A estimulação mecânica induzida por cálcio Propagação de Ondas em monocamadas de células: O Exemplo de Bovinos endotélio corneano

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar a comunicação intercelular por meio de canais de junções comunicantes e canais HEMI mediante a quantificação da propagação da onda intercelular de cálcio provocada por estimulação mecânica em monocamadas de células endoteliais corneanas primárias. Isso é alcançado primeiramente isolando-se as células endoteliais corneanas primárias de olhos bovinos frescos. Em um segundo passo, dois a três dias após a semeadura em lâminas com câmara, a monocamada confluente de células é carregada com o corante fluorescente sensível ao cálcio flu O 4:00 AM. Em seguida, aplicamos um estímulo mecânico controlado e localizado a uma única célula da monocamada para provocar uma onda intercelular de cálcio, que é visualizada no microscópio confocal.

Os resultados mostram a propagação da onda intercelular de cálcio. A inibição final dos canais de junções comunicantes e canais HEMI é utilizada para desvendar as propriedades e regulação de diferentes isoformas de conexinas e panexinas que formam canais de junções comunicantes e canais HEMI. A principal vantagem da propagação da onda intercelular de cálcio induzida por estimulação mecânica é que fornece um método simples e confiável para examinar a contribuição e as propriedades dos canais de conexão e axiais de maneira não invasiva.

Além disso, o método baseia-se nas moléculas e cascatas de sinalização fisiológicas presentes nos sistemas celulares estudados. Por fim, é facilmente adaptável a uma variedade de sistemas celulares, incluindo células primárias e modelos celulares que expressam ectopicamente certas isoformas de conexina ou PanIN. Este método pode fornecer informações sobre a função e a regulação dinâmica dos canais de junção do tipo conexina e PanIN e canais HEMI, por meio do uso de RNA de interferência mediado por silenciamento gênico de conexinas ou isoformas de PanIN endógenas e pelo uso de inibidores seletivos de canais de junção do tipo conexina e canais HEMI.

Este sistema certamente não se limita apenas às células endoteliais corneanas. É adaptável a praticamente qualquer tipo celular e também a tecidos mais complexos. Este procedimento utiliza um olho recém-enucleado de bovino com no máximo 18 meses de idade e não mais do que cinco minutos pós-morte.

Isso foi transportado para o laboratório em solução salina balanceada de Earl e solução de iodo a 1% a quatro graus Celsius. Primeiro, transfira o olho para uma placa de Petri de 100 milímetros por 20 milímetros. Em seguida, lave o olho com EBSS contendo iodo a 1%.

Em seguida, esterilize com uma solução contendo 70% de etanol a partir deste ponto. Trabalhe em uma câmara de fluxo laminar estéril. Disseque cuidadosamente a córnea do olho e coloque-a em uma placa de Petri de 35 milímetros por 10 milímetros contendo EBSS, com a camada de células epiteliais voltada para cima.

Remova cuidadosamente qualquer tecido da íris ainda aderido à córnea. Se necessário, transfira a córnea para outro recipiente com EBSS, com a camada de células endoteliais voltada para cima, e depois lave duas vezes com EBSS. Em seguida, posicione a córnea com a camada endotelial voltada para cima em um vaso em forma de ampulheta e cubra com meio de crescimento.

Para enxaguar, remova o meio com uma pipeta de sucção. Aplique 300 microlitros de solução de tripsina a 0,5 grama por litro na camada endotelial da córnea. Coloque o relógio de areia contendo a córnea em uma placa de Petri tampada e transfira para a incubadora por 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Após recuperar o relógio de areia, remova suavemente as células endoteliais da córnea com uma pipeta de Pasteur de vidro em forma de gancho polido ao fogo. Aspire a solução contendo as células endoteliais e adicione-a a um frasco de cultura quadrado de 25 centímetros quadrados contendo quatro mililitros de meio de cultura. Em seguida, aplique 300 microlitros de meio de crescimento à córnea.

Repita a raspagem e adicione a solução contendo as células endoteliais ao frasco de cultura. Repita este passo mais uma vez, então coloque os frascos de cultura contendo as células endoteliais da córnea no meio de crescimento dentro da incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Dois dias depois, adicione seis mililitros de meio de cultura e renove o meio de crescimento a cada dois dias.

As células devem atingir confluência entre sete a dez dias após o isolamento até a repicagem. Primeiro, aspire o meio de cultura e depois enxágue duas vezes com EBSS. Em seguida, adicione dois mililitros da solução tripsina à cultura celular e coloque o frasco no incubador por três a quatro minutos.

Em seguida, adicione 12 mililitros de meio de crescimento e pipete o meio três vezes para dentro e para fora para dispersar as células. Em seguida, conte as células utilizando um hemocitômetro ou contador celular automatizado. Adicione 165.000 células a lâminas de cultura de duas cavidades.

Em seguida, prepare frascos de cultura quadrados de 75 centímetros quadrados para uma nova passagem numa densidade de 6.250 células por centímetro quadrado e adicione meio de cultura fresco até um volume total de 25 mililitros; coloque os frascos e as lâminas com câmara no incubador. O meio é renovado a cada dois dias e a confluência da camada celular deve ser atingida em três a quatro dias. Primeiro, carregue as células na lâmina com câmara com 10 micromolar de fluo-4 AM em solução salina tamponada com fosfato durante 30 minutos a 37 graus Celsius com agitação suave enquanto as células estão incubando em fluo-4 AM. Acople uma micropipeta de vidro com diâmetro da ponta inferior a um micrômetro a um nano posicionador piezelétrico e conecte a um amplificador montado em um micromanipulador.

Defina a tensão do nano posicionador entre 0,2 e 1,5 volts. Remova o flu da solução das 4:00 AM. Em seguida, lave as células cinco vezes com solução salina tamponada com fosfato e, depois, incube as células com PBS por pelo menos cinco minutos à temperatura ambiente antes da medição.

Excite com 488 nanômetros utilizando laser de argônio e use o divisor de feixe HFT 48. Colete a emissão fluorescente em 530 nanômetros utilizando um filtro de emissão passa-longa, LP 5 0 5, com o diafragma de pinhole ajustado no mínimo; aqui, utiliza-se uma objetiva de imersão a óleo de 40 x. Coloque a lâmina com câmara sobre a platina de um microscópio confocal e localize uma região com células confluentes.

Em seguida, mova o micromanipulador para posicionar a micropipeta de vidro de modo que toque a membrana celular em um ângulo de 45 graus. Opere o micromanipulador para tocar brevemente menos de 1% da membrana de uma única célula com a micropipeta de vidro e provocar uma estimulação mecânica de um segundo na célula. Em seguida, meça as alterações espaciais na concentração de íons cálcio após a estimulação mecânica, coletando e armazenando imagens com um microscópio confocal.

Por fim, desenhe uma região de interesse poligonal para definir a área superficial total de células responsivas utilizando o software do microscópio confocal. Transientes de cálcio induzidos por estimulação mecânica são mostrados em diferentes pontos de tempo em condições controle em células endoteliais corneanas bovinas por meio de imagens representativas de fluorescência com pseudo cores; as intensidades de fluorescência antes da estimulação são mostradas na primeira imagem. A seta branca na segunda imagem identifica a célula estimulada mecanicamente.

A onda de cálcio propaga-se por seis camadas celulares vizinhas, atingindo uma área total de células que resulta em uma área ativa de 62.870 micrômetros quadrados. O gráfico de linhas mostra a evolução temporal do valor de fluorescência normalizado ou FN na célula mecanicamente estimulada, identificada como ms, e o valor médio do FN nas camadas celulares vizinhas de um a cinco, rotuladas no gráfico como MB um a MB cinco. Essas imagens mostram alterações significativas na propagação das ondas de cálcio intercelulares após tratamento com nucleotídeos exógenos no gráfico à esquerda e após tratamento com inibidores da ectonucleotidase no gráfico à direita. Em maior detalhe, o gráfico à esquerda mostra uma diminuição significativa da área ativa após o tratamento de células endoteliais corneanas bovinas com a ectonucleotidase exógena Aras seis e sete, que hidrolisam ATP e ADP, inibindo assim a via de comunicação intercelular paracrina.

O asterisco indica um valor de P inferior a 0,001 na presença versus ausência de ace. O gráfico à direita mostra um aumento significativo na área ativa após o tratamento de BCEC com um inibidor seletivo de ectonucleotídeo, A RL 6 7 1 56, potencializando assim a via de comunicação intercelular pericrina. O asterisco indica um valor de P inferior a 0,001 na presença versus ausência de a RL Uma vez dominado.

Essa técnica pode ser realizada em cinco a 10 minutos para um experimento em uma condição, quando realizada corretamente. Realizar uma série completa de experimentos, a partir dos quais seja possível comparar diferentes condições, leva um dia para se obter conclusões estatísticas. Devem ser utilizados experimentos independentes realizados em dias diferentes e a partir de diferentes lotes de células isoladas.

A medição e a quantificação da propagação da onda de cálcio intracelular permitem a identificação e a caracterização da regulação biológica celular de diferentes conexões e isoformas de canais de junção do tipo gab e canais HEMI. Gostaria também de destacar que este método não é isolado, mas deve ser complementado por outras abordagens moleculares e funcionais, que vão da transferência de dieta à liberação de TP e à eletrofisiologia.