A estimulação mecânica induzida por cálcio Propagação de Ondas em monocamadas de células: O Exemplo de Bovinos endotélio corneano

O objetivo geral do presente experimento a seguir é estudar a comunicação intercelular via canais de junção comunicante e canais HEMI por quantificação da propagação da onda de cálcio intercelular evocada por estimulação mecânica em monocamadas de células endoteliais primárias da córnea. Isso é conseguido isolando primeiro as células endoteliais primárias da córnea dos olhos bovinos frescos. Como segunda etapa, dois a três dias após a semeadura em lâminas com câmara, a monocamada confluente de células é carregada com o corante fluorescente sensível ao cálcio gripe O 4:00 AM. Em seguida, aplicamos um estímulo mecânico controlado e localizado a uma única célula da monocamada para evocar uma onda de cálcio intercelular, que é visualizada no microscópio confocal.

Os resultados mostram a propagação da onda de cálcio intercelular. Em última análise, a inibição de canais de junção comunicante e canais HEMI é usada para desvendar as propriedades e regulação de diferentes Conex e panex e isoformas formando canais de junção comunicante e canais HEMI. A principal vantagem da propagação da onda de cálcio intercelular induzida por estimulação mecânica é que ela fornece um método simples e confiável para examinar a contribuição e as propriedades dos canais de conexão e machado de maneira não invasiva.

Além disso, o método conta com as moléculas de sinalização fisiológica e cascatas presentes nos sistemas celulares estudados. Finalmente, é facilmente adaptável a uma variedade de sistemas celulares, incluindo células primárias e modelos de células que expressam ectopicamente certas conexões ou isoformas PanIN. Esses métodos podem fornecer informações sobre a função e a regulação dinâmica dos canais de junção de tampa baseados em conexão e PanIN e canais HEMI pelo uso de knockdown mediado por RNA SI de conexão endógena ou pânicos em isoformas e pelo uso de inibidores seletivos de canais de junção de tampa e canais HEMI.

Este sistema definitivamente não se limita a ambas as células endoteliais da córnea. É adaptável a praticamente qualquer tipo de célula e também a tecidos mais complexos. Este procedimento usa um olho recém-nucleado de uma vaca com menos de 18 meses de idade e não mais de cinco minutos post-mortem.

Isso foi transportado para o laboratório na solução salina de equilíbrio de Earl e solução de iodo a 1% a quatro graus Celsius. Primeiro, transfira o olho para uma placa de Petri de 100 milímetros por 20 milímetros. Em seguida, lave o olho com EBSS contendo 1% de iodo.

Em seguida, esterilize-o com uma solução contendo 70% de etanol a partir deste ponto. Trabalhe com um capuz estéril. Disseque cuidadosamente a córnea do olho e coloque-a em uma placa de Petri de 35 milímetros por 10 milímetros contendo EBSS com a camada de células epiteliais voltada para cima.

Remova cuidadosamente qualquer tecido de íris remanescente ainda preso à córnea. Se necessário, transfira a córnea para outro prato de EBSS com a camada de células endoteliais para cima e depois enxágue duas vezes com EBSS. Em seguida, coloque a córnea com a camada endotelial voltada para cima em uma ampulheta e cubra com meio de crescimento.

Para enxaguar, retire o meio com uma pipeta de sucção. Aplique 300 microlitros de 0,5 grama por litro de solução de tripsina na camada endotelial da córnea. Coloque a ampulheta contendo a córnea em uma placa de Petri coberta e transfira para a incubadora por 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Depois de recuperar a ampulheta, raspe suavemente as células endoteliais da córnea com uma pipeta de pastagem de vidro em forma de gancho polido a fogo. Aspirar a solução contendo as células endoteliais e adicioná-la a um frasco de cultura quadrado de 25 centímetros contendo quatro mililitros de meio de cultura. Em seguida, aplique 300 microlitros de meio de crescimento na córnea.

Repetir a raspagem e adicionar a solução contendo as células endoteliais ao balão de cultura. Repita esta etapa mais uma vez e, em seguida, coloque os frascos de cultura contendo as células endoteliais da córnea no meio de crescimento na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Dois dias depois, adicione seis mililitros de meio de cultura e atualize o meio de crescimento a cada dois dias.

As células devem ser confluentes dentro de sete a 10 dias após o isolamento até a passagem. Primeiro, aspire o meio de cultura e depois enxágue duas vezes com EBSS. Em seguida, adicione duas mililitros de disparos em solução às células e coloque o frasco na incubadora por três a quatro minutos.

Em seguida, adicione 12 mililitros de meio de crescimento e pipete o meio três vezes para dentro e para fora para dispersar as células. Em seguida, conte as células usando um hemo, citômetro ou contador de células automatizado. Adicione 165.000 células a duas lâminas de cultura de poço.

Em seguida, prepare frascos de cultura quadrados de 75 centímetros para uma nova passagem a uma densidade de 6.250 células por centímetro quadrado e adicione meio de cultura fresco até um volume total de 25 mililitros e coloque os frascos e as lâminas da câmara na incubadora. O meio é atualizado a cada dois dias e a cofluência da camada celular deve ser alcançada dentro de três a quatro dias. Primeiro, carregue as células na lâmina da câmara com 10 micromolares flu oh 4:00 AM em solução salina tamponada com fosfato por 30 minutos a 37 graus Celsius com agitação suave enquanto as células estão incubando na gripe oh 4:00 AM acople uma micropipeta de vidro com um diâmetro de ponta inferior a um nano posicionador de eletrocristais piso, e conecte a um amplificador montado em um micro manipulador.

Defina a tensão do posicionador nano entre 0,2 e 1,5 volts. Remova a gripe da solução das 4:00 da manhã. Em seguida, lave as células cinco vezes com solução salina tamponada com fosfato e, em seguida, incube as células com PBS por pelo menos cinco minutos em temperatura ambiente antes da medição.

Excitada 488 nanômetros com laser de argonne e use divisor de feixe HFT 48. Colete a emissão fluorescente a 530 nanômetros usando um filtro de emissão de passagem longa, LP 5 0 5 com o orifício definido no mínimo, aqui é usada uma objetiva de imersão em óleo de 40 x. Coloque a lâmina da câmara no palco de um microscópio confocal e encontre uma área de células de confluência.

Em seguida, mova o micro manipulador para posicionar a micropipeta de vidro de forma que ela toque a membrana celular em um ângulo de 45 graus. Opere o micro manipulador para tocar brevemente menos de 1% da membrana celular única com a micropipeta de vidro e provoque uma estimulação mecânica de um segundo na célula. Em seguida, meça as mudanças espaciais na concentração de íons cálcio após estimulação mecânica com um microscópio confocal, colete e armazene imagens.

Finalmente, desenhe uma região poligonal de interesse para definir a área total da superfície das células responsivas usando o software do microscópio confocal. Os transientes de cálcio induzidos por estimulação mecânica são mostrados em diferentes pontos de tempo em condições de controle em células endoteliais da córnea bovina por imagens de fluorescência pseudocoloridas representativas, as intensidades de fluorescência antes da estimulação são mostradas na primeira imagem. A seta branca na segunda imagem identifica a célula estimulada mecanicamente.

A onda de cálcio se propaga para seis camadas de células vizinhas com uma área total de células alcançada pela onda, dando uma área ativa de 62.870 micrômetros quadrados. O gráfico de linhas mostra o curso de tempo do valor de fluorescência normalizado ou NF na célula mecanicamente estimulada rotulada como ms e o valor médio de NF nas camadas de células vizinhas de um a cinco rotuladas no gráfico como MB um a MB cinco. Essas imagens mostram mudanças significativas na propagação das ondas intercelulares de cálcio após o tratamento com nucleotídeos exógenos no gráfico à esquerda e após o tratamento com inibidores da ecto nucleotídeo aase no gráfico à direita com mais detalhes, o gráfico à esquerda mostra uma diminuição significativa na área ativa após o tratamento de células endoteliais da córnea bovina com o exógeno Aras Aase seis e Aase sete, que hidrolisou A TP e A DP inibindo a via de comunicação intercelular pericrina.

O asterisco significa um valor de P inferior a 0,001 na presença versus ausência de ás. O gráfico à direita mostra um aumento significativo na área ativa após o tratamento de BCEC com um inibidor seletivo de ecto nucleotídeo, A RL 6 7 1 56 melhorando a via de comunicação intercelular pericrina. O asterisco significa um valor de P inferior a 0,001 na presença versus ausência de um RL Uma vez dominado.

Essa técnica pode ser feita em cinco a 10 minutos para um experimento em uma condição quando for realizada corretamente. A realização de toda uma série de experimentos a partir dos quais você pode comparar diferentes condições leva um dia para tirar conclusões estatísticas. Devem ser utilizados experimentos independentes realizados em dias diferentes e em diferentes lotes de células isoladas.

A medição e quantificação da propagação de ondas de cálcio intracelulares permite a identificação e caracterização da regulação biológica celular de diferentes isoformas de conexão e ine como canais de junção gab e canais HEMI. Também gostaria de destacar que este método não se sustenta por si só, mas deve ser complementado por outras abordagens moleculares e funcionais que vão desde a transferência da dieta até a liberação de TP e eletrofisiologia.