Name: Construção de Matrizes Microdrive para gravações Neurais crônica na Awake Mice comportam (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprenda a construir microdrives leves para gravações eletrofisiológicas crônicas em camundongos acordados e em movimento. Este método permite registrar atividade neural de populações e neurônios individuais com alta qualidade de sinal.

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Agradecemos a Daniel Carpi por sua ajuda e início contribuições para este projeto. Agradecemos também Lucrecia Novoa por sua assistência com obras de arte e imagens. Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIAID programa de concessão 5P01AI073693-03.

1. Tetrode Fabrication <ol><li> Comece usando isolados 12,5 um (0,0005 &quot;) de diâmetro do núcleo de fio de platina-irídio da Califórnia fio fino. O comprimento do fio deve ser cortado a um comprimento adequado para a estrutura de alvo. Por exemplo, para cortar o fio, pelo menos, 30 cm de comprimento para direcionar o subiculum dorsal ou hipocampo. </li><li> Dobrar o fio sobre o centro de modo que existem dois fios paralelos, que será de 15 cm de comprimento. Drapejá o ponto médio deste fio ao longo de um braço horizontal para formar quatro fios paralelos de 7,5 cm de comprimento. Ainda fixar o clipe revestida de borracha perto da parte inferior do arame drapeado, a criação de um feixe de quatro fios. </li><li> Coloque o clipe de borracha no motorizado Tetrode Spinner, certificando-se de que o fio é tenso, mas o peso não é muito tenso ou rolamento como ele vai quebrar durante o processo de fiação. </li><li> Desligue o Spinner Tetrode para o modo &quot;Manual&quot; e empurrar o joystick para &quot;Right&quot; para girar o fio no sentido horário. O spinnerrodará em cerca de 2 Hz, criando um feixe apertado de quatro fios para formar o tetrodo. </li><li> Aplicar 80 rotações no sentido horário, em seguida, parar, empurrando &quot;Up&quot; no joystick. Isso irá pausar o spinner motorizado. Em seguida, aplique 20 anti-horário rotações (&quot;esquerda&quot;), a fim de liberar a tensão no tetrodo. O número final de rotações por unidade de comprimento do fio deve ser de 8 rotações por micron. </li><li> Utilizar a arma de aquecimento na configuração inferior 1, que atinge um máximo de 400 graus, de modo a fundir os fios juntos por fusão do revestimento adesivo VG. Segure a pistola de calor ~ 2 cm do fio e executar a arma para cima e para baixo do comprimento em linha reta do fio por cerca de 5 segundos a partir de vários ângulos diferentes. Certifique-se de varrer constantemente a pistola de calor e não segurá-la um único local, pois isso vai derreter o isolamento HML e fazer com que os fios a se fundir dentro do pacote. </li><li> Fazer um corte na parte superior do tetrodo (perto do braço horizontal) e em seguida soltar a tetrodo do clipe na parte inferior. Cortar o circuito único, de modo que há quatro fios separados sobre uma extremidade do tetrodo, estes fios será electricamente ligado aos pinos de ouro ou de uma placa de circuito num passo posterior. </li><li> Coloque o tetrodo concluída em uma caixa de retenção de poeira livre para armazenamento até que a unidade tenha sido concluída. </li></ol> 2. Personalizado Assembléia Microdrive <ol><li> Primeiro construir a base que irá realizar o Microdrive (s). A base do microdrive implantado é geralmente mais estável se ele estiver protegido e posicionados ao longo da linha média do crânio. Este protocolo descreve os passos para a construção de uma base com um único microdrive para manter quatro operadoras de tubos de poliamida. Microdrives e tubos adicionais podem facilmente ser adicionados, conforme necessário. </li><li> Comece com um pedaço de 20 milímetros aproximadamente quadrada de Plexiglas acrílico (5 mm de espessura) e areia do acrílico em uma forma que permita que o rato se mover livremente com o accionamento depois de ser implantado na cabeça. </li><li> Em seguida, montar a unidade de acionamento. Use personalizado 30,3 x 6,3 milímetros guias de bronze que vai levar o parafuso da unidade. Em primeiro lugar, dois guias de solda latão juntamente perpendicularmente. O guia de bronze vertical, irá realizar o parafuso da unidade e eletrodos, enquanto que a parte horizontal será colado na base de acrílico. </li><li> Depois de soldar peças do bronze juntos, iniciar a montagem da própria unidade por meio de um parafuso de bronze de cabeça oval através da parte superior da guia e em um bloco de plástico Delrin. O bloco quadrado é concebido de modo que o orifício de rosca é um pouco fora do centro (de 0,2 mm), resultando numa face do bloco salientes muito ligeiramente a partir da guia. Este é o lado onde os tubos de poliamida que transportam os eléctrodos irão sentar. </li><li> Com o bloco de Delrin no interior do guia, e o parafuso durante todo o tempo, um fio de latão porca sextavada até que a porca é quase tocar o fundo da guia. Não aperte a porca totalmente, em vez disso derreta uma pequena quantidade de solda para o final, a fim de juntar-se a porca eo parafuso, mas tomando cuidado para não soldar anything para o guia. Agora, girando o parafuso deve mover o bloco até Delrin (sentido horário) e para baixo (sentido anti-horário) verticalmente ao longo da rosca. Cortar fio que se projeta além da porca soldada. </li><li> Uma vez que a unidade foi montada, volte para a base de acrílico e cortar uma abertura ampla três milímetros, onde a unidade de eletrodo será. Passe o guia de bronze horizontal através da ranhura e, em seguida, usar cola cryanoacrylate para proteger a peça para a base. </li><li> Coloque a base de acrílico em um torno para fixá-lo no lugar. Coloque uma placa de interface eletrônica (BEI) em cima da base e marcar as posições dos dois furos. EIBs são microchips que proporcionam uma ligação de sinal entre os fios e um eléctrodo headstage pré-amplificador. Usando um pouco de 1,5 mm ponta broca, perfurar buracos cuidadosamente as marcas para os parafusos que prendem o BEI no lugar em cima da base. Coloque o BEI e linha dois parafusos de latão para os buracos. </li><li> Use tesoura micro dissecação de cortar quatro sete peças longas milímetros de polyamtubulação ide. Linha as quatro tubos próximos uns dos outros sobre um pedaço de fita adesiva dobrada laboratório. Aplicar cianoacrilato para o centro para uni-los, mas tome cuidado para não ficar cola dentro dos próprios tubos. Permitir que os tubos unidos para secar totalmente. </li><li> Girar a base da unidade de 90 graus de modo que o chip BEI é vertical e a unidade está posicionado horizontalmente com o bloco de Delrin saliente virada para cima. Através de um microscópio de dissecação e cuidadosamente dab uma pequena quantidade de cianoacrilato sobre a face Delrin então coloque os quatro tubos unidos por cola. Permitir que a cola para definir completamente antes de tentar mover o carro. </li><li> Teste que os tubos de poliamida estão bem presos e que toda a assembléia se move suavemente sem tocar no guia ou encontrar qualquer resistência. </li><li> Em seguida, preparar o parafuso de aterramento e conecte o fio terra ao BEI. Faça um terminal de aterramento, tendo um parafuso de bronze (3/32 &quot;) e lixar para baixo os fios até que apenas 1-2 tópicos permanecem. Este deve ser ~1 mm este parafuso vai ficar dentro do crânio, e não se destina a penetrar o tecido cerebral. </li><li> Corte um comprimento de 30 mm de fio de cobre (o comprimento exacto vai depender de onde no crânio para colocar o solo de origem animal). O fio de cobre deve ser 100-500 uM (0,004-0,02 &quot;) de diâmetro, isto é aproximadamente equivalente a 38 AWG atravesse 24 AWG Aplicar fluxo de solda em ambas as extremidades do fio de cobre em uma extremidade, o parafuso de massa de solda para.. o fio. Na outra extremidade, solda um alfinete de ouro do BEI. Este fio terra pode ser posta de lado e conectado ao BEI, mais tarde, durante a cirurgia de implantação. </li><li> O próximo passo é o de orientar os eléctrodos através dos tubos de poliamida e de ligá-los nos furos do canal sobre o chip BEI. Gire o parafuso de carro totalmente para a direita de modo que os tubos estão em sua posição superior. </li><li> Para eléctrodos individuais, cortar um milímetro de comprimento do fio Stableohm 50 fiM 50 e guiá-lo através de um tubo de poliamida, permitindo que ela se estenda, pelo menos, 2,0 milímetros para além da extremidade do tubo (para o alvo ou subículohipocampo). Aplicar uma pequena gota de cianoacrilato no topo do tubo, o fio de fixação do tubo e impedir qualquer movimento do fio. Em seguida, conecte a ponta solta do fio para um buraco canal BEI com um alfinete de ouro. Apare qualquer excesso de fio com uma tesoura fina. Repita o procedimento para outros microeletrodos. </li><li> Para conectar tetrodes, ter concluído um tetrodo fora da caixa de armazenamento. Orientar o final fundida do tetrodo através de um tubo de poliamida e permitir que ela se estenda pelo menos 2,0 mm depois da extremidade do tubo (para subiculum ou hipocampo). Aplicar uma pequena gota de cianoacrilato no topo do tubo, a aposição de tetrodo para o tubo e evitar qualquer tipo de movimento. Aqui os quatro fios soltos na outra extremidade do tetrodo e ligar cada arame para um orifício de canal BEI utilizando um pino de ouro. Apare qualquer excesso de fio. Repita o procedimento para as outras tetrodes. </li></ol> 3. VersaDrive Assembléia <ol><li> Começar a construir um quatro VersaDrive tetrodo, o que consiste em uma base, gabinete e tampa pieces. </li><li> Corte de um tubo de poliamida a 10 mm e guiá-lo através do pequeno furo num transportador tetrodo. Permitir que o tubo para se estender para além do transportador muito ligeiramente (0.5 mm). Use 5 min epoxy para colar o tubo de poliamida no lugar, tomando cuidado para não permitir que o epóxi para ir para o próprio tubo. Repita isso por três outros tubos e operadoras. </li><li> Depois do epóxi foi totalmente definida, orientar cada um dos tubos de poliamida por meio de um dos quatro orifícios na base VersaDrive. Uma vez que todos os quatro tubos são através de seus buracos, empurre um pino de inseto através do orifício externo, o que irá manter o suporte tetrodo na fila e servir como um trilho para a transportadora para viajar. Repita este procedimento para as outras três operadoras. </li><li> Dê uma tampa e alinhá-lo com os quatro pinos de insetos para que a tampa cobre a base e os portadores tetrode residir no cap. Rosca de 1 mm de parafuso da máquina x 5 mm através do orifício adequado no tampão e no transportador tetrodo. Este será o parafuso da unidade para mover o suporte para cima e para baixo. Repcomer isso para os outros três parafusos. </li><li> Coloque todos os parafusos no sentido horário até portadores tetrode estão em sua posição superior e os tubos de poliamida são visíveis através da abertura da tampa. Usando finas micro tesouras de dissecação, cortados do tubo imediatamente abaixo (1 mm) da base, de modo que todos os quatro tubos de poliamida são do mesmo comprimento. </li><li> Usando um microscópio de dissecação, enfiar um tetrodo cuidadosamente através de um tubo de poliamida. É importante para manter o fio tetrodo perfeitamente reto à medida que avança através do tubo como quaisquer torções ou curvas irá torná-lo muito difícil enfiar totalmente o tetrodo passar. Repita por três outros tetrodes. </li><li> Uma vez que todas as tetrodes encontram nos seus tubos, aplicam-se cuidadosamente uma pequena gota de cianoacrilato para o topo de cada tubo, fixando os tetrodes dentro dos seus respectivos tubos. Tome cuidado para não deixar nenhuma cianoacrilato entre os transportadores ou nos fios soltos tetrode que são salientes através da tampa. </li><li> Cortar os tetrodes de modo que só se estender para além dos tubos2,0 milímetros (por subículo ou hipocampo). Em seguida, coloque a base da unidade (com os quatro pinos de insetos inserido) no gabarito VersaDrive. A outra metade do gabarito irá segurar a tampa VersaDrive que tem todos os orifícios de receptáculo para fazer as ligações de canais. </li><li> Gire o parafuso da unidade completamente anti-horário para que os tetrodes estão em sua posição mais baixa. </li><li> Antes de conectar os fios tetrode para os recipientes de ouro, primeiro conectar os fios de aterramento para a tampa. A tampa VersaDrive tem dois furos para as ligações à terra na posição do centro das duas fileiras de furos. Corte de um fio de cobre de pelo menos 30 mm (depende de onde no crânio para colocar o solo) e guiá-lo através de um destes orifícios centrais. O fio de cobre deve ser 100-500 mM (0,004-0,02 &quot;) de diâmetro, este é mais ou menos equivalente a 38 AWG 24 AWG através Empurre um receptáculo de ouro através do buraco para pegar o fio de cobre no lugar e cortar qualquer excesso de fio.. Na outra extremidade do fio de cobre, aplicar fluxo e solder este fim fio a um terminal de aterramento (ver 2.11.). Repita o procedimento para o segundo fio terra. </li><li> Em seguida, orientar todos os fios soltos tetrode (deve haver dezesseis no total) por meio de seus respectivos buracos receptáculo na tampa. É melhor começar com uma tetrodo e enfie os fios individuais para os quatro orifícios adequados que vai acabar diretamente acima dele. Os fios tetrode individuais devem ser tratados com uma leve pressão como eles são frágeis e podem cravar facilmente se segurou com muita força. Instale a tampa, alinhando os orifícios de pinos de insetos e pressione apropriado para a base. </li><li> Com os fios tetrode salientes através da tampa, pressione encaixar os recipientes de ouro para capturar os fios tetrode no lugar e fazer as conexões elétricas. Cerca de 50% dos fios será cortada (acima da tampa) uma vez que o recipiente de ouro é empurrado para baixo. Apare qualquer excesso de fio que fica saliente a partir da parte superior da tampa. Em casos raros (menos de 5%), empurrando o receptáculo de ouro para baixo vai esmagar o fioe dividi-lo abaixo receptáculo, resultando num canal desligado. Esta desconexão não pode ser realizado até que o teste de impedância e galvanoplastia passos (ver 4.7). </li><li> Repita o processo press-fitting para os três outros tetrodes. Gire os parafusos da unidade de sentido horário para movê-los de volta ao topo e garantir que o movimento de carro é bom. </li></ol> 4. Gold-plating de dicas Eletrodo <ol><li> Independentemente de qual tipo de microeletrodos sendo usados, as pontas dos eletrodos deve ser banhado a ouro, a fim de reduzir a impedância da ponta. Isto irá maximizar a capacidade de gravar de forma confiável e discriminar potenciais de ação single-unit. Teste a impedância do eletrodo usando o dispositivo nanoZ Neuralynx. O nanoZ é um dispositivo baseado em computador que permite que as medidas de impedância e de galvanoplastia automatizado. </li><li> Primeiro rode os parafusos microdrive para baixo (sentido anti-horário) para a sua posição mais baixa. Em seguida, uma fixação segura microdrive num grampo que permita reduzir deas pontas de eletrodos na solução chapeamento de ouro. </li><li> Encher uma torre com uma solução de ouro Delrin SIFCO ea outra torre com água destilada. Abaixe as pontas de eletrodos na solução de ouro. </li><li> Conecte o cabo USB nanoZ em um computador baseado no Windows e, em seguida, abra o programa nanoZ. Este programa irá fornecer leituras de impedância e realizar-regulamentação em cada canal ligado do Microdrive. </li><li> Ir para o Dispositivo de drop-down e selecione a nanoZ, após o que irá mostrar &quot;Conexão estabelecida&quot; na parte inferior da janela. Em seguida, selecione o adaptador apropriado para testar no menu drop-down. Clique em &quot;Teste de impedâncias&quot; e defina a frequência de teste para 1004 Hz (40 ciclos, 0 ms pausa). Clique em &quot;ponta de prova&quot;, que vai abrir o &quot;Probe Report&quot; janela que mostra todos os canais disponíveis com seus mohms leituras. Salve esses valores de impedância, clicando no ícone do disco ou selecionando &quot;File&quot;, depois &quot;Salvar relatório&quot;. </li><li> Em seguida, clique em &quot;DC Electroplate&quot; e atribuiros seguintes valores: mode = jogo impedâncias, chapeamento atual = -1,0 mA, Target = 350 kW a 1.004 Hz, 5 corridas, 5 seg de intervalo, 2 segundos de pausa. </li><li> Clique em &quot;Autoplate&quot;. O programa vai ler primeiro a impedância de cada canal, em seguida, aplicar a corrente especificada para esse canal, re-testar a impedância e aplicar atual como necessário até que a impedância de destino (ou um valor inferior) é atingido. Enquanto que o objectivo é o de reduzir impedância do eléctrodo, é possível que os canais serão galvaniza valores abaixo de 100 kW. Em tais casos, é possível que os fios vizinhos na tetrodo foram curto. Se isso acontecer, inverta a polaridade da corrente (+ 1,0 mA) para remover partículas de ouro em excesso, re-testar a impedância desse canal, e depois repetir o galvanoplastia. Valores de impedância finais típicas em um feixe de quatro fios 12,5 fiM variar 150-325 kW. </li><li> Se não houver um único canal que não revestida abaixo de 350 kW, repetir o processo de galvanização.O programa irá pular os canais que já atingiram o alvo e só canais placa que não têm. </li><li> Uma vez que todos os canais foram semeadas a uma impedância aceitável, feche o programa nanoZ e desligar o dispositivo. Levante os eletrodos da solução de revestimento e diminuir as pontas em água destilada torre Delrin, a fim de enxaguar partículas de ouro em excesso. </li><li> Gire os parafusos da unidade no sentido horário até que os eletrodos são criados para a sua posição. Agora, o Microdrive e eletrodos estão prontos para implantação. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nós descrevemos um conjunto de técnicas para a construção de microdrives leves e compactas para a gravação de unidade extracelular e atividade potencial de campo em camundongos. Ao construir microdrives personalizados com bases formadas a partir de vidro acrílico (metacrilato de metila), o núcleo do sistema pode ser facilmente adaptado para várias unidades e para o direcionamento de uma grande variedade de regiões neurais. Nós modificamos com sucesso o sistema de gravação de múltiplos alvos cerebrais e com matrizes maio...

A utilização da técnica de microeléctrodo para gravar sinais neuronais extracelulares in vivo, tem uma longa tradição e valorizados na neuroscience 1, 2. A capacidade de gravar a atividade elétrica de várias regiões do cérebro em animais se comportando livremente, no entanto, uma tecnologia mais recente que está se tornando cada vez mais comuns, como os pacotes de software para a aquisição, análise e discriminação de sinais neurais torna-se mais sofisticada e user-friendly 3, 4. Os avanços tecnológicos do lado do software foram também acompanhadas por uma redução no peso e volume dos dispositivos implantáveis, que foram dimensionados de maneira suficiente para gravar em pequenos mamíferos, tais como ratos. A utilização de componentes de plástico leves (principalmente), os investigadores são capazes de construir microdrives que permitem o posicionamento independente de eléctrodos ou tetrodos para segmentar uma ampla variedade de regiões cerebrais 5-7. Mesmo estruturas cerebrais profundas, tais como o6 amígdala e do estriado 5, pode ser rotineiramente alvo com a seleção de um parafuso de unidade adequadamente longo. Estas técnicas de gravação permitem aos pesquisadores obter sinais neurais de alta fidelidade e estão em registrar a atividade elétrica dos neurônios registrados intracelular 8, 9. Usando esses tipos de microdrives, registramos com sucesso-unidades individuais de ratos por até dois meses após o implante 10. Além disso, a natureza dos dispositivos leve (cerca de 1,5-2,0 g) resultou em desempenho comportamental, que é comparável aos ratos não-implantados em muitas funções comportamentais. Em particular, temos demonstrado que camundongos implantados apresentam desempenho normal na novela tarefa de reconhecimento de objeto 10 ea tarefa lugar de objeto (dados não publicados). O uso de microdrives acoplados a vários tetrodes permite aos pesquisadores para monitorar e analisar a atividade neural no nível de redeao mesmo tempo, a gravação de múltiplas unidades individuais dentro do cérebro. Gravação com estas tetrodes tem várias vantagens importantes para fins de identificação da unidade e possibilita a aquisição de alta precisão e discriminação de múltiplas unidades individuais 11. Nós descrevemos como fabricar e ouro placa pacotes tetrode e posteriormente carregá-los em portadores de eletrodos de driveable. Um tipo de suporte da unidade descrevemos está disponível comercialmente eo outro é um projeto simples, mas facilmente expansível, unidade que pode acomodar várias operadoras e arranjos tetrode sem um investimento significativo de recursos.

<table><tbody><tr><td>0,0005" (12,5 &mu; M) diâmetro Fio de platina-irídio </td><td>California Fine Wire</td><td>CFW # 100-167</td><td>HML VG isolado <a href = "http://www.calfinewire.com" target = "_blank ">www.calfinewire.com< / a></td></tr><tr><td>0.002" (50 &mu; M) diâmetro Stableohm 675 fio</td><td>California Fine Wire</td><td>CFW # 100-188</td><td>HML isolado Ni-Cr</td></tr><tr><td>tubulação de poliamida</td><td>Polymicro Technologies 1068150020</td><td></td><td>99 mícrons I.D., 166 mícrons OD <a href="http://www.polymicro.com" target="_blank">www.polymicro.com</a></td></tr><tr><td>brass guias</td><td>World Plastics Inc</td><td></td><td>3,3 x 6,6 mm</td></tr><tr><td>Delrin blocks</td><td>World Parafusos de</td> latão de cabeça de rosca Plastics Inc <td></td><td>3.13 x 2.5 mm</td></tr><tr><td></td><td>J.I. Morris Co.</td><td>00-90 x 1/2</td><td>parafuso de acionamento <a href="http://www.jimorrisco.com" target="_blank">www.jimorrisco.com</a></td></tr><tr><td>hex porcas de latão</td><td>J.I. Morris Co.</td><td>00-90</td><td></td></tr><tr><td>Parafusos de latão de cabeça cilíndrica</td><td>J.I. Morris Co.</td><td>000-120 x 3/32</td><td>EIB montagem e parafuso de aterramento</td></tr><tr><td>acrílico plexiglass</td><td>acrílico Canal Street Plastics</td><td></td><td>5 mm de espessura, transparente, <a href="http://www.cpcnyc.com" target="_blank"> www.cpcnyc.com</a></td></tr><tr><td>cianoacrilato</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td>2 g tubo</td></tr><tr><td>placa de interface eletrônica</td><td>Neuralynx</td><td>EIB-18</td><td><a href="http://www.neuralynx.com" target="_blank">www.neuralynx.com</a></td></tr><tr><td>solução de ouro sem cianeto</td><td>SIFCO</td><td>SIFCO 5355</td><td><a href="http://www.sifcoasc.com" target="_blank">www.sifcoasc.com</a></td></tr><tr><td>VersaDrive 4</td><td>Neuralynx</td><td></td> estação de montagem <td>de quatro tetrodos modelo</td></tr><tr><td></td><td>Neuralynx Neuralynx</td><td></td><td></td></tr><tr><td>girador de tetrodo motorizado</td><td>Neuralynx</td><td>tetrode spinner 2.0</td><td></td></tr><tr><td>VersaDrive gabarito</td><td>Neuralynx</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ferro de solda</td><td>Radio Shack</td><td>64-2802B</td><td><a href="http://www.radioshack.com" target="_blank">www.radioshack.com</a></td></tr><tr><td>nanoZ</td><td>Neuralynx</td><td></td><td></td></tr><tr><td>broca de broca pequena / driver</td><td>Ram Produtos</td><td>Rampower 35</td><td>com controlador de pedal, <a href="http://www.ramprodinc.com" target="_blank">www.ramprodinc.com</a></td></tr><tr><td>brocas Small</td><td>Parts, Inc.</td><td></td><td>Bits de 3/32", <a href="http://www.smallpartsinc.com" target="_blank">www.smallpartsinc.com</a></td></tr><tr><td>microscópio de dissecação</td><td>Olympus</td><td>SZ-60</td><td><a href="http://www.olympusamerica.com" target="_blank">www.olympusamerica.com</a></td></tr><tr><td>pistola de calor Pistola de ajuste</td><td>Alphawire</td><td>3</td><td>use a configuração "1" apenas, <a href="http://www.alphawire.com" target="_blank">www.alphawire.com</a></td></tr><tr><td>26 AWG fio de cobre</td><td>Arcor Electronics</td><td>F26</td><td>para fios terra, <a href="http://www.arcorelectronics.com" target="_blank"> www.arcorelectronics.com</a></td></tr><tr><td>fluxo de solda Eagle</td><td></td><td>2 oz, #205</td><td></td></tr><tr><td>0.02" de diâmetro solda</td><td>Kester</td><td>24-6337-0010</td><td><a href="http://www.kester.com" target="_blank"> www.kester.com</a></td></tr><tr><td>torno de bancada</td><td>Vacu-Vise</td><td>Modelo 300</td><td></td></tr><tr><td>luz de fibra óptica</td><td>Nikon</td><td>MKII</td><td>braços de luz dupla, <a href="http://www.nikon.com" target="_blank"> www.nikon.com</a></td></tr><tr><td>5-min epóxi</td><td>Aliado Eletrônica</td><td></td><td>25 ml, <a href="http://www.alliedelec.com" target="_blank"> www.alliedelec.com</a></td></tr><tr><td>pinças finas</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-4907, RS-5010</td><td>Material INOX, <a href="http://www.roboz.com" target="_blank"> www.roboz.com</a></td></tr><tr><td>micro tesoura de dissecação</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 1. Materiais e reagentes usados para a construção de tetrodes e microdrives.</td></tr></tbody></table>

construção de matrizes microdrive para gravações neurais crônica na awake mice comportam

Construction of Microdrive Arrays for Chronic Neural Recordings in Awake Behaving Mice

Registros eletrofisiológicos State-of-the-art de cérebros de animais se comportando livremente permitem aos pesquisadores examinar simultaneamente potenciais de campo locais (LFPs) de populações de neurônios e os potenciais de ação das células individuais, como o animal se engaja em tarefas experimentalmente relevantes. Microdrives cronicamente implantados permitem gravações do cérebro para durar por períodos de várias semanas. Unidades miniaturizados e componentes leves permite que esses gravações a longo prazo para ocorrer em pequenos mamíferos, tais como ratos. Usando tetrodes, que consistem em feixes firmemente trançado de quatro eléctrodos, em que cada fio tem um diâmetro de 12,5 um, é possível isolar neurónios fisiologicamente activos superficiais nas regiões do cérebro tais como o córtex cerebral, hipocampo dorsal e subículo, bem como regiões mais profundas, tais como o estriado e amígdala. Além disso, esta técnica segura, de alta fidelidade as gravações neurais estáveis ​​como o animal é desafiado com uma variety de tarefas comportamentais. Este manuscrito descreve várias técnicas que foram otimizados para gravar a partir do cérebro do rato. Primeiro, vamos mostrar como fabricar tetrodes, carregá-los em tubos de driveable e dourar as pontas, a fim de reduzir a sua impedância de mohms a gama kohms. Em segundo lugar, vamos mostrar como construir um conjunto microdrive personalizado para transportar e mover os tetrodes verticalmente, com o uso de materiais mais baratos. Em terceiro lugar, vamos mostrar os passos para a montagem de um Microdrive disponível comercialmente (Neuralynx VersaDrive), que é projetado para transportar tetrodes independentemente móveis. Por fim, apresentamos resultados representativos de potenciais de campo locais e sinais single-unit obtidos no subiculum dorsal de ratos. Estas técnicas podem ser facilmente modificado para acomodar diferentes tipos de conjuntos de eléctrodos e os regimes de gravação no cérebro do rato.

<p class="jove_content"&gt; Após a implantação do microdrive e baixando os eléctrodos com os objectivos pretendidos do cérebro, a um sistema de aquisição de dados amplificado, como por exemplo um Neuralynx lince-8, é necessário para a gravação de sinais neurais. Gravações neurais representativas de potenciais de campo locais (LFPs) e potenciais de ação single-unit (muitas vezes denominados &quot;picos&quot;) a partir da dorsal subiculum rato são mostrados na<strong&gt; Figura 2</strong&gt;. LFP sinais foram amostrados a 3 kHz e band-pass filtra...

A concepção e montagem de microdrives no registros eletrofisiológicos in vivo de sinais do cérebro do rato é descrito. Anexando pacotes de microeletrodos para portadores de driveable resistentes, estas técnicas permitem gravações neurais de longo prazo e estável. O design leve permite o desempenho comportamental irrestrito pelo animal após a implantação da unidade.

Construção de Matrizes Microdrive para gravações Neurais crônica na Awake Mice comportam

State-of-the-art electrophysiological recordings from the brains of freely behaving animals allow researchers to simultaneously examine local field ...

O objetivo geral deste procedimento é construir uma micro unidade que possa ser usada para gravações cerebrais em camundongos enquanto eles se movem livremente dentro de uma câmara experimental. Isso é feito preparando primeiro um feixe de quatro microeletrodos em um tede. O segundo passo é construir a base do micro drive e montar os componentes do drive.Em seguida, os tetros são conectados à unidade e conectados a pinos de ouro. A etapa final é banhar a ponta dos tetros para diminuir sua impedância e garantir gravações de alto sinal para ruído. Em última análise, as matrizes de micro drives crônicos são usadas para registrar a atividade neural de populações de neurônios, bem como neurônios únicos em animais acordados que se comportam.A principal vantagem dessa técnica é que ela oferece uma solução de ondas de luz bastante barata para gravações cerebrais crônicas em camundongos e outros pequenos mamíferos. Essa tecnologia pode abordar questões-chave no campo da neurociência, como a forma como os neurônios codificam informações durante a execução de tarefas comportamentais. Empregamos regularmente essa técnica para registrar a partir de neurônios do hipocampo dorsal e ulu, mas também a usamos para atingir estruturas mais profundas, como a amígdala.A demonstração visual deste método é crucial, pois a construção e a parte de montagem são difíceis de aprender, e também porque você está lidando com uma peça muito pequena e delicada para iniciar a fabricação do tetro. Para o hipocampo, corte 30 centímetros de fio isolado de 12,5 micrômetros de diâmetro de platina de irídio, dobre o fio duas vezes para formar quatro fios paralelos, cada um com 7,5 centímetros de comprimento. Em seguida, prenda um clipe revestido de borracha perto da parte inferior do fio drapeado e prenda-o ao girador tetro motorizado, certificando-se de que o fio esteja esticado, mas não muito esticado ou que o peso do rolamento seja isso fará com que ele se quebre.Durante o processo de centrifugação, aplique 80 rotações no sentido horário para enrolar o tero, seguidas de 20 rotações no sentido anti-horário para liberar a tensão. O número final de rotações por comprimento de fio deve ser de oito rotações por mícron. Em seguida, defina a pistola de calor para 400 graus Celsius e use-a para fundir os fios.Passe a pistola de ar quente para cima e para baixo ao longo dos fios por cinco segundos, mantendo-a a aproximadamente dois centímetros do fio o tempo todo. Para derreter suavemente o revestimento de ligação VG nos fios, corte a parte superior do tero para formar quatro fios separados e, em seguida, solte a extremidade inferior do clipe. Coloque o tero concluído em uma caixa de retenção livre de poeira para armazenamento até que a unidade seja concluída.Primeiro, construa a base para o micro drive lixando um pedaço quadrado de acrílico plexiglass de 20 milímetros com cinco milímetros de espessura em uma forma que permitirá que o mouse se mova livremente com o drive depois que ele for implantado na cabeça. Em seguida, solde duas guias de latão de 3,3 por 6,3 milímetros juntas perpendicularmente. A guia vertical de latão segurará o parafuso de acionamento e os eletrodos enquanto a peça horizontal será colada na base de acrílico.Em seguida, comece a montagem do próprio acionamento passando um parafuso de cabeça de enchimento pela parte superior da guia e em um bloco de plástico delrin. Rosqueie uma mama sextavada que não esteja no parafuso até que a porca esteja quase tocando a parte inferior da guia. No entanto, não o aperte totalmente.Em vez disso, derreta uma pequena quantidade de solda para unir a porca e o parafuso. Mas tome cuidado para não soldar nada ao guia. Girar o parafuso deve mover o bloco de delrin no sentido horário e anti-horário verticalmente ao longo da rosca.Uma vez montado o acionamento, volte para a base de acrílico e corte uma ranhura de três milímetros de largura onde ficará o acionamento do eletrodo. Em seguida, passe a guia horizontal do sutiã pela ranhura e use a cola Sano ACRL para prender a peça à base. Em seguida, coloque uma placa de interface eletrônica no topo da base e, para marcar a localização dos dois orifícios dos parafusos usando uma broca de ponta de 1,5 milímetro, faça furos com cuidado nas marcas dos parafusos que manterão o EIB no lugar no topo da base.Em seguida, rosqueie dois parafusos de peito nos orifícios. Use uma tesoura de microdissecação para cortar quatro pedaços de tubos de poliamida de sete milímetros de comprimento. Alinhe-os um ao lado do outro em um pedaço de fita adesiva dobrada e aplique sano ACRL para juntá-los.Dê tempo suficiente para que os tubos das juntas sequem completamente. Em seguida, aplique cuidadosamente uma pequena quantidade de cianoacrilato na face do delrin. Em seguida, coloque os quatro tubos de junta na cola.Novamente, aguarde tempo suficiente para que a cola endureça completamente antes de tentar mover a unidade. Teste se os tubos de poliamida estão bem presos e se todo o conjunto se move suavemente sem tocar na guia ou encontrar qualquer resistência. Em seguida, prepare o parafuso de aterramento e conecte o fio terra ao EIB conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.Conecte tetros e/ou eletrodos individuais ao EIB passando primeiro os fios pelo tubo de poliamida, permitindo que eles se estendam pelo menos dois milímetros além da extremidade do tubo. Em seguida, aplique uma pequena gota de cianoacrilato, fixando o fio ao tubo e evitando qualquer movimento do fio. Em seguida, conecte as pontas soltas do tero ou outros fios a um orifício do canal EIB usando um pino dourado.Por fim, corte o excesso de arame com uma tesoura fina mostrada. Aqui estão exemplos de outras configurações de unidade que podem ser construídas para atingir diferentes regiões do cérebro. Para começar, faça a montagem do inversor.Corte o tubo de poliamida em 10 milímetros e guie-o através do menor orifício em um transportador de tetro até que ele se estenda 0,5 milímetros além do final. Em seguida, coloque o tubo de poliamida no lugar e repita essas etapas para os outros três tubos e transportadores. Depois que o epóxi estiver totalmente definido.Guie cada tubo de poliamida por um dos quatro orifícios na base de acionamento Versa. Em seguida, empurre um alfinete de inseto pelo orifício externo. Isso manterá o transportador tetro alinhado e servirá como um trilho para o transportador viajar.Repita isso para as outras três operadoras. Em seguida, pegue uma tampa e alinhe-a com os quatro pinos de insetos de modo que a tampa cubra a base e os transportadores de tero residam dentro da tampa. Rosqueie um parafuso de máquina de um milímetro por cinco milímetros através do orifício apropriado na tampa e no suporte tero.Repita isso para os outros três parafusos. Gire todos os parafusos no sentido horário até que os suportes tetro estejam na posição superior e os tubos de poliamida fiquem visíveis através da abertura da tampa. Usando uma tesoura de microdissecação fina, corte o tubo logo abaixo da base para que todos os quatro tubos de poliamida tenham o mesmo comprimento.Em seguida, use um microscópio de dissecação para passar cuidadosamente os tetros pelos tubos de poliamida e prendê-los no lugar com uma pequena gota de ano. Em seguida, corte os tetros de forma que eles se estendam apenas 2,0 milímetros além dos tubos. Antes de conectar os fios tero aos receptáculos de ouro.Primeiro, conecte os fios terra à tampa. Em seguida, guie todos os fios tero soltos através de seus respectivos orifícios de receptáculo na tampa e instale a tampa alinhando os orifícios dos pinos de insetos e pressionando o encaixe na base. Por fim, apare qualquer excesso de fio que permaneça saliente da parte superior da tampa.Primeiro, gire os parafusos da micro unidade no sentido anti-horário para a posição mais baixa. Em seguida, monte com segurança o micro drive em um grampo que permitirá o abaixamento das pontas dos eletrodos na solução de revestimento de ouro. Encha uma torre de delrin com solução de ouro CCO e a outra torre com água destilada e abaixe as pontas dos eletrodos na solução de ouro.Em seguida, abra o programa Nano Z e clique em Eletroplata DC. Defina o modo para combinar as impedâncias da corrente de revestimento para 1.0 microamperes negativos e o alvo para 350 kilo ohms a 1004 hertz. Em seguida, configure-o para ser executado cinco vezes em intervalos de cinco segundos com uma pausa de dois segundos entre cada execução.Assim que o programa estiver configurado, clique em placa automática, o programa lerá primeiro a impedância de cada canal. Em seguida, aplique a corrente especificada a esse canal, teste novamente a impedância e aplique a corrente conforme necessário até que a impedância alvo ou um valor mais baixo seja atingido. Se a impedância cair abaixo de 100 kilo ohms, inverta a polaridade da corrente para 1,0 microamperes positivos para remover o excesso de partículas de ouro e, em seguida, repita a galvanoplastia Os valores típicos de impedância final em um feixe de quatro fios de 12,5 micrômetros variam de 150 a 325 kilo ohms.Depois que todos os canais forem revestidos para um nível de impedância aceitável, feche o programa Nano Z e desconecte o dispositivo. Em seguida, levante os eletrodos para fora da solução de revestimento e abaixe as pontas na torre de delrin de água destilada para enxaguar o excesso de partículas de ouro Gravações neurais representativas usando o micro drive para medir os potenciais de campo locais do mouse. Os ulus dorsais são mostrados aqui.Os quatro canais mostrados na parte A são um exemplo de um sinal mal aterrado que resulta em valores saturados e sinais extremamente ruidosos. Os quatro canais mostrados na parte B, no entanto, são um bom exemplo de um sinal bem aterrado com oscilações de rede claramente visíveis na faixa de quatro a 12 hertz. À esquerda está um exemplo de uma gravação pobre do Tero.Como os quatro fios de eletrodo registraram formas de onda de pico essencialmente idênticas, mais de mil formas de onda de pico individuais foram sobrepostas umas sobre as outras para cada canal dos teros. Esse padrão provavelmente se deveu à fusão dos fios durante a etapa de fusão do isolamento da fabricação do tero, fazendo com que o feixe de fios atuasse efetivamente como um único eletrodo de gravação. À direita está um exemplo de uma boa gravação tetro mostrando formas de onda de pico sobrepostas de uma unidade putativa com diferentes amplitudes nos quatro fios tede.Esse tipo de padrão de registro de pico permite uma melhor discriminação de unidades durante o agrupamento e a separação off-line subsequentes. Depois de construir este micro mergulho, é importante testar cada um dos canais do eletrodo e certificar-se de que eles estejam dentro de uma faixa de impedância adequada antes de passar para a cirurgia de implantação. Depois de assistir a este vídeo, você deve se sentir confortável construindo teros e microeletrodos para implantação crônica no mouse.Boa sorte construindo suas unidades e divirta-se com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Neste protocolo, demonstramos como fabricar uma matriz de unidade de micro-crônica para gravações eletrofisiológicas em ratos.

Micro-drive Array para Crônica In vivo</emGravação>: Fabricação Unidade

Neste protocolo, demonstramos como fabricar e tetrodes condição para uso com uma matriz de micro-drive, que foi projetada para gravações eletrofisiológicas crônica em ratos. Além disso, ilustram as fases finais do micro-drive de construção da matriz, que inclui a instalação de fios de aterramento e um cone de proteção.

Micro-drive Array para Crônica In vivo</emGravação>: Assembléia Tetrodo

O desenho, fabrico e montagem de um ultra-leve motorizado microdrive é descrito. O dispositivo fornece uma solução de custo eficaz e fácil de usar para gravações de crônicas de unidades individuais em pequenos animais se comportando.

Concepção e montagem de um Microdrive Ultra-leve motorizada para doenças crônicas Recordings Neurais em Pequenos Animais

O vídeo demonstra a gravação eletrofisiológica simultânea de várias regiões do cérebro em um rato usando uma matriz integrativa de micro-drives. Os eletrodos de registro são colocados no bulbo olfatório, os eletrodos de referência no córtex frontal e os eletrodos de matriz de micro-drive no hipocampo. O rato pode forragear livremente e a gravação simultânea de todos os eletrodos implantados é registrada usando a matriz.

Um método de matriz de micro-drive para registro eletrofisiológico de várias regiões do cérebro

Compreender os substratos neurais do comportamento requer gravação de conjunto de circuitos cerebrais. Devido à sua tratabilidade genética, o camundongo oferece um modelo para dissecção de circuitos e mimetismo de doenças. Aqui, é descrito um método de projetar e fabricar sondas miniaturizadas que é adequado para atingir a estrutura cerebral profunda do mouse.

Projeto e fabricação de Ultraleve Peso, ajustável Sondas Multi-eletrodo para gravações eletrofisiológicas em Ratos

Apresentamos a construção de um hyperdrive 3D-printable com dezoito tetrodes independentemente ajustáveis. O hiperpropulsor é projetado para gravar a atividade cerebral em livremente se comportando ratos durante um período de várias semanas.

Construção de um Hyperdrive melhorado de multi Tetrode para gravação Neural em grande escala em comportar-se ratos

Este protocolo descreve a construção de uma matriz híbrida do Microdrive que permita a implantação de nove tetrodes independentemente ajustáveis e uma ponta de prova ajustável do opto-silicone em duas regiões do cérebro em ratos livremente moventes. Também é demonstrado um método para recuperar e reusar com segurança a sonda opto-silício para múltiplos propósitos.

Sistema híbrido do Microdrive com a ponta de prova recuperável do opto-silicone e tetrode para a gravação high-density do duplo-local em ratos livremente moventes

Este protocolo descreve um procedimento para a construção de matrizes de microeletrodos de fibra de carbono para gravações eletrofisiológicas in vivo crônicas e agudas em camundongos (Mus musculus) e furão(Mustela putorius furo) de múltiplas regiões cerebrais. Cada passo, após a compra de fibras de carbono bruto para implantação de matriz de microeletrodos, é descrito em detalhes, com ênfase na construção de matriz de microeletrodos.

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Aqui, descrevemos um projeto de micro-unidade, procedimento de implante cirúrgico e estratégia de recuperação pós-cirurgia que permitem gravações crônicas de campo e unidade única de várias regiões cerebrais simultaneamente em camundongos jovens e adolescentes através de uma janela crítica de desenvolvimento do dia pós-natal 20 (p20) ao dia pós-natal 60 (p60) e além.

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Aprenda a construir microdrives leves para gravações eletrofisiológicas crônicas em camundongos acordados e em movimento. Este método permite registrar atividade neural de populações e neurônios individuais com alta qualidade de sinal.

Construção de Matrizes Microdrive para gravações Neurais crônica na Awake Mice comportam

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