Engenharia de Tecidos de um 3D Humano In vitro Sistema de Teste de Tumor

O objetivo geral deste procedimento é construir um sistema de teste de tumor 3D com células primárias em um andaime biológico descelularizado. Isso é feito preparando primeiro o andaime usando um processo de descelularização no qual um segmento de suíno é bombeado com solução de descelularização. O segundo passo é isolar células humanas primárias da biópsia de um paciente usando um protocolo de isolamento padrão.

Em seguida, configure o sistema de teste do tumor cortando a submucosa tubular do intestino delgado aberta de um lado, fixando-a entre dois anéis de metal e semeando com células tumorais e células estromais associadas em densidades celulares definidas. A etapa final é cultivar a construção carregada por célula em uma configuração adequada sob condições estáticas ou dinâmicas. Em última análise, a microscopia imuno-histoquímica é usada para avaliar as características do crescimento do tumor.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como os sistemas de teste de tumor TT, é que, com esse método, é possível criar modelos de tecido 3D que simulam as condições in vivo de um tumor com mais precisão do que os modelos 2D comuns. A vantagem da cultura dinâmica é que as características específicas da célula são mantidas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia tumoral, como a forma como as células cancerígenas formam interações celulares e matriciais celulares em um ambiente 3D, o que ajudará a elucidar processos relacionados ao câncer, como progressão tumoral e metástase.

O andaime vascularizado biológico ou biova usado neste sistema de teste de tumor é derivado de um segmento jaal suíno. Enxágue o sistema vascular do segmento suíno e o lúmen intestinal com PBS por meio de acesso arterial canulado. Repita até que esteja completamente limpo.

Prepare um tanque de vidro de 200 milímetros de diâmetro com quatro adaptadores e conecte-os por meio de tubos de silício à bomba peristáltica. A unidade de controle de pressão pode ser monitorada por meio de um sensor de pressão conectado a uma cúpula descartável estéril. Encha as garrafas do reservatório com solução de descelularização ou DZ.

Verifique o sistema de tubulação quanto a possíveis bolhas de ar. Conecte o lúmen intestinal com braçadeiras aos conectores de vidro para fluxo luminal. Bombeie 500 mililitros de solução DZ no acesso arterial vermelho do sistema vascular.

Interrompa o processo de bombeamento a cada 15 minutos brevemente para pressionar manualmente todo o lúmen intestinal. É importante monitorar a pressão da solução tampão durante o processo de descelularização. A pressão deve estar entre 80 a 100 milímetros de mercúrio modelados de acordo com a pressão arterial natural.

Lave o biova com PBS até que esteja livre de restos de células e a estrutura vascular seja completamente branca. Comece este procedimento cortando a biópsia de pele em tiras de dois a três milímetros de largura com um bisturi e enxaguando-as três vezes com solução de PBS. Depois de incubar o tecido com disbe solução, use duas pinças para separar a epiderme da derme.

Transfira ambos separadamente para placas de Petri preenchidas com PBS para isolar células endoteliais microvasculares dérmicas primárias ou MV eecs enxágue as tiras dérmicas Uma vez com ene, adicione 10 mililitros em solução de EDTA às tiras dérmicas e incube a 37 graus Celsius por 40 minutos. Pare a reação enzimática com 1% FCS e transfira as tiras de pele para uma placa de Petri cheia de vida vascu. Risque cada tira com o bisturi oito vezes de cada lado, adicionando um pouco de pressão para produzir uma suspensão celular.

Centrifugue então a suspensão da pilha e resus, suspenda a pelota da pilha com vida do vascu. Para isolar fibroblastos. Primeiro, use um bisturi para cortar as tiras da derme em pequenos pedaços.

Transfira as peças da derme para um tubo Falcon e adicione 10 mililitros de solução de colagenase incubada a 37 graus Celsius por 45 minutos. Em seguida, centrifugue a solução e remova cuidadosamente o sobrenadante. Lave o pellet com DMEM mais 10% FCS mais 1% de estreptococos de caneta.

Após centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante, ressuspenda o pellet em meio de cultura e transfira para um frasco de cultura T 75 para permitir que as células cresçam para fora do tecido, incubem em condições estáticas. Para configurar o sistema de teste de tumor primeiro, corte a submucosa tubular do intestino delgado ou SIS muc, abra de um lado e fixe-a entre dois anéis de metal. Essas coroas celulares autoconstruídas têm um diâmetro de 10 milímetros.

Cubra o SIS mu em meio de cultura de células durante a noite no dia seguinte, semeie MVE CS primário na superfície basal posterior do SIS, o antigo CI. Incubar a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por três horas. Três horas depois, encha o poço com meio para garantir a cultura submersa e devolva-o à incubadora. Permita que as células endoteliais adiram por três dias após três dias.

Vire o sistema de cultura estática em 180 graus e transfira-o para uma placa de 12 poços. Em seguida, veja uma mistura de fibroblastos dérmicos primários e células tumorais na superfície apical do SIS. O lado do antigo lúmen.

Deixe as células aderirem por três horas. Encha o poço com meio para submergir a cultura de cultura, o sistema de teste de tumor sob condições estáticas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por mais 14 dias, trocando o meio de cultura a cada dois ou três dias para a cultura dinâmica. Fixe o SIS mu entre dois anéis de metal e semeie eecs MV primários conforme demonstrado anteriormente.

Após três dias, remova o SIS mu dos anéis de metal e insira a membrana no reator de fluxo com uma seringa e cânula. Aplique os fibroblastos dérmicos primários e as células tumorais na matriz do biorreator. Deixe as células aderirem por três horas antes de encher o sistema de biorreator com meio de cultura no dia seguinte, coloque o biorreator em um sistema de incubadora autoconstruído e conecte-o a uma bomba peristáltica.

Essa configuração permite a cultura dinâmica com fluxo pulsátil regulado por pressão ou fluxo constante. Neste experimento, é usado um fluxo médio constante de 3,8 mililitros por minuto. Manter a cultura dinâmica por 14 dias, mudando o meio de cultura após sete dias.

Na conclusão dos experimentos, os tecidos são fixados, parafinas, embutidos e corados e, em seguida, fotografados usando um microscópio inverso. Os resultados representativos são mostrados aqui. O painel A fornece uma visão geral da linha de células tumorais S 4 62 cultivadas estaticamente em monocultura 2D corada com hemat tolin.

A co-cultura 3D é mostrada nos painéis B, C e D. Esta imagem corada com H e e mostra a cultura tripla de células tumorais S 4 62 e fibroblastos primários no lado apical do SIS MU e MVEC. No lado lateral basal, as setas marcam as células endoteliais. Diferentes tipos de células podem ser identificados pela coloração de marcadores específicos do tipo de célula, como o fator de von Willebrand para marcar MVEC mostrado no painel C e P 53 mostrado no painel D. As células P 53 positivas S 4 62 podem ser distinguidas dos fibroblastos primários P 53 negativos, e a distribuição 3D das células pode ser analisada da mesma maneira.

Diferentes tipos de células podem ser identificados no painel de cultura tripla cultivado dinamicamente A é uma imagem corada com H e E onde as setas marcam as células endoteliais. O painel B mostra coloração imuno-histológica para o fator de von Willebrand e o painel C mostra coloração para P 53 após este procedimento. Outros métodos, como testes de drogas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como encontrar novas terapias contra o câncer ou a análise de importantes vias de sinalização na tumorgênese.

Além disso, as células primárias podem ser usadas para definir o melhor tratamento personalizado para pacientes individuais.