Name: Aquisição de fluorescência Filmes Time-lapse da levedura de brotamento e análise da dinâmica de células simples utilização de enxertos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 1 s
Description: Aprenda a capturar filmes de fluorescência de leveduras em câmara microfluídica e analisar séries temporais de células individuais com o software graft. Este método permite estudar dinâmica celular e regulação transcricional.

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Agradecemos Emily Jackson, Joshua Zeidman, e Nicholas Wren para comentários sobre o software. Este trabalho foi financiado pelo GM95733 (para NM), BBBE 103.316 e MIT fundos de inicialização (para NM).

<ol><li>Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).</li>
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<li>Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+stochastic+switching+revealed+by+single-cell+genealogy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy.</a> PLoS Biology. 5 (9), e239(2007).</li>
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<li>Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+temporally+controlled+gene+expression+and+long-term+fluorescent+imaging+in+unperturbed+dividing+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells.</a> PloS One. 3 (1), e1468(2008).</li>
<li>Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+quantification+of+molecules+and+rates+using+open-source+microscope-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry.</a> Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Sys.+Man.+Cyber%22%5BJournal%5D)">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).</li>
<li>Goranov, A. I., Cook, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+cell+growth+is+governed+by+cell+cycle+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The rate of cell growth is governed by cell cycle stage.</a> Genes & Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).</li>
<li>To, T. -L., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+Can+Induce+Bimodality+in+Positive+Transcriptional+Feedback+Loops+Without+Bistability%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability.</a> Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).</li>
<li>O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+PHO4+nuclear+localization+by+the+PHO80-PHO85+cyclin-CDK+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex.</a> Science. 271 (5246), 209-212 (1996).</li>
<li>Raser, J. M., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+stochasticity+in+eukaryotic+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of stochasticity in eukaryotic gene expression.</a> Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O protocolo acima descreve um método simples de se obter e analisar fluorescência dados de séries temporais com experiência limitada em microfluídica ou no desenvolvimento de software. Ele permite a obtenção de time-lapse filmes de fluorescência das células de levedura de solteiro; extrair o tamanho da célula relevante e medições de expressão; rastreamento cura e atribuições da linhagem, e analisar o comportamento de células inteiras ao longo do tempo usando um dispositivo cultura microfluídicos comercialmente disponíve...

Análise de uma única célula da expressão gênica tem promovido a nossa compreensão de muitos aspectos da regulação gênica. Instantâneos estáticos de expressão repórter fluorescente utilizando citometria de fluxo ou microscopia de fornecer informações úteis sobre a distribuição de expressão de uma única célula, mas falta a história ea evolução dos dados de séries temporais obrigados a informar diretamente a dinâmica de expressão gênica. Microscopia de lapso de tempo de fluorescência apresenta um meio para obter ambas as medições de uma única célula e sua história. As várias técnicas experimentais e analíticas foram desenvolvidos para a obtenção de filmes e quantificar a expressão de repórter fluorescente, comunicando assim insights características de regulação de genes (ver 1 para uma revisão), tais como variação de célula para célula de 2,3, a formação bacteriana persistidor 4, transcrição iniciação e alongamento 5, transcricional estourando 6,7, a dependência do ciclo celular 8,9 e herdabilidade 10. Contudo, obtaining qualidade séries cronológicas de fluorescência de uma única célula envolve desafios técnicos significativos, em cultura de uma monocamada de células em um ambiente controlado e quantificação de elevada capacidade de os filmes de fluorescência adquiridos. Aqui, descrevemos um procedimento para obter e analisar filmes de fluorescência de S. cerevisiae sem experiência requerida na fabricação do dispositivo de cultura de células ou no desenvolvimento de software (Figura 1). Primeiro, vamos detalhar um protocolo de exemplo para gerar filmes de séries temporais de fluorescência para a levedura de brotamento expressar um ou mais repórteres fluorescentes. Embora câmaras cultura microfluídicos personalizados foram construídas e empregada com sucesso anteriormente 11-13, usamos um dispositivo micro disponível comercialmente a partir de CellAsic (Hayward, CA). As células do sistema limita-se a crescimento em monocamada e permite o controle permanente do meio ambiente de perfusão. O protocolo de microscopia que apresentamos é uma forma simples de se obter fluoresfilmes cia de levedura de brotamento, mas qualquer protocolo modificado experimental (um dispositivo de cultura personalizada, condições de mídias alternativas, etc.) produzindo dados do filme de fluorescência semelhantes de células de levedura único pode ser substituído. A seguir, destacamos a análise dos filmes com uma interface gráfica de usuário (GUI) baseada em software em MATLAB (Mathworks, Natick, MA), apelidado de GUI para rápida análise de séries temporais de fluorescência (ENXERTOS), para extrair dados de séries temporais para células individuais. ENXERTOS tem características semelhantes ao versátil, open-source software pacote Cell-ID 14 na segmentação e rastreamento de células e na extração de intensidade de fluorescência e de informação geométrica. No entanto, os enxertos fornece recursos adicionais importantes. Primeiro, ela oferece edição interativa fácil de segmentação e acompanhamento dos resultados a fim de verificar a exatidão dos dados, ao invés de apenas gating estatística de traços região outlier após análise. Além disso, estende-se a análise para automatically designado linhagem e pontos de interesse da levedura de brotamento do ciclo celular. Determinar quando mãe e filha dividem para formar duas regiões de células independentes é crucial para determinar células inteiras (mãe incluindo qualquer broto conectado) medições ao longo do ciclo celular 8. A suite é composta por três módulos para realizar essas tarefas. As primeiras regiões celulares segmentos baseados no contraste entre as imagens de campo claro foco e fora de foco, e permite ao usuário definir e testar visualmente parâmetros de segmentação. O segundo faixas (. Usando Blair e implementação de Dufresne MATLAB do Crocker et al rotina IDL, disponível em: <a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/" target="_blank">http://physics.georgetown.edu/MATLAB/</a> ) e medidas de regiões celulares através do tempo; atribui automaticamente linhagens, e permite a inspeção visual e correção de erros. A GUI plotagem simples é incluído para propriedades de uma única célula de consulta. O terceiro módulo atribui bud surgimento e divisão times, células inteiras e gera dados de séries de tempo, bem como as suas primeira e segunda derivadas de tempo (como discutido em 9). O módulo de análise gera os dados como um arquivo de texto delimitado por espaço para o estudo subsequente no software estatístico de escolha. Assim, o pacote permite ao usuário extrair dados de alta qualidade da série de tempo através de uma interface gráfica. Nós temos utilizado este método para estimar as taxas de transcrição em tempo real em células individuais de levedura de brotamento como uma função do ciclo da célula 9. Embora os módulos foram optimizados para a levedura de brotamento, os parâmetros, ou, se necessário, o código livremente disponíveis podem ser adaptados para outros organismos e tipos de imagem. Segmentação, Seguimento e linhagem algoritmos de atribuição pode ser específica para tipos de imagem atribuída eo organismo em questão. Os algoritmos existentes poderia ser substituído, mas ainda mantêm a interface gráfica que permite inspeção user-friendly visual e correção de erros de segmentação e rastreamento que invariavelmente ocur com qualquer algoritmo.

<table><tbody><tr><td>Placa de perfusão de levedura Y04C</td><td>CellAsic</td><td>Y04C-02</td><td></td></tr><tr><td>ONIX Plataforma de perfusão microfluídica</td><td>CellAsic</td><td>EV-262</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 Microscópio</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63x/1.40 Objetiva DIC de óleo</td><td>Zeiss</td><td>440762-9904-000</td><td></td></tr><tr><td>Câmera Cascade II EMCCD</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada de arco de halogeneto metálico Lumen 200</td> Conjunto de cubo de filtro dicróico de passagem tripla e excitação e emissão <td>da PRIOR Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr>Conjunto de<td>filtros de emissão e excitação Chroma</td><td>Technology Corp</td><td>conjunto #89006</td><td>Usado para YFP (Vênus/Citrino), CFP (Ceruleano), RFP (mCherry/tdTomato)</td></tr><tr><td>Controlador MAC 5000 e rodas de filtro</td><td>Ludl Electronic Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2011a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>A versão de 64 bits lida com arquivos de dados grandes melhor do que a de 32 bits</td></tr></tbody></table>

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Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Microscopia de lapso de tempo de fluorescência tornou-se uma ferramenta poderosa no estudo de muitos processos biológicos ao nível de uma única célula. Em particular, os filmes que descrevem a dependência temporal da expressão gênica fornecer insights sobre a dinâmica de sua regulamentação, no entanto, existem muitos desafios técnicos para a obtenção e análise de filmes de fluorescência de células individuais. Descrevemos aqui um protocolo simples, usando um dispositivo de cultura microfluídicos disponível comercialmente para gerar esses dados e uma interface baseada em MATLAB gráfica do usuário (GUI) baseada em software para quantificar as imagens de fluorescência. Os segmentos de software e células pistas, permite ao usuário curadoria visualmente erros nos dados e automaticamente atribui linhagem e os tempos de divisão. A GUI analisa a série mais tempo para produzir vestígios de células inteiras, bem como as suas primeira e segunda derivadas de tempo. Enquanto o software foi concebido para S. cerevisiae, a sua modularidade e versatilidade deve permitir que ele tó servir como uma plataforma para o estudo de outros tipos de células, com poucas modificações.

Uma experiência realizada com sucesso e analisados ​​trará séries temporais principalmente contínuo para células inteiras individuais com surgimento bud realisticamente atribuído e os tempos de divisão. Como exemplo, foi realizado o protocolo anteriormente referido, com uma estirpe haplóide de levedura expressando uma cópia integrada de proteína fluorescente Cerúlea (PCP), impulsionada pela constitutivo promotor ADH1 observar como o crescimento e expressão global pode variar ao longo do tempo em célula...

Nós apresentamos um protocolo simples de se obter filmes de microscopia de fluorescência de crescimento de células de levedura, e um pacote de software baseado em GUI para extrair dados de séries temporais de uma única célula. A análise inclui linhagem automatizada e divisão atribuição tempo integrado com inspeção visual e curadoria manual de dados controladas.

Aquisição de fluorescência Filmes Time-lapse da levedura de brotamento e análise da dinâmica de células simples utilização de enxertos

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

O objetivo geral deste procedimento é obter filmes de fluorescência de células individuais de levedura em crescimento e extrair séries temporais de expressão do repórter para cada célula. Isso é realizado primeiramente cultivando uma monocamada de células em uma câmara microfluídica. O segundo passo consiste em realizar microscopia de fluorescência com lapso de tempo para um ou mais repórteres.Em seguida, os filmes são processados usando o pacote de software graft para rastrear e medir as células ao longo do tempo. O passo final consiste em analisar as medidas celulares e as atribuições de linhagem e exportar séries temporais de expressão do repórter para cada célula inteira. Em última instância, uma taxa de transcrição instantânea inferida a partir das séries temporais de expressão é utilizada para demonstrar alterações na transcrição tanto ao longo do ciclo celular quanto em resposta a variações nos níveis de fatores de transcrição.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de regulação gênica, como, por exemplo, com que rapidez diferentes promotores respondem à adição repentina ou à remoção de um fator de transcrição ativo. Quão variável é essa resposta e

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Biologia

Deleção do gene e superexpressão da proteína são métodos comuns para o estudo funções das proteínas. Neste artigo, descrevemos um protocolo para análise do desenvolvimento do fenótipo como uma função da concentração de proteína na população e de uma única célula em...

Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento

Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Fornecemos um método básico reprodutível para a microscopia de longo prazo do ciclo de vida sexual da levedura de fissão. Com pequenos ajustes descritos, o protocolo apresentado permite que a pesquisa se concentre em diferentes etapas do processo reprodutivo.

Microscopia de fissão de levedura Ciclo de Vida Sexual

A quantificação precisa dos eventos de tráfego vesicular geralmente fornece informações importantes sobre os papéis de proteínas específicas e os efeitos das mutações. Este artigo apresenta métodos para o uso da pHluorina supereclíptica, uma variante de GFP sensível ao pH, como ferramenta para quantificação de eventos endocíticos em células vivas usando microscopia de fluorescência quantitativa e citometria de fluxo.

Aplicações de pHluorin para Quantitative, Kinetic e de alta capacidade: Análise de endocitose em brotamento Yeast

Este artigo apresenta um protocolo optimizado para a produção de batatas fritas de microfluidos e a configuração de experiências de microfluidos para medir o tempo de vida e fenótipos celulares de células de levedura individuais.

Usando dispositivos microfluídicos medir Longevidade e Celular fenótipos em células individuais levedura de brotamento

Budding levedura é um modelo vantajoso para o estudo da dinâmica dos microtúbulos in vivo, devido às suas poderosas da genética e a simplicidade do seu citoesqueleto de microtúbulos. O protocolo a seguir descreve como transformar e cultura de células de levedura, adquirir imagens de microscopia confocal, e quantitativamente analisar a dinâmica dos microtúbulos em células de levedura viva.

Imagens de alta resolução e Análise de individuais Astral microtúbulos Dynamics em brotamento Yeast

Este protocolo descreve a análise de compartimentos intracelular cDNAs etiquetados no fermento de brotamento usando a microscopia confocal 4D (Time-Lapse 3D) multi-color. Os parâmetros de imagem são escolhidos para capturar sinais adequados, limitando o Fotodano. Os plugins personalizados do ImageJ permitem que as estruturas rotuladas sejam rastreadas e analisadas quantitativamente.

4D microscopia de levedura

Aqui, nós apresentamos a imagem latente da viver-pilha que é um método não-tóxico da microscopia que permita investigadores de estudar o comportamento da proteína e a dinâmica nuclear em pilhas vivas do fermento da fissão durante o mitose e o meiosis.

Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

A levedura de fissão é usada aqui como um hospedeiro heterólogo para expressar proteínas bacterianas do citoesqueleto, como FtsZ e MreB, como proteínas de fusão translacional com GFP para visualizar sua polimerização. Além disso, os compostos que afetam a polimerização são identificados por imagens usando um microscópio de fluorescência.

Levedura de fissão como plataforma para triagens de drogas antibacterianas direcionadas a proteínas do citoesqueleto bacteriano

Este protocolo detalha dois métodos de parada do ciclo celular de levedura e liberação opcional, e elabora o uso de microscopia de fluorescência para estudar processos dependentes do ciclo celular em S. cerevisiae.

Manipulação e Análise de Processos Dependentes do Ciclo Celular em Leveduras de Brotamento

Aprenda a capturar filmes de fluorescência de leveduras em câmara microfluídica e analisar séries temporais de células individuais com o software graft. Este método permite estudar dinâmica celular e regulação transcricional.

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