Construção de Matrizes Microdrive para gravações Neurais crônica na Awake Mice comportam

A concepção e montagem de microdrives no registros eletrofisiológicos in vivo de sinais do cérebro do rato é descrito. Anexando pacotes de microeletrodos para portadores de driveable resistentes, estas técnicas permitem gravações neurais de longo prazo e estável. O design leve permite o desempenho comportamental irrestrito pelo animal após a implantação da unidade.

O objetivo geral deste procedimento é construir uma micro unidade que possa ser usada para gravações cerebrais em camundongos enquanto eles se movem livremente dentro de uma câmara experimental. Isso é feito preparando primeiro um feixe de quatro microeletrodos em um tede. O segundo passo é construir a base do micro drive e montar os componentes do drive.

Em seguida, os tetros são conectados à unidade e conectados a pinos de ouro. A etapa final é banhar a ponta dos tetros para diminuir sua impedância e garantir gravações de alto sinal para ruído. Em última análise, as matrizes de micro drives crônicos são usadas para registrar a atividade neural de populações de neurônios, bem como neurônios únicos em animais acordados que se comportam.

A principal vantagem dessa técnica é que ela oferece uma solução de ondas de luz bastante barata para gravações cerebrais crônicas em camundongos e outros pequenos mamíferos. Essa tecnologia pode abordar questões-chave no campo da neurociência, como a forma como os neurônios codificam informações durante a execução de tarefas comportamentais. Empregamos regularmente essa técnica para registrar a partir de neurônios do hipocampo dorsal e ulu, mas também a usamos para atingir estruturas mais profundas, como a amígdala.

A demonstração visual deste método é crucial, pois a construção e a parte de montagem são difíceis de aprender, e também porque você está lidando com uma peça muito pequena e delicada para iniciar a fabricação do tetro. Para o hipocampo, corte 30 centímetros de fio isolado de 12,5 micrômetros de diâmetro de platina de irídio, dobre o fio duas vezes para formar quatro fios paralelos, cada um com 7,5 centímetros de comprimento. Em seguida, prenda um clipe revestido de borracha perto da parte inferior do fio drapeado e prenda-o ao girador tetro motorizado, certificando-se de que o fio esteja esticado, mas não muito esticado ou que o peso do rolamento seja isso fará com que ele se quebre.

Durante o processo de centrifugação, aplique 80 rotações no sentido horário para enrolar o tero, seguidas de 20 rotações no sentido anti-horário para liberar a tensão. O número final de rotações por comprimento de fio deve ser de oito rotações por mícron. Em seguida, defina a pistola de calor para 400 graus Celsius e use-a para fundir os fios.

Passe a pistola de ar quente para cima e para baixo ao longo dos fios por cinco segundos, mantendo-a a aproximadamente dois centímetros do fio o tempo todo. Para derreter suavemente o revestimento de ligação VG nos fios, corte a parte superior do tero para formar quatro fios separados e, em seguida, solte a extremidade inferior do clipe. Coloque o tero concluído em uma caixa de retenção livre de poeira para armazenamento até que a unidade seja concluída.

Primeiro, construa a base para o micro drive lixando um pedaço quadrado de acrílico plexiglass de 20 milímetros com cinco milímetros de espessura em uma forma que permitirá que o mouse se mova livremente com o drive depois que ele for implantado na cabeça. Em seguida, solde duas guias de latão de 3,3 por 6,3 milímetros juntas perpendicularmente. A guia vertical de latão segurará o parafuso de acionamento e os eletrodos enquanto a peça horizontal será colada na base de acrílico.

Em seguida, comece a montagem do próprio acionamento passando um parafuso de cabeça de enchimento pela parte superior da guia e em um bloco de plástico delrin. Rosqueie uma mama sextavada que não esteja no parafuso até que a porca esteja quase tocando a parte inferior da guia. No entanto, não o aperte totalmente.

Em vez disso, derreta uma pequena quantidade de solda para unir a porca e o parafuso. Mas tome cuidado para não soldar nada ao guia. Girar o parafuso deve mover o bloco de delrin no sentido horário e anti-horário verticalmente ao longo da rosca.

Uma vez montado o acionamento, volte para a base de acrílico e corte uma ranhura de três milímetros de largura onde ficará o acionamento do eletrodo. Em seguida, passe a guia horizontal do sutiã pela ranhura e use a cola Sano ACRL para prender a peça à base. Em seguida, coloque uma placa de interface eletrônica no topo da base e, para marcar a localização dos dois orifícios dos parafusos usando uma broca de ponta de 1,5 milímetro, faça furos com cuidado nas marcas dos parafusos que manterão o EIB no lugar no topo da base.

Em seguida, rosqueie dois parafusos de peito nos orifícios. Use uma tesoura de microdissecação para cortar quatro pedaços de tubos de poliamida de sete milímetros de comprimento. Alinhe-os um ao lado do outro em um pedaço de fita adesiva dobrada e aplique sano ACRL para juntá-los.

Dê tempo suficiente para que os tubos das juntas sequem completamente. Em seguida, aplique cuidadosamente uma pequena quantidade de cianoacrilato na face do delrin. Em seguida, coloque os quatro tubos de junta na cola.

Novamente, aguarde tempo suficiente para que a cola endureça completamente antes de tentar mover a unidade. Teste se os tubos de poliamida estão bem presos e se todo o conjunto se move suavemente sem tocar na guia ou encontrar qualquer resistência. Em seguida, prepare o parafuso de aterramento e conecte o fio terra ao EIB conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.

Conecte tetros e/ou eletrodos individuais ao EIB passando primeiro os fios pelo tubo de poliamida, permitindo que eles se estendam pelo menos dois milímetros além da extremidade do tubo. Em seguida, aplique uma pequena gota de cianoacrilato, fixando o fio ao tubo e evitando qualquer movimento do fio. Em seguida, conecte as pontas soltas do tero ou outros fios a um orifício do canal EIB usando um pino dourado.

Por fim, corte o excesso de arame com uma tesoura fina mostrada. Aqui estão exemplos de outras configurações de unidade que podem ser construídas para atingir diferentes regiões do cérebro. Para começar, faça a montagem do inversor.

Corte o tubo de poliamida em 10 milímetros e guie-o através do menor orifício em um transportador de tetro até que ele se estenda 0,5 milímetros além do final. Em seguida, coloque o tubo de poliamida no lugar e repita essas etapas para os outros três tubos e transportadores. Depois que o epóxi estiver totalmente definido.

Guie cada tubo de poliamida por um dos quatro orifícios na base de acionamento Versa. Em seguida, empurre um alfinete de inseto pelo orifício externo. Isso manterá o transportador tetro alinhado e servirá como um trilho para o transportador viajar.

Repita isso para as outras três operadoras. Em seguida, pegue uma tampa e alinhe-a com os quatro pinos de insetos de modo que a tampa cubra a base e os transportadores de tero residam dentro da tampa. Rosqueie um parafuso de máquina de um milímetro por cinco milímetros através do orifício apropriado na tampa e no suporte tero.

Repita isso para os outros três parafusos. Gire todos os parafusos no sentido horário até que os suportes tetro estejam na posição superior e os tubos de poliamida fiquem visíveis através da abertura da tampa. Usando uma tesoura de microdissecação fina, corte o tubo logo abaixo da base para que todos os quatro tubos de poliamida tenham o mesmo comprimento.

Em seguida, use um microscópio de dissecação para passar cuidadosamente os tetros pelos tubos de poliamida e prendê-los no lugar com uma pequena gota de ano. Em seguida, corte os tetros de forma que eles se estendam apenas 2,0 milímetros além dos tubos. Antes de conectar os fios tero aos receptáculos de ouro.

Primeiro, conecte os fios terra à tampa. Em seguida, guie todos os fios tero soltos através de seus respectivos orifícios de receptáculo na tampa e instale a tampa alinhando os orifícios dos pinos de insetos e pressionando o encaixe na base. Por fim, apare qualquer excesso de fio que permaneça saliente da parte superior da tampa.

Primeiro, gire os parafusos da micro unidade no sentido anti-horário para a posição mais baixa. Em seguida, monte com segurança o micro drive em um grampo que permitirá o abaixamento das pontas dos eletrodos na solução de revestimento de ouro. Encha uma torre de delrin com solução de ouro CCO e a outra torre com água destilada e abaixe as pontas dos eletrodos na solução de ouro.

Em seguida, abra o programa Nano Z e clique em Eletroplata DC. Defina o modo para combinar as impedâncias da corrente de revestimento para 1.0 microamperes negativos e o alvo para 350 kilo ohms a 1004 hertz. Em seguida, configure-o para ser executado cinco vezes em intervalos de cinco segundos com uma pausa de dois segundos entre cada execução.

Assim que o programa estiver configurado, clique em placa automática, o programa lerá primeiro a impedância de cada canal. Em seguida, aplique a corrente especificada a esse canal, teste novamente a impedância e aplique a corrente conforme necessário até que a impedância alvo ou um valor mais baixo seja atingido. Se a impedância cair abaixo de 100 kilo ohms, inverta a polaridade da corrente para 1,0 microamperes positivos para remover o excesso de partículas de ouro e, em seguida, repita a galvanoplastia Os valores típicos de impedância final em um feixe de quatro fios de 12,5 micrômetros variam de 150 a 325 kilo ohms.

Depois que todos os canais forem revestidos para um nível de impedância aceitável, feche o programa Nano Z e desconecte o dispositivo. Em seguida, levante os eletrodos para fora da solução de revestimento e abaixe as pontas na torre de delrin de água destilada para enxaguar o excesso de partículas de ouro Gravações neurais representativas usando o micro drive para medir os potenciais de campo locais do mouse. Os ulus dorsais são mostrados aqui.

Os quatro canais mostrados na parte A são um exemplo de um sinal mal aterrado que resulta em valores saturados e sinais extremamente ruidosos. Os quatro canais mostrados na parte B, no entanto, são um bom exemplo de um sinal bem aterrado com oscilações de rede claramente visíveis na faixa de quatro a 12 hertz. À esquerda está um exemplo de uma gravação pobre do Tero.

Como os quatro fios de eletrodo registraram formas de onda de pico essencialmente idênticas, mais de mil formas de onda de pico individuais foram sobrepostas umas sobre as outras para cada canal dos teros. Esse padrão provavelmente se deveu à fusão dos fios durante a etapa de fusão do isolamento da fabricação do tero, fazendo com que o feixe de fios atuasse efetivamente como um único eletrodo de gravação. À direita está um exemplo de uma boa gravação tetro mostrando formas de onda de pico sobrepostas de uma unidade putativa com diferentes amplitudes nos quatro fios tede.

Esse tipo de padrão de registro de pico permite uma melhor discriminação de unidades durante o agrupamento e a separação off-line subsequentes. Depois de construir este micro mergulho, é importante testar cada um dos canais do eletrodo e certificar-se de que eles estejam dentro de uma faixa de impedância adequada antes de passar para a cirurgia de implantação. Depois de assistir a este vídeo, você deve se sentir confortável construindo teros e microeletrodos para implantação crônica no mouse.

Boa sorte construindo suas unidades e divirta-se com seus experimentos.