Name: Engenharia de Tecidos de um 3D Humano In vitro Sistema de Teste de Tumor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-06T08:56:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprenda a construir modelos 3D de tumores humanos usando BioVaSc descelularizado e células primárias. Este método permite cultivar tecidos em condições estáticas ou dinâmicas para estudar progressão tumoral e metástase.

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Os autores gostariam de agradecer a Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) por seu apoio técnico para desenvolver biorreatores e incubadora biorreator.

1. Decelularização do BioVaSc <ol><li> Lave o sistema vascular do segmento jejunal suína via de acesso arterial canulada e lúmen intestinal com PBS -. Repita até que esteja completamente limpa. </li><li> Prepare um tanque de vidro diâmetro 200 mm 4 adaptadores e conectá-los através de tubos de silicone para a bomba peristáltica (Ismatec). A pressão da unidade de controle pode ser monitorizada por meio de um sensor de pressão que está conectado a uma cúpula descartável estéril (ver Figura 1). </li><li> Preencha garrafas de reservatório com solução decellularization (DZ) e verifique o sistema de tubulação para possíveis bolhas de ar. </li><li> Conecte o lúmen intestinal com abraçadeiras aos conectores de vidro para o fluxo luminal. Bomba de 500 ml de solução em DZ acesso arterial vermelho (Figura 1B), do sistema vascular. Interromper o processo de bombeamento a cada 15 minutos, logo a pressionar manualmente o lúmen intestinal inteiras. </li><li> Durante o decellularizatino processo, a pressão da solução tampão deve ser entre 80 - 100 mm de Hg, modelada após a pressão natural do sangue. </li><li> Lave o BioVaSc com PBS - até que ele esteja livre de restos celulares (&quot;completamente branco&quot;). </li><li> Encha o BioVaSc completamente com solução DZ e incubar-lo submergir em solução DZ durante a noite a 4 ° C em balanço shaker. </li><li> Repita o passo 1.6. </li><li> Coloque a BioVaSc em solução de DNase e incubar durante a noite a 4 ° C agitando agitador. </li><li> Remover solução DNase e enxágüe com tampão de lavagem. </li><li> γ-esterilização com 25 kGy </li></ol> 2. Os diferentes tipos de células 2.1 Isolamento de células primárias humanas dérmicas microvasculares endoteliais (mvECs) e fibroblastos <ol><li> Corte biópsia da pele (de preferência prepúcio) em tiras de 2-3 mm de largura, com bisturi e lavá-los 3x com PBS - solução. </li><li> Cubra o tecido com solução Dispase e incube-o para 16 - 18 horas a 4 ° C. </li><li> Epiderme Separe derme com duas pinças e transferir tanto separadamente em placas de Petri cheias de PBS +. </li><li> Derme Lavar tiras 1x com Versene. </li><li> Adicionar 10 ml de solução de tripsina / EDTA para as tiras da derme e incube-na incubadora durante 40 min. </li><li> Parar a reacção enzimática imediatamente com 1% de FCS. </li><li> Transferir tiras de pele de uma placa de Petri cheia de VascuLife e riscar cada tira com o bisturi 8x cada lado, a adição de um pouco de pressão. </li><li> Transferência da suspensão de células produzidas por meio de um filtro de células para um tubo de centrífuga e lavar 3x coador de células com VascuLife. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 1.200 g durante 5 min e ressuspender o sedimento de células com VascuLife. </li><li> Para isolar os fibroblastos, derme costeleta tiras em pequenos pedaços usando o bisturi. </li><li> Adicionar 10 ml de solução de colagenase a derme pedaços. </li><li> Incubar lo por 45 minutos na incubadora, em seguida, centrifugar-lo e remova cuidadosamente supernatant. </li><li> Lave 1x de pelotização com DMEM + 10% SFB +% Penstrep, centrífuga-lo e remova cuidadosamente o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em meio de cultura e transferi-lo para uma garrafa de cultura T75 para permitir que as células a crescer para fora do tecido. </li></ol> Linha 2.2 Tumor celular S462 A linha de células tumorais S462 (gentilmente cedido pelo Dr. Nikola Holtkamp, ​​da Universidade Charité de Berlim Medicine) foi gerada a partir de um tumor maligno da bainha do nervo periférico de uma paciente com a síndrome de predisposição hereditária do tipo tumor neurofibromatose 1 9. S462 são cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FCS. Médio tem de ser mudado cada 2 - 3 dias. Depois de uma semana, as células têm que ser divididos. 3. Tumor Sistema de Teste: Static Condições Cultura comparado à cultura dinâmica em sistemas biorreator <ol><li> Corte o tubular SIS-Muc abrir de um lado e corrigi-lo entre dois anéis de metal (coroas celulares, 10 mm de diâmetro, auto constructed). Cubra o SIS-Muc em meio de cultura de células durante a noite. </li><li> Células de sementes isolado no número de células definidos (veja abaixo) em um ou ambos os lados do SIS (mono ou co-cultura set-up). <ol><li> Semente de 8000 células / cm 2 de mvECs primárias em um volume total de 100 ul para a superfície basolateral do SIS (ex serosa). 3 horas depois encher o poço com meio para assegurar uma cultura submersa. </li><li> Permitir que as células endoteliais a aderir durante 3 dias. Virar o sistema de cultura estática, 180 ° e transferi-lo para uma placa de 12 poços. </li><li> Semente de uma mistura de fibroblastos dérmicos primários (8000 células / cm 2) e as células tumorais (15.000 células / cm 2) dentro de um volume total de 500 mL sobre a superfície apical do SIS (o lado dos ex-lúmen). </li><li> Permitir que as células a aderir durante 3 horas e encher o poço com meio (cultura submersa, média: 50% Vasculife + 50% DMEM suplementado com 10% de FCS). </li><li> O sistema de teste do tumor é cultivada sob condições estáticas umt 37 ° C, 5% de CO 2 na incubadora durante mais 14 dias. Alterar o meio de cultura a cada 2 - 3 dias. </li></ol></li><li> Para a cultura dinâmica, corrigir o SIS-Muc entre dois anéis de metal e sementes mvECs primários como descrito em 3.2.1. Após 3 dias remover o SIS-Muc dos anéis de metal e inserir a membrana para o reactor de fluxo (ver Figuras 2C e 2D). Aplicar a fibroblastos dérmicos e as células de tumor primário com uma seringa e da cânula para a matriz no bioreactor, e permitir que as células a aderir durante 3 h antes de encher o sistema de biorreactor com meio de cultura. </li><li> Nos dias seguintes condições dinâmicas da cultura, com fluxo constante de meio (3,8 ml / min, 37 ° C, e 5% de CO 2) pode ser iniciada. A cultura dinâmica é mantida por 14 dias, o meio de cultura é mudado depois de 7 dias. </li><li> A configuração do teste dinâmico é cultivada em uma incubadora de construção própria que fornece fluxo de mídia através de uma bomba ea temperatura necessária e CO 2 </sub&gt; Conteúdo. </li></ol> 4. Métodos de caracterização para Análise 4.1 Fixação e parafina-incorporação da matriz de colágeno semeadas <ol><li> Para (imuno-histológicos) caracterizações remover o meio de cultura e fixar o tecido com paraformaldeído a 4% para 2 horas. </li><li> Retirar 4% de paraformaldeído e transferir o SIS a partir da inserção de metal para uma cassete de tecido incorporação. Regue o tecido para remover fixador restante e desidratar por infiltração de parafina. </li><li> Antes de incorporar em um bloco de parafina, corte o SIS em 2-3 fatias e coloque-as em um metal base de molde cheio de parafina de modo que as superfícies cortadas de bruços. Adicionar a cassete de tecido no topo do molde como um suporte. </li><li> Cortar fatias de 5 mM e eles flutuam sobre um banho de água a 40 ° C para endireitar, em seguida, montar as lâminas em lâminas de vidro adequados. Lâminas não revestidos são usados ​​para H &amp; E manchas, lâminas revestidas com polilisina para coloração imuno melhorar anexo.Deixe as fatias secar completamente. </li><li> Derreta a parafina, retire-o com xileno e hidratar fatias para após coloração. </li></ol> 4.2 Coloração <ol><li> Os cortes reidratados pode ser manchado com Hematoxilina / Eosina como uma coloração visão padronizada. </li><li> Para a coloração immunhistological, fixa e fatias de tecido infiltrado com parafina deve ser submetido a uma recuperação de antigénios para permitir que os anticorpos para reconhecer e ligar-se aos seus epitopos específicos. Assim, lâminas desparafinizadas e re-hidratadas são colocadas numa panela de vapor com tampão citrato aquecido (pH 6.0) durante 20 min. </li><li> Lâminas de transferência para tampão de lavagem (0,5 M tampão TBS + 0,5% Tween) e fatias de círculo com uma caneta PAP para minimizar o volume necessário para as soluções de coloração. </li><li> Coloque o slide em uma câmara de umidade. Para garantir uma visualização mediada por peroxidase específico de antigénio-anticorpo de ligação, a peroxidase endógena deve ser saturada com 3% de peróxido de hidrogénio. </li><li> ANTIB primáriadiluições ody são aplicados às fatias, incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente e cuidadosamente lavado com tampão de lavagem. </li><li> Para a detecção de ligações antígeno-anticorpo específicos do Ultra Visão Quanto Detection System HRP DAB (Thermo Scientific) é usado de acordo com o protocolo recomendado. </li><li> Os núcleos são contrastadas com hematoxilina durante 1 min. </li><li> As lâminas são montadas com um meio aquoso, secou-se, e visualizados utilizando um microscópio invertido. </li></ol>

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</ol>

Autores têm nada a revelar.

<html> Ao comparar os sistemas de cultura em 2D e 3D em pesquisa do tumor, sistemas 3D, apesar de ser a abordagem mais caro, provaram para imitar as condições em microambientes biológicos melhor. Pode ser mostrado que algumas células de tumor crescer muito mais lenta em cultura em 3D de uma cultura em 2D comum 12, o qual está em conformidade com a situação em tumores reais. Bissell e colaboradores mostraram no seu trabalho que o comportamento de células cancerígenas da mama reflecte a situação in vivo, incluindo a morfologia celular e de sinalização, de forma mais precisa, quando uma cultura 3D dentro de uma matriz oferece as interacções célula-ECM. Além disso, eles enfatizaram a importância do meio extracelular em 3D, demonstrando que as mudanças nas interações ambientais levou à reversão das células malignas a um fenótipo normal. Além disso e mais importante ainda, estes resultados podem também ser confirmada em modelos animais in vivo 10,11. ONTEÚDO &quot;&gt; A comparação direta de experimentos in vivo em animais e em modelos in vitro de tecido revela vantagens e desvantagens em ambos os sistemas. Uma das vantagens de modelos in vitro é a permissão de um real-time muito melhor ou imagem fixa por microscopia. Uma limitação é que eles imitam condições estáticas ou de curto prazo, ao passo que sistemas in vivo, muitas vezes o progresso. A atual falta de vascularização e transporte normal de pequenas moléculas, resposta imune do hospedeiro, e outras interações célula-célula são outras desvantagens de modelos in vitro 12. Portanto, 3D em sistemas in vitro, tal como apresentado neste estudo oferecem um complemento promissor para experimentos com animais. Eles fornecem uma melhor comparabilidade com o organismo humano e, portanto, minimizar erros de interpretação experimentais. Biomiméticos em sistemas modelo vivo será, portanto, tornam-se mais relevantes para estudar como o câncer e metástase é dependente em condições micro-ambientais que regulam tumorigenesis 11. O nosso estudo mostra que o ambiente 3D fornecida pelo SIS-Muc conduz a uma formação mais tumoral tecido de células, a qual não é observada na cultura de células em 2D comum (ver Figura 3A). Além disso, o uso de células primárias derivadas de biópsias de tumores é um passo muito importante para a medicina personalizada, uma disciplina que tem por objetivo identificar o melhor tratamento, dependendo das necessidades individuais do paciente. A incorporação de células primárias de tumor específicos do paciente, isolado a partir de material de biopsia permitirá em testes in vitro de estratégias terapêuticas. Tais sistemas de teste, será possível investigar diferentes drogas e suas combinações, com um tempo de e rastreio de alto rendimento de poupança de custos. Além disso, a integração das células do estroma associado a tumores, como mostrado neste estudo, é importante para a abordagem personalizada, uma vez que a progressão influências do microambiente do tumor um tumor de 13 e pode revelar-se como suitabalvo terapêutico le. Como alternativa a uma abordagem personalizada, o nosso modelo de tumor pode ser modificado para servir como um sistema de teste do tumor generalizada pela incorporação de linhas de células tumorais estabelecidos. Esta é uma adaptação promissor para fins de pesquisa básica. Para ambos os testes de drogas aproxima da presença de uma estrutura vascular necessária para testar a distribuição e absorção de substâncias terapêuticas. A matriz SIS-Muc permite a semeadura basolateral com MVEC primário para estudos de captação de barreira, o repovoamento das estruturas vasculares preservadas da BioVaSc irá melhorar ainda mais o estudo de entrega de drogas. A fim de criar modelos de tecidos, uma matriz biodegradável 3D pode ser utilizado como uma estrutura para a co-cultura de diferentes tipos de células 14. O uso de tais matrizes 3D é frequentemente limitada pela falta de uma vascularização funcional. Este problema pode ser resolvido pela utilização do BioVaSc, que oferece preservada str vaso sanguíneouctures, o qual pode ser re-semeadas com células endoteliais. Além disso, o BioVaSc fornece componentes extracelulares, que garantem a aderência das células e facilitar a diferenciação de tecidos. Ele também permite que a função específica do tecido de longa data de bioartificial tecidos 3D 7,8,15. O pré-requisito para a engenharia dos substitutos vasculares funcionais é a imitação de fisiológica humana e condições biomecânicas. Portanto, sistemas de biorreatores, que pode implementar estes requisitos in vitro, são de extremo interesse para a criação de modelos de tumores biológicos. A combinação do BioVaSc, a tecnologia de bio-reactor e co-cultura de diferentes tipos de células é um método muito promissor para gerar tecidos de tumor vascularizado, o que permitirá o estudo de mecanismos relevantes para a progressão do cancro, tais como angiogénese e metástase. Vemos tais modelos de tumor como uma abordagem promissora para complementando os estudos animais, fornecendo um equivalentepara a fisiologia do tumor humano.

Novos produtos farmacêuticos devem ser validados em relação à sua qualidade, segurança e eficácia antes da autorização de mercado. Até o momento, experimentos com animais são o método padrão para o teste e validação de drogas. No entanto, devido às diferenças específicas de espécies, as experiências com animais, muitas vezes não avaliar exaustivamente o efeito dos compostos em humanos 1. Por esta razão, é importante para gerar modelos de tecidos humanos que podem ser utilizados para testes in vitro de novos medicamentos e substâncias. Um dos focos do nosso grupo é a criação de modelos em teste in vitro com o nosso andaime vascularizado biológico (BioVaSc) 2,3. O BioVaSc pode ser usado como um sistema de matriz em 3D estático ou dinâmico. Para a cultura estática, o segmento jejunal suína descelulada (Small Intestinal Submucosa SIS-MUC) é colocado em uma pastilha de metal para reseeding celular. Várias células, tais como o câncer e as células endoteliais podem ser cultivadas no cadafalso. <pclasse = &quot;jove_content&quot;&gt; Para a cultura dinâmica, o BioVaSc está ligado a um sistema de bioreactor de fluxo que se aplica em toda a vasculatura ou em toda a superfície do andaime. Biorreatores atuais implementar estímulos biológicos, mecânicos ou elétricos que agem sobre a diferenciação ou proliferação de células 4. Para biorreatores no campo da engenharia de tecidos, o conceito básico é o de simular as condições do corpo humano. Em que, as células são fornecidos um ambiente natural em que eles possam interagir uns com os outros e a sua matriz extracelular circundante. Para a produção de sistemas de teste in vitro ou de transplantes, a capacidade de imitar o ambiente natural das células com uma estrutura de suporte adequada e um sistema de bioreactor é crítico 5. Portanto, os dispositivos mais complexos e tecnicamente exigentes devem ser desenvolvidas a fim de cumprir essas tarefas 6. Além disso, é possível usar o nosso andaime para o establishment de um modelo vascularizado devido às estruturas tubulares conservados, os quais incluem a alimentação da artéria, veia, e o leito capilar de ligação. Todas as células de suíno têm de ser removidos por descelularização química, mecânica e enzimática, e o andaime esterilizado-gama. As estruturas vasculares tubulares restaurado pode ser subsequentemente re-semeadas com células endoteliais microvasculares humanas, utilizando um bioreactor de perfusão de recirculação 7, que imita os parâmetros biomecânicos e / ou bioquímicos, tais como pH, temperatura, pressão, o fornecimento de nutrientes e de remoção de desperdícios 6. A re-endotelização de estruturas tubulares cria um vaso sanguíneo equivalente humano no andaime 3,7 colagenosa. No passo seguinte, a superfície dos antigos lúmen (mucosa) podem ser semeadas com células humanas primárias para estabelecer co-culturas 3,7,8. Neste estudo um sistema de teste tumor 3D é criado pelo co-cultura de uma linha de células tumorais com rua principalcélulas romal em condições estáticas e dinâmicas sobre o SIS-Muc.

<table><tbody><tr><td>Solução de colagenase</td><td>SERVA</td><td>17454</td> <td>(500 U / ml)</td></tr> <tr><td>Solução de dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td> <td>(2,0 U / ml)</td></tr> <tr><td>DMEM, PAA com alto teor de glicose</td><td></td><td>G0001,3010</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>ROCHE</td><td>10104159001</td><td>200 mg dissolvido em 500 ml PBS+ + solução PenStrep DZ a 1%</td></tr><tr><td></td><td>Roth</td><td>3484.2</td><td>34 g de sódio Desoxiquelato, em 1 L Água ultra-pura</td></tr><tr><td>FCS</td><td>LONZA</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td><td>DCS</td><td>PD000KIT</td><td></td></tr><tr><td>transdutor de pressão médica</td><td>MEMSCAP</td><td>SP844</td><td></td></tr><tr><td>camundongo monoclonal anti-humano Von Willebrand Fator</td><td>DAKO Cytomation</td><td>M0616</td><td>Clone F8/86 0,12 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>de camundongo monoclonal anti-humano p53</td><td>DAKO Cytomation</td><td>IS616</td><td>Clone DO-7 bomba</td></tr><tr><td>peristáltica</td> pronta para uso <td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cúpula descartável estéril</td><td>MEMSCAP</td><td>844-28</td><td></td></tr><tr><td>Solução de tripsina / EDTA</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td>0,05%</td></tr><tr><td>VascuLife (VEGF-Mv)</td><td>Lifeline</td><td>LL-0003</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-033</td><td></td></tr></tbody></table>

engenharia de tecidos de um 3d humano<em&gt; in vitro</em&gt; sistema de teste de tumor

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

O câncer é uma das principais causas de morte em todo o mundo. Estratégias terapêuticos actuais são predominantemente desenvolvida em sistemas de cultura em 2D, que reflectem adequadamente as condições fisiológicas in vivo. Matrizes 3D biológicos fornecer células de um ambiente no qual as células podem auto-organizar-se, permitindo que o estudo da organização do tecido e da diferenciação celular. Tais andaimes podem ser semeado com uma mistura de diferentes tipos de células para estudo de interações célula-célula 3D diretos. Para imitar a complexidade 3D ​​de tumores cancerosos, o nosso grupo desenvolveu um sistema de teste in vitro tumor 3D. Nossos modelos 3D sistema de teste do tecido a situação in vivo de tumores malignos da bainha dos nervos periféricos (MPNSTs), que estabeleceu com a nossa descelulada segmento jejunal porcino andaime vascularizado biológico (BioVaSc). No nosso modelo, reseeded uma matriz BioVaSc modificado com fibroblastos primários, células endoteliais microvasculares (mvECs) e a linha de células de tumor S462. Para a cultura estática, a estrutura vascular do BioVaSc é removido e o andaime remanescente é cortada de um lado aberto (Submucosa do Intestino Delgado SIS-MUC). A matriz resultante é então fixado entre dois anéis metálicos (coroas de células). Outra opção é a cultura da célula-semeado SIS-Muc num sistema de bioreactor de fluxo que expõe as células ao cisalhamento. Aqui, o bioreactor está ligada a uma bomba peristáltica num incubador de auto-construída. Um computador regula o oxigênio e nutrientes através de parâmetros como a pressão arterial, temperatura e vazão. Esta configuração permite uma cultura dinâmica, com ou pulsátil regulado por pressão ou fluxo constante. Neste estudo, foi possível estabelecer com sucesso tanto um sistema de cultura 3D estática e dinâmica para MPNSTs. A capacidade de modelar os tumores de câncer em um ambiente 3D mais natural permitirá a descoberta, teste e validação defuturos fármacos em um modelo semelhante à humana.

Como mostrado na Figura 1B, que descelularizados o segmento de jejuno de porcino (cerca de 2 m de comprimento e 20 mm de diâmetro) com estruturas tubulares preservadas da rede capilar. Após química, enzimática e mecânica descelularização, obteve-se um andaime colagénio I / III, que pode ser utilizado para a cultura de células em 3D. Um teste de Feulgen foi realizada para demonstrar o grau de pureza (não há vestígios de ADN) da matriz (dados não mostrados). As Figuras 2A e 2B mostram a cultura estática de SIS-Muc assegurado pelas coroas de células. Fixamos o SIS-Muc em um biorreator desenvolvido em casa (Figura 2C) para a cultura dinâmica. Figura 2D ilustra o fluxo dinâmico simulado através da câmara do biorreator. O bio-reactor é colocado em uma incubadora sistema auto-construída e ligado com uma bomba peristáltica. Esta configuração permite que uma cultura dinâmica com qualquer fluxo pulsátil regulada por pressão ou c<html> fluxo onstant. A Figura 3 apresenta uma visão geral da linha S462 estaticamente cultura de células tumorais em monocultura 2D (Figura 3A) e em 3D co-cultura (Figuras 3B-3D). Figura 3B mostra a cultura triplo de células tumorais S462 e fibroblastos primários no lado apical do SIS -MUC (ex-lateral lúmen interno) e MVEC no lado basolateral (lado serosa anterior). A identificação dos diferentes tipos de células é possível através da coloração de marcadores específicos do tipo de células, tais como o factor de von Willebrand para rotular MVEC (Figura 3C). As células S462 positivos de p53 podem ser distinguidas a partir dos fibroblastos primários da p53 negativa (Figura 3D) e a distribuição 3D de células podem ser analisadas. Figura 4 mostra colorações equivalente à figura 3 da cultura triplo dinamicamente cultivadas. <html> 0460/50460fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Decelularização set-up. (A) biorreator e bomba set-up para a descelularizante BioVaSc, monitorado por um PC. (B) descelularizado BioVaSc em tanque de vidro. O lúmen arterial e a entrada são ligados aos adaptadores. . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig2.jpg" /> Figura 2. Sobre a opinião dos diferentes cultura set-ups. (A) vista de seção CAD do sistema de cultura estática em microtitulação placa, (B) pastilhas de metal para a cultura estática, (C) de simulação de fluxo médio (campo de velocidade [m / s]) para a cultura dinâmica da pálpebra superior do biorreator fluxo , (D) biorreator de fluxo para cultura dinâmica ligada à bomba peristáltica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> ent &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 3" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig3highres.jpg" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig3.jpg" /> Figura 3. Visão geral da caracterização imuno do modelo estático tumor 3D. (D) mancha de Hematoxilina do estaticamente cultivadas cultura mono-2D de células S462 sobre uma lâmina permanox, (B) H &amp; E mancha do estaticamente cultivadas cultura tripla 3D, setas marcam células endoteliais, (C) A coloração por imuno para o factor de von Willebrand, (D ) coloração imuno para p53. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> <img alt="Figura 4" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig4highres.jpg" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig4.jpg" /> <strong&gt; Figura 4. Visão geral da caracterização imuno do modelo dinâmico tumor 3D. (A) H &amp; E mancha do dinamicamente culta cultura triplo 3D, setas marcar células endoteliais, (B) coloração imuno para fator de von Willebrand, (C) coloração imuno para p53. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a>

Métodos para criar tecidos tumorais 3D humanos como sistemas de teste são descritos. Estas tecnologias são baseadas num descelularizado Biológica vascularizada andaime (BioVaSc), células humanas primárias e uma linha de células tumorais, que podem ser cultivadas em condições estáticas, bem como sob condições dinâmicas de um bio-reactor de fluxo.

Engenharia de Tecidos de um 3D Humano<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de Teste de Tumor

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

O objetivo geral deste procedimento é construir um sistema de teste tridimensional de tumor com células primárias sobre um suporte biológico descelularizado. Isso é realizado primeiramente preparando o suporte por meio de um processo de descelularização, no qual um segmento al porcino é perfundido com solução descelularizante. O segundo passo consiste em isolar células humanas primárias de uma biópsia do paciente utilizando um protocolo padrão de isolamento.Em seguida, monte o sistema de teste tumoral abrindo longitudinalmente o submucosa tubular do intestino delgado, fixando-o entre dois anéis metálicos e semeando células tumorais e células estromais associadas em densidades celulares definidas. O passo final consiste em cultivar o conjunto carregado com células em uma configuração adequada sob condições estáticas ou dinâmicas. Por fim, utiliza-se microscopia imunohistoquímica para avaliar as características do crescimento tumoral.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como os sistemas de teste de tumor TT, é que com este método é possível criar modelos de tecidos tridimensionais que simulam as condições in vivo de um tumor com maior precisão do que os modelos bidimensionais comuns. A vantagem do cultivo dinâmico é que as características específicas das células são mantidas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia tumoral, como a forma pela qual as células cancerígenas formam interações célula-célula e célula-matriz em um ambiente tridimensional, o que contribuirá para elucidar processos relacionados ao câncer, como a progressão tumoral e a metástase.O suporte biológico vascularizado ou biova utilizado neste sistema de teste de tumor é derivado de um segmento jejunal de suíno. Lave o sistema vascular do segmento intestinal de suíno e a luz intestinal com PBS por meio de acesso arterial cânulado. Repita até que fique completamente limpo.Prepare um tanque de vidro com diâmetro de 200 milímetros com quatro adaptadores e conecte-os a uma bomba peristáltica por meio de tubos de silicone. A unidade de controle de pressão pode ser monitorada por meio de um sensor de pressão conectado a uma cúpula descartável estéril. Encha as garrafas reservatório com solução de descelularização ou solução DZ.Verifique o sistema de tubos quanto a possíveis bolhas de ar. Conecte a luz intestinal com braçadeiras plásticas aos conectores de vidro para o fluxo luminar. Borbulhe 500 mililitros de solução DZ na entrada arterial vermelha do sistema vascular.Interrompa brevemente o processo de bombeamento a cada 15 minutos para pressionar manualmente todo o lúmen intestinal. É importante monitorar a pressão da solução tampão durante o processo de descelularização. A pressão deve estar entre 80 e 100 milímetros de mercúrio, conforme a pressão sanguínea natural.Lave o biova com PBS até que esteja livre de restos celulares e a estrutura vascular esteja completamente branca. Inicie este procedimento cortando a biópsia de pele em tiras de dois a três milímetros de largura com uma lâmina de bisturi e enxaguando-as três vezes com solução de PBS. Após a incubação do tecido com a solução de disbe, use duas pinças para separar a epiderme da derme.Transfira ambos separadamente para placas de Petri contendo PBS para isolar células endoteliais microvasculares dérmicas primárias ou MV eecs. Enxague as tiras de derme uma vez com enzima, adicione 10 mililitros de solução de tripsina-EDTA às tiras de derme e incube a 37 graus Celsius por 40 minutos. Interrompa a reação enzimática com 1% de FCS e transfira as tiras de pele para uma placa de Petri contendo meio vascu life. Risque cada tira oito vezes com o bisturi em cada lado, exercendo uma leve pressão para produzir uma suspensão celular.Em seguida, centrifugue a suspensão celular e ressuspenda o pellet celular com vascu life. Para isolar fibroblastos, primeiro use um bisturi para cortar as tiras de derme em pedaços pequenos.Transfira os fragmentos de derme para um tubo Falcon e adicione 10 mililitros de solução de colagenase incubada a 37 graus Celsius por 45 minutos. Em seguida, centrifugue a solução e remova cuidadosamente o sobrenadante. Lave o pellet com DMEM mais 10%FCS mais 1%pen strep.Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante, ressuspenda o pellet no meio de cultura e transfira para um frasco de cultura T 75 para permitir que as células migrem para fora do tecido; incube em condições estáticas. Para montar o sistema de teste tumoral, primeiro corte a submucosa intestinal delgada tubular ou SIS muc, abra-a em um dos lados e fixe-a entre dois anéis metálicos. Essas coroas celulares autoconstruídas têm um diâmetro de 10 milímetros.Cubra o SIS mu com meio de cultura celular durante a noite no dia seguinte, semeie as MVE CS primárias sobre a superfície basal do SIS, o primeiro CI. Incube a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por três horas. Três horas depois, complete o poço com meio para garantir uma cultura submersa e retorne-o ao incubador. Deixe as células endoteliais aderirem por três dias após três dias.Gire o sistema de cultura estática em 180 graus e transfira-o para uma placa de 12 poços. Em seguida, observe uma mistura de fibroblastos dérmicos primários e células tumorais na superfície apical do SIS. O lado do antigo lúmen.Deixe as células aderirem por três horas. Complete o poço com meio para submergir o cultivo, o sistema de teste de tumor sob condições estáticas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por mais 14 dias, trocando o meio de cultivo a cada dois ou três dias para o cultivo dinâmico. Fixe a SIS mu entre dois anéis metálicos e semeie MV eecs primárias conforme demonstrado anteriormente.Após três dias, remova o SIS mu dos anéis metálicos e insira a membrana no reator de fluxo com uma seringa e uma cânula. Aplique os fibroblastos dérmicos primários e as células tumorais sobre a matriz no biorreator. Deixe as células aderirem por três horas antes de preencher o sistema do biorreator com meio de cultura no dia seguinte, coloque o biorreator em um sistema de incubadora autoconstruído e conecte-o a uma bomba peristáltica.Essa configuração permite o cultivo dinâmico com fluxo pulsátil regulado por pressão ou fluxo constante. Neste experimento, utiliza-se um fluxo constante de meio de 3,8 mililitros por minuto. Mantenha o cultivo dinâmico por 14 dias, trocando o meio de cultivo após sete dias.Após a conclusão dos experimentos, os tecidos são fixados, emblocados em parafina e corados, e então analisados usando um microscópio invertido. Resultados representativos são mostrados aqui. O painel A apresenta uma visão geral da linhagem celular tumoral S 4 62 cultivada de forma estática em monocultura 2D, corada com hematoxilina.O co-cultivo tridimensional é mostrado nos painéis B, C e D. Esta imagem corada com hematoxilina e eosina mostra o cultivo triplo de células tumorais S462 e fibroblastos primários no lado apical do SIS-MU e das MVEC. No lado basal lateral, as setas indicam as células endoteliais. Diferentes tipos celulares podem ser identificados pela marcação de marcadores específicos de tipo celular, como o fator de von Willebrand para identificar as MVEC mostradas no painel C e P53 mostrado no painel D. As células S462 positivas para P53 podem ser distinguidas dos fibroblastos primários negativos para P53, e a distribuição tridimensional das células pode ser analisada da mesma forma.Podem-se identificar diferentes tipos celulares no painel de cultura tripla com cultivo dinâmico. O painel A é uma imagem corada com hematoxilina e eosina, na qual as setas indicam as células endoteliais. O painel B mostra a coloração imunohistoquímica para o fator de von Willebrand, e o painel C mostra a coloração para P53 após este procedimento. Outros métodos, como testes com fármacos, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a busca por novas terapias contra o câncer ou a análise de vias de sinalização importantes na tumorigênese.Além disso, células primárias podem ser usadas para definir o melhor tratamento personalizado para pacientes individuais.

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