Name: Isolamento de Células Embrionárias ventriculares endoteliais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprenda a isolar células endoteliais ventriculares embrionárias de camundongos transgênicos usando dissecação, colagenase e separação magnética com anticorpos. Este método permite estudar o desenvolvimento cardiovascular in vitro.

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Gostaríamos de agradecer a Andrea Portbury para a leitura crítica do manuscrito, o Laboratório de Serviço Microscópio de UNC para a assistência com a imagem time-lapse, eo NIH (Grant # R01HL061656) para apoio financeiro.

1. Preparar anticorpos conjugados grânulos <ol><li> Um dia antes da dissecação, combinar o anticorpo de escolha com as Dynabeads apropriadas (por exemplo IgG de rato Dynabeads para um anticorpo criado em ratos, 4 x 10 8 contas / ml), segundo as instruções do fabricante. Para o rato anti-CD31 anticorpo BD (0,5 mg / mL, utilizados para isolar as células endoteliais), 3 ul de anticorpo é adicionado a cada 25 ul de pérolas, para uma concentração final de 1,5 ug de anticorpo anti-CD31 e 1 x 10 7 esferas / 25 ul de tampão. </li><li> Incube os grânulos e de anticorpos durante a noite a 4 ° C. </li></ol> 2. Preparando o colágeno Placa <ol><li> Células isoladas formam túbulos mais rapidamente quando cultivadas num gel de colagénio, por oposição à mera uma placa revestida de colagénio. Assim, os géis de colagénio são feitas a noite antes do esvaziamento, tal como descrito no ponto 6. No gelo em uma capa de cultura de tecidos, combinar os seguintes reagentes (suficiente para 19 poços): 206,4 mL estéril H &lt;sub&gt; 2 O, 140,4 ul de colagénio tipo I (4,08 mg / mL), 38,4 mL de 10x M199, e 1,15 mL de NaOH 5 M. </li><li> Pipetar 20 ul desta gel de colagénio nas cavidades de uma placa de cultura de tecidos de 384 poços. Colocar a placa a 37 ° C incubadora de cultura de tecido durante 30 min. </li><li> Adicionar 80 ul de DMEM a cada poço e incubar durante 15 min a 37 ° C. Remover o meio de cultura e repete duas vezes mais. </li><li> Após a lavagem final, adicionar 80 ul de 10% FBS / DMEM a cada poço e incubar durante a noite a 37 ° C. Remover o meio de cultura antes da adição das células isoladas. </li></ol> 3. Impostos e digerir o Coração <ol><li> Sacrificá um rato timed-grávida no dia embrionário desejado usando uma técnica de eutanásia aprovado. Todos os experimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill. </li><li> Com o mouse em decúbito dorsal, liberalmente pulverizar o lado ventral da fêmea com etanol 70% antesdissecação. Usando fórceps para levantar a pele e músculo abdominal inferior para cima dos órgãos internos, o corte aberto da cavidade abdominal inferior da fêmea para visualização dos órgãos internos. </li><li> Segurar o colo do útero com uma pinça, cuidadosamente cortadas caudal para a pinça e comece a levantar o corno uterino a partir da cavidade abdominal. Ao levantar o corno uterino, cortar qualquer tipo de tecido conjuntivo que segura o chifre no local. Para terminar a excisão do corno uterino, corte a junção do corno uterino com o oviduto para libertar o corno uterino. </li><li> Coloque a trompa uterina de uma placa de Petri contendo a frio 1x salina tamponada com fosfato (PBS) e lavagem conforme necessário. Cortar abrir o corno uterino através da linha média para expor os sacos embrionários em anexo. </li><li> Corte de abrir um saco embrionário na junção da placenta e do embrião para evitar que acidentalmente cortar o embrião e recuperar um embrião. Coloque o embrião de uma segunda placa de Petri com o frio PBS. Retorne a placa de Petri com o corno uterino em gelo. </li><li> Decapitate o embrião para melhorar o acesso à parede torácica. Se a genotipagem é necessário, cortar a cauda para removê-lo e guardar num tubo Eppendorf colocada em gelo. </li><li> Com o embrião em suas costas, cortou a parede torácica para visualizar o coração e os pulmões. Para evitar o corte do coração, fazer um corte vertical ao longo do lado da caixa torácica, perto de um membro anterior, seguido por um corte horizontal ao longo da parte inferior das costelas e, então, puxe parede do peito para cima e para fora do caminho. Através aproximadamente dia embrionário 13,5, a parede torácica é transparente, auxiliando na visualização. </li><li> Levante cuidadosamente o coração usando uma pinça e cortar os vasos abaixo. Em seguida, corte acima dos grandes vasos para libertar o coração. Se os vasos pulmonares não são cortados, os pulmões podem ser removidos com o coração. Deste modo, remover os tecidos estranhos, como os pulmões, caso seja necessário. </li><li> Separar e descartar os vasos átrios e grandes dos ventrículos. Utilizando uma tesoura, tritura os ventrículos em pedaços pequenos (aproximadamente 1 mm 3 &lt;/ Sup&gt;) e colocar em cerca de 500 ul de colagenase (1 mg / ml em PBS estéril). Manter as amostras em gelo até que todos os ventrículos foram picados e colocado em colagenase. </li><li> Repita os passos anteriores até que os ventrículos foram excisadas a partir de todos os embriões, recolhendo cada coração em um tubo Eppendorf em separado. Se todos os embriões têm o mesmo genótipo, corações podem ser agrupados num único tubo de Eppendorf. O número de amostras processadas de uma só vez pode ser limitado com base no íman utilizado para o isolamento, a DynaMag (123-21D) aqui utilizado tem um máximo de 16 tubos de Eppendorf. </li><li> Colocar os ventrículos picados, a 37 ° C com balanço durante 45 min. A cada 15 minutos, retire cuidadosamente as amostras e pipeta cima e para baixo para dissociar mecanicamente as células. </li></ol> 4. Isolar as células endoteliais <ol><li> Passar a solução de colagenase-ventrículo através de um filtro de 70 um para remover aglomerados de células restantes. </li><li> Centrifugar as células a 400 xg durante 10 min. Descartaro sobrenadante, substitua-o por cerca de 200 mL de 10% FBS em DMEM e pipeta cima e para baixo para dissociar as células. </li><li> Repita o passo anterior uma vez. Centrifugar as células a 400 xg durante 10 minutos após o segundo 10% de FBS / DMEM lavagem. Ressuspender as células em 50 ul de 10% de FBS / DMEM. </li><li> Durante o passo final de centrifugação, preparar os grânulos. <ol><li> Colocar o tubo de Eppendorf contendo o anticorpo e os grânulos em um íman durante 1 min. </li><li> Com o tubo no lugar sobre o íman, remover o sobrenadante. Retire o tubo do ímã e adicionar cerca de 100 mL de 10% FBS / DMEM. </li><li> Coloque o tubo sobre o ímã para 1 min. Remover o sobrenadante e lavar novamente com 10% de FBS / DMEM. Repetir para um total de 3 lavagens. </li><li> Após a lavagem final, voltar a suspender as pérolas de anticorpos conjugados em 10% de FBS / DMEM (5 mL por amostra). </li></ol></li><li> Para cada amostra de células, adicionam-se 5 ul dos grânulos de anticorpos conjugados. Coloque as suspensões de células do grânulo a 4 ° C com agitação for 30 min. </li><li> Em uma câmara de fluxo laminar, colocar os tubos de Eppendorf contendo células e pérolas de anticorpos conjugados do íman por 1 min. Remover o sobrenadante, remover os tubos do ímã, e lavar com aproximadamente 100 mL de 10% FBS / DMEM. Repita por 5 lavagens. </li><li> Após a última lavagem, colocar os tubos do íman por 1 min, remover o sobrenadante, e remover os tubos do íman. Adicionar cerca de 100 ul de DMEM. </li><li> Colocar os tubos no íman durante 1 min, remover o sobrenadante, e remover os tubos do íman. Adicionar 100-200 ul de pré-aquecida de 0,25% de tripsina-EDTA. Incubar as amostras a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 5 min. </li><li> Colocar os tubos no íman durante 2 min. Transferir cuidadosamente o sobrenadante contendo as células para tubos de Eppendorf fresco. Centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. </li><li> Remover o sobrenadante. Ressuspender as células em 80-100 ul de meio de crescimento e em uma placa de 96 -, ou 384 poços prato de cultura tratados, dependendo do rendimento esperado(Cerca de 450-600 células dos ventrículos de E14.5, E16.5 embriões). Para células endoteliais, utilize meio de cultura de crescimento endotelial (definido abaixo). </li></ol>

<ol><li>Landecker, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLandecker%2C+H+%22Culturing+Life%3A+How+Cells+Became+Technologies%22">Culturing Life: How Cells Became Technologies</a>. , Presidents and Fellows of Harvard College. (2007).</li>
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<li>Chang, L., Noseda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+vascular+smooth+muscle+cells+from+local+precursors+during+embryonic+and+adult+arteriogenesis+requires+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling.</a> PNAS. 109, 5993-6998 (2012).</li>
<li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).</li>
<li>Frauli, M., Ludwig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+a+culture+of+human+endometrial+stromal+cells+using+a+medium+containing+D-valine%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Gynecology+and+Obstetrics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).</li>
<li>Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+L-valine+reduced+selective+media%5BTitle%5D)+AND+%22Research+communications+in+chemical+pathology+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media.</a> Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).</li>
<li>Arima, S., Nishiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Trabalhando com células embrionárias primárias permite novas experiências para abordar em passos críticos do desenvolvimento in vitro. No entanto, o procedimento de isolamento não é trivial. Passos críticos para o isolamento de qualquer tipo de células, nomeadamente, assegurar que as células são bem separados por digestão com colagenase e depois que eles são bem suspensa durante os passos de lavagem. Dissecção mecânica por pipetagem contribui grandemente separar as células durante a etapa de colagenase...

O advento das linhas de células imortalizadas revolucionou a biologia das células de base 1. As linhas de células actualmente disponíveis são derivados de uma vasta gama de órgãos e abrangem todos os principais tipos de células. No entanto, as linhas celulares estabelecidas têm algumas limitações. O processo de imortalizao, obviamente, alterar o comportamento das células, especialmente no que diz respeito ao tempo de vida e a proliferação, mas também pode afectar a expressão de proteínas inesperadas, tais como as proteínas do citoesqueleto 2. Além disso, apesar de muitas linhas celulares diferentes estão disponíveis, existe uma diversidade significativa mesmo entre um único tipo de células dentro de um organismo inteiro. As células endoteliais em particular mostra diversos comportamentos com base em se elas linha de artérias ou veias e que tipo de fluxo está presente no recipiente 3. Ainda mais premente de uma perspectiva do desenvolvimento, no entanto, é que a maioria das linhas celulares disponíveis são derivados de tecidos de adulto (veja, por exemplo, tele coleção disponível via ATCC). Estas linhas de células adultas provavelmente não recapitular a natureza dinâmica dos seus precursores embrionários. As rápidas mudanças espaciotemporais padrões de expressão de genes durante o desenvolvimento, também observadas sugerem que uma célula endotelial de um órgão num determinado estágio de desenvolvimento pode não se comportam da mesma maneira como uma célula endotelial, a partir desse mesmo órgão, numa fase de desenvolvimento diferente. Como uma alternativa ao uso comercialmente disponíveis linhas celulares imortalizadas, as células primárias podem ser isoladas a partir do tecido de interesse específica. Entre as vantagens desta técnica, essas células primárias podem ser isolados a partir de um órgão específico ou mesmo parte de um órgão, em qualquer fase de desenvolvimento específico. Além disso, essas células primárias podem ser isolados a partir da grande variedade de animais transgénicos disponíveis, permitindo o estudo in vitro do gene knockout e knock-in, evitando outros problemas, tais como a eficiência da transfecção. Não surpreendentemente, muitostécnicas têm sido publicados detalhando como isolar tipos específicos de células a 4,5. Em geral, estas técnicas envolvem a recolha na região de interesse, a dissociação das células, de etiquetagem do tipo de célula específico de interesse, e isolando as células para análise posterior. Para estudar uma população embrionária das células endoteliais coronárias, que foi reduzida a 4 técnica previamente publicada para o uso com um órgão menor. Com este procedimento, em escala reduzida, pode-se isolar as células endoteliais coronárias do coração embrionário em estágios embrionários específicos. Estas células podem depois ser utilizados em ensaios endoteliais tradicionais, tais como análises de migração. Até linhagens de células embrionárias precoces tornam-se mais prevalente, trabalhando com as pilhas é uma técnica inestimável.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Timed-pregnant Camundongos</td><td></td><td></td> Para <td>serem dissecados no estágio embrionário de interesse</td></tr><tr><td>Anti-camundongo CD31</td><td>BD Bioscience</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>110-35</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno</td><td>BD Bioscience</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colagenase, tipo I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Meio de crescimento de células endoteliais</td> <td>(feito em laboratório conforme descrito nas notas)</td><td></td> <td>DMEM contendo 20% de FBS, 5 &mu; M &#946;-mercapt&#8211; thanol, 50 &mu; g/ml de ECG e 1x penicilina/estreptomicina</td></tr><tr><td>&#946;-mercapt&#8211; thanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>ECGS</td><td>Biomedical Technologies, Inc.</td><td>BT-203</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de 384 poços</td><td>Greiner</td><td>T-3037-6</td><td>A placa foi preparada com um gel de colágeno fino, conforme descrito em 6; área de superfície de trabalho 10 mm2</td></tr><tr><td>Colágeno tipo I</td><td>BD</td><td>354236</td><td>Uso final concentração de 1,5 mg/ml</td></tr><tr><td>M199, 10x</td><td>Invitrogen</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Syto-16</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td>Usado conforme indicado em 13 </td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de células</td><td>Thermo</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa</td><td>Thermo</td><td>75002430</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de células embrionárias ventriculares endoteliais

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cultura de células tem melhorado muito a nossa capacidade de avaliar populações individuais de células sob condições de cultura inumeráveis. Enquanto as linhas de células imortalizadas oferecem vantagens significativas para a sua facilidade de utilização, estas linhagens de células não estão disponíveis para todos os tipos de células potenciais. Ao isolar as células primárias a partir de uma região específica de interesse, particularmente a partir de um ratinho transgénico, os estudos mais matizadas podem ser executadas. A técnica básica envolve a dissecção do órgão ou órgãos parcial de interesse (por exemplo, do coração ou de uma região específica do coração) e dissociação do órgão para células individuais. Estas células são então incubadas com contas magnéticas conjugadas com um anticorpo que reconhece o tipo celular de interesse. As células de interesse pode então ser isolado, com a utilização de um íman, com uma curta incubação de tripsina dissociar as células dos grânulos. Estas células isoladas podem ser cultivadas e, em seguida, analisado como desejado. Esta técnica foi originalmente concebido para órgão do rato adultos, mas podem ser facilmente reduzidos para uso com os órgãos embrionários, como aqui demonstrado. Porque o nosso interesse é na vasculatura coronária em desenvolvimento, que queria estudar esta população de células em fases embrionárias específicas. Assim, o protocolo original teve de ser modificado para ser compatível com a pequena dimensão dos ventrículos embrionárias e o baixo rendimento potencial das células endoteliais para estas fases de desenvolvimento. Utilizando essa abordagem em escala reduzida, avaliamos coronária remodelação plexo nas células endoteliais ventriculares embrionárias transgênicos.

Usando um anticorpo específico para o endotélio, que reconhece CD31, as células endoteliais foram isolados a partir dos ventrículos embrionárias (E), 13,5 (Figura 1A) e 18.5 (Figuras 1B-1D) embriões. Quando cultivado em um prato de cultura não tratada, essas células permanecem arredondado e que formam um padrão de paralelepípedos se perto confluente (Figura 1A). Diluir colagénio também foi utilizado para revestir os poços, e as células endoteliais, enquanto vai aderir a...

Cultura celular primária é uma técnica útil para a análise de populações específicas de células, principalmente a partir de embriões de camundongos transgênicos em estágios de desenvolvimento específicos. Nisto, os ventrículos embrionárias são dissecados e dissociados, e os grânulos de anticorpos conjugados reconhecer e separar as células endoteliais para análise posterior.

Isolamento de Células Embrionárias ventriculares endoteliais

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar células endoteliais ventriculares embrionárias. Isso é realizado primeiramente recuperando um embrião para dissecação. Em seguida, o coração é excisado.Os átrios são removidos e os ventrículos picados são transferidos para uma solução de colágeno. A seguir, a suspensão de células isoladas é incubada com um anticorpo que reconhece as células endoteliais. Por fim, um ímã é utilizado para isolar as células endoteliais ligadas ao anticorpo.No final, podem ser obtidos resultados que mostrem a formação de cadeias endoteliais por meio de microscopia de campo claro. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de desenvolvimento cardiovascular, como quais fatores promovem a migração endotelial coronariana. Embora este método possa fornecer informações sobre o comportamento das células endoteliais, ele também pode ser aplicado a outros tipos celulares, como miócitos e fibroblastos. No dia anterior à realização da dissecação, trabalhando em uma câmara de fluxo laminar, combine o anticorpo de escolha com as esferas magnéticas Dyna apropriadas, seguindo as instruções do fabricante para o anticorpo anti-rato CD 31 utilizado aqui.Três microlitros de anticorpo são adicionados a 25 microlitros de esferas para uma concentração final de 1,5 microgramas em 10 elevado a sete esferas. Incube as esferas com anticorpo durante a noite a quatro graus Celsius para preparar géis de colágeno para a rápida formação de túbulos por células isoladas em uma câmara de cultura tecidual sobre gelo. Combine colágeno tipo I, água estéril, 10 X M-199 e hidróxido de sódio 5 molar. De acordo com o protocolo descrito, pipete 20 microlitros do gel de colágeno nos poços de uma placa de cultura tecidual de 384 poços.Coloque a placa em uma estufa de cultura tecidual a 37 graus Celsius por 30 minutos. Adicione 80 microlitros de DMM a cada poço e incube por 15 minutos a 37 graus Celsius. Remova o meio de cultura e repita a lavagem mais duas vezes; após a lavagem final, adicione 80 microlitros de DM com 10% FBS a cada poço e incube durante a noite a 37 graus Celsius.Após eutanasiar um camundongo prenhe no dia embrionário desejado, utilizando uma técnica aprovada e removendo o corno uterino de acordo com o protocolo descrito, coloque-o em uma placa de Petri com uma XPBS e enxágue-o. Após expor os sacos embrionários por meio de uma incisão mediana na junção entre a placenta e o embrião, abra um saco embrionário e recupere o embrião.Coloque o embrião em uma segunda placa de Petri com PBS frio e retorne o corno uterino ao gelo para facilitar o acesso à parede torácica e decapitar o embrião. E, se for realizar genotipagem, corte a cauda e guarde-a em um tubo sobre gelo. Com o embrião de costas, faça um corte.Abra a parede torácica para visualizar o coração e os pulmões, evitando cortar o coração. Faça um corte vertical ao longo do lado da caixa torácica próximo a um membro anterior, seguido por um corte horizontal na parte inferior das costelas. Em seguida, puxe suavemente a parede torácica para cima e para fora do caminho até aproximadamente o dia embrionário 13,5.A parede torácica é transparente, facilitando a visualização. Com o auxílio de pinça, levante cuidadosamente o coração e corte os vasos abaixo. Se desejado, transfira o coração para um recipiente limpo para separá-lo dos pulmões e corte acima dos grandes vasos.Em seguida, separe e descarte as aurículas e os grandes vasos dos ventrículos. Depois, usando tesoura, pique os ventrículos em pequenos pedaços e coloque-os em aproximadamente 500 microlitros de colagenase sobre gelo. Remova cirurgicamente e processe os ventrículos dos embriões restantes, coletando cada coração em um tubo separado.Coloque os ventrículos picados a 37 graus Celsius com agitação durante 45 minutos. A cada 15 minutos, remova cuidadosamente as amostras e pipete para cima e para baixo para dissociar mecanicamente as células. Após a incubação, passe a solução de colagenase dos ventrículos através de um filtro de 70 micrômetros para remover os agregados celulares remanescentes, centrifugue as células a 400 G por 10 minutos, descarte o sobrenadante e substitua por aproximadamente 200 microlitros de DMEM com 10% de FBS, pipete para cima e para baixo para ressuspender as células, centrifugue novamente as células e, após uma segunda lavagem e centrifugação, ressuspender as células em 50 microlitros de DMEM com 10% de FBS.Em seguida, prepare as microesferas colocando primeiro o tubo com o anticorpo e as microesferas em um ímã durante um minuto e removendo o sobrenadante por aspiração. Em seguida, retire o tubo do ímã e adicione aproximadamente 100 microlitros de FBS a 10% em dmm. Retorne o tubo ao ímã por um minuto e, então, remova o sobrenadante.Repita a lavagem um total de três vezes após a lavagem final. Re-suspenda as microesferas conjugadas com anticorpo em DMM contendo 10% de FBS para cada amostra celular e adicione cinco microlitros das microesferas conjugadas com anticorpo. Incube as suspensões de células com microesferas a quatro graus Celsius com agitação durante 30 minutos em uma cabine de fluxo laminar, coloque as amostras no ímã por um minuto e remova o sobrenadante por aspiração.Remova os tubos do ímã e lave com aproximadamente 100 microlitros de FPS 10% e dm. Repita por um total de cinco lavagens após a lavagem final. Suspenda as esferas em aproximadamente 100 microlitros de DMEM.Coloque os tubos no ímã por um minuto. Remova o meio, então adicione de 100 a 200 microlitros de tripsina pré-aquecida a 0,25% em EDTA, incube as amostras a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco minutos. Coloque os tubos no ímã por dois minutos.Em seguida, transfira cuidadosamente a suspensão celular contendo o sobrenadante para tubos novos e centrifugue por cinco minutos a 400 G. Por fim, após a remoção do sobrenadante, reconstitua os pelétos em 80 a 100 microlitros de meio de crescimento endotelial e plaque em uma placa de cultura com 96 ou 384 poços, conforme o rendimento esperado. Cada par de ventrículos provenientes de embriões entre E 14,5 e E 16,5 fornece tipicamente de 450 a 600 células, conforme demonstrado aqui utilizando um anticorpo específico para células endoteliais que reconhece CD 31. Células endoteliais foram isoladas dos ventrículos de embriões do dia E 13,5.Quando cultivadas em uma placa de cultura não tratada, essas células permanecem arredondadas e formam um padrão semelhante a calçadas quando próximas à confluência. Embora as células adiram a placas revestidas com colágeno diluído, essas células isoladas dos ventrículos de E 18,5 formam menos cadeias do que quando cultivadas em gel de colágeno. Além disso, as células formam interações célula-célula mais rapidamente e formam cadeias, ramificando-se no gel de colágeno em comparação com a placa revestida com colágeno, o que serve como verificação de sua identidade.As células nesta figura marcam positivamente com o marcador endotelial ISO selecina. Além disso, como mostrado aqui, células endoteliais isoladas dos ventrículos de embriões E 18,5 marcaram positivamente com os marcadores endoteliais PAM e flick one. Esta figura mostra células endoteliais isoladas dos ventrículos de um embrião E 14,5 e marcadas com o corante específico para células endoteliais, cyto.16 células isoladas sobrevivem até uma cultura enfraquecida, mas são resistentes à imortalização e, portanto, mais adequadas para experimentos terminais. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente três horas e meia, se executada corretamente. Após este procedimento, outros ensaios, como ensaios de formação de tubos e ensaios de migração em transwell, podem ser realizados para determinar como essas células isoladas se comportam in vitro.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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