivo.

Nanofios de Silício e Estimulação Óptica para Investigações de Acoplamento Elétrico Intra e Intercelular

As próteses retinianas têm a capacidade de gerar percepções visuais. Para avançar no desenvolvimento de novas próteses, são necessários métodos ex vivo para testar os dispositivos antes do implante. Este artigo fornece um protocolo abrangente para o estudo da atividade do cálcio na camada de células ganglionares da retina quando submetido à estimulação elétrica.

Imagem de cálcio em retinas planas eletricamente estimuladas

Este artigo apresenta um método para monitoramento quantitativo em tempo real das concentrações de íons cálcio (Ca2+) em células usando imagens de Ca2+ de célula única com o corante Fura-2/AM. Essa técnica permite o carregamento eficiente de corantes e o cálculo preciso dos níveis de Ca2+ por meio de taxas de intensidade de fluorescência, tornando-a uma abordagem simples e rápida para aplicações de pesquisa.

Imagem de cálcio de célula única para estudar a ativação de canais de íons de cálcio

O uso da luz para controlar células e tecidos cardíacos permite a estimulação sem contato, preservando assim o estado natural e a função das células, tornando-se uma abordagem valiosa tanto para pesquisa básica quanto para aplicações terapêuticas.

Um sistema microfisiológico cardíaco para estudar a propagação de Ca2+ via estimulação óptica não genética

Aprenda a estudar ondas de cálcio intercelulares em células endoteliais corneanas bovinas usando estimulação mecânica e microscopia confocal. Este método revela a comunicação celular via junções comunicantes.

A estimulação mecânica induzida por cálcio Propagação de Ondas em monocamadas de células: O Exemplo de Bovinos endotélio corneano (Vídeo) | JoVE Journal

A estimulação mecânica induzida por cálcio Propagação de Ondas em monocamadas de células: O Exemplo de Bovinos endotélio corneano

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