Name: Uma preparação semi-intactas isolada do Rato Vestibular epitélio sensorial de Eletrofisiologia e de alta resolução Microscopia de dois fótons (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Aprenda a preparar epitélio vestibular semi-intacto de camundongo para estudos de eletrofisiologia e microscopia de dois fótons. Este método permite investigar propriedades de membrana e sinalização de cálcio em células ciliadas vestibulares.

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O financiamento para este trabalho foi fornecido por uma Garnett Passe e Rodney Williams Memorial Foundation projeto de Subsídio à R. Lim e AJ Camp.

1. Animais <ol><li> Camundongos foram obtidas a partir do Centro de Rodent australiano (ARC, Perth, Austrália) e realizada na Universidade de Sydney Bosch Biotério em um claro / escuro ciclo normal de 12 horas, com enriquecimento ambiental. Todos os experimentos descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Sydney animal. </li><li> Os ratinhos macho e fêmea (C57/BL6) foram utilizadas para todas as experiências uma vez que esta estirpe são comumente usados ​​como pano de fundo para a manipulação genética, e podem ser consideradas equivalentes à estirpe selvagem 8-9. </li></ol> 2. Preparação de tecidos <ol><li> Preparar 300 ml de um fluido à base de glicerol cefalorraquidiano artificial (ACSF), constituído por (em mM): 26 de NaHCO3, 11 de glucose, 250 glicerol, 2,5 de KCl, 1,2 de NaH 2 PO 4, 1,2 MgCl 2, CaCl 2 e 2,5. Antes da adição de CaCl2, de gás a solução com carbogénio (95% O 2 e 5% de CO 2) para estabelecer apPrecipitação de cálcio de 7,4 H e evitar (nebulosidade). Congelar a solução num congelador -80 ° C durante 45 min de modo a que uma suspensão de gelo é formada. </li><li> Profundamente anestesiar os ratos com cetamina (100 mg / kg) (Parnell, Alexandria, Austrália) por meio de uma injecção intra-peritoneal. </li><li> Uma vez hind-membros reflexos pitada são ratos decapitar ausentes usando tesoura de aço inoxidável afiadas e fazer uma incisão na pele sagital utilizando uma lâmina de barbear (arredondado # 22) para expor o crânio. Neste ponto e em todo passos 2,3-2,8 a calota craniana, cérebro e aparelho vestibular subjacente deve ser mantido o mais fresco possível através da aplicação regular de ACSF gelada sobre o tecido. </li><li> Usando o braço pontas de tesouras padrão normal (FST, North Vancouver, Canadá), fazer uma pequena incisão no crânio, lambda e cortar ao longo da sutura sagital. Assegure-se que o cérebro não é &quot;arrastada&quot; pela lâmina de corte durante este passo. </li><li> Retire cuidadosamente os ossos parietais de distância lateralmente e do osso occipital posteriorly usando rasa curva Pearson fórceps (FST). </li><li> Uma pequena espátula de aço inoxidável, é, então, usado para levantar cuidadosamente o cérebro a partir da superfície das fossas craniana média e posterior, e o nervo vestibulocochlea exposta (CNVIII) cortada a meio caminho entre o ouvido interno e do tronco cerebral com um par de tesouras finas íris. Cortar esse nervo minimiza tensão indevida sobre os axônios dos aferentes primários e suas conexões com as células ciliadas. </li><li> A seguir à transecção de CN VIII do cérebro é removido in toto. </li><li> O labirinto vestibular é agora claramente visível na fossa craniana média, com a cóclea apontando ântero. Rongeur cada lado do labirinto vestibular antes da excisão suavemente segurando o canal semicircular anterior e puxando lateralmente. </li><li> Mergulhe os labirintos excisadas (Figura 1), em um prato de dissecação contém a gelada, ACSF continuamente gaseados descrito na seção 2.1. Sob um microscópio estereoscópico, segure o labirinto paraa base do prato de preensão da cóclea. Use uma pinça fina para raspar no osso que recobre a ampola do canal semicircular anterior. Uma vez que um pequeno buraco no osso é conseguida começam a apertar o osso ampulífuga. O cuidado deve ser tomado para não empurrar a pinça através do osso, pois isso pode causar danos ao labirinto membranoso subjacente e epitélio sensorial. Continuar este procedimento até que tanto a anterior e condutas membranosas semicirculares horizontais adjacentes e ampolas estão expostos (Figura 2). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig1.jpg" /> Figura 1. O isolado do mouse labirinto vestibular. A. Painel esquerdo) Representação esquemática do isolado do mouse labirinto vestibular. Importantes pontos de referência para acessar o epitélio sensorial vestibular, a cóclea, anterior e horizontal canais semicirculares são laboratórioELED. Os asteriscos indicam a ampola do canal semicircular contendo o epitélio sensitivo vestibular. B. Painel) Fotomicrografia direito do labirinto vestibular isolado de um rato de 1 mês de idade. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig2.jpg" /> Figura 2. Exposição do labirinto vestibular Membranous. O osso que recobre a ampola do canal semicircular anterior e horizontal foram riscados para revelar as ampolas membranoso preto / marrom manchada e os nervos ampulares associados (CNVIII). O esquema no painel inferior mostra as estruturas da região em destaque da fotomicrografia e mostra a relação entre as condutas do canal semicircular para a ampola e CNVIII. <ol start="10"><li> Utilizando uma pinça fina, levante suavemente a ampolas e utrículo associado longe do labirinto ósseo, garantindo que a região central do ampolas (ContaIning o epitélio sensorial) não está danificado. Em alguns casos, a parte proximal da conduta membranoso semicircular pode ter de ser cortado com tesoura de íris para libertar as ampolas a partir do osso. </li><li> Transferir a tríade contendo os dois ampolas e utrículo em uma placa de Petri cheia de meio L-15 de cultura de Leibovitz (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Use uma fibra óptica para &quot;backlight&quot; do tecido. Isto permite a visualização clara da crista contendo o epitélio sensorial dentro da ampola. </li><li> Cuidadosamente fazer uma incisão na salpicado &quot;telhado&quot; do utrículo com a tesoura de íris finas. Continuar desta incisão através do telhado do anterior e, em seguida, as ampolas horizontal. Adicione a incisão o mais próximo possível da borda do epitélio sensorial quanto possível, sem contacto que (Figura 3A). Certifique-se de que não existem pedaços de membranas que recobrem o epitélio sensorial (Figura 3B) </li><li> Transferir a preparação de semi isolado intacto a uma pequena glascâmara de gravação s de fundo cheio de L-15 mídia. Pesam-se a preparação utilizando uma grelha de fibras de nylon finas garantidos a um fio de platina em forma de U achatada (Figura 3B). Idealmente, as fibras da rede não deverá sobrepor-se ao epitélio sensorial, no entanto, em alguns casos em que é necessária uma maior estabilidade, uma única fibra atravessa em epitélio sensorial talvez preferida. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig3.jpg" /> Figura 3. A preparação semi-isolado intacto do epitélio. A. Representação esquemática sensitivo vestibular da preparação semi-intactos e configuração do eléctrodo. A ampola que recobre a crista tem sido &quot;des-coberta&quot; para expor a superfície do epitélio sensorial (verde). B. Fotomicrografia da preparação semi-intacto &quot;tríade&quot; mostrando a anterior (AC) e horizontal (hc) crista (utrículo obscurecida sertraseiras ac). Note-se a fibra de nylon utilizados para garantir que a preparação da base da câmara de gravação. Barra de escala:. 100 mM C. Um eletrodo de registro posicionado em uma célula de cabelo vestibular individual. Barra de escala: 15 mM. 3. Eletrofisiologia <ol><li> Perfundir a preparação semi-intacta, com continuamente oxigenada L-15 médio. Os meios de comunicação contém um indicador de pH (vermelho de fenol), e de cor do meio devem ser monitorizados ao longo das gravações. O pH com o oxigénio deve ser 7,3-7,4 e corresponder a uma cor vermelha. </li><li> Prepare a gravação pipetas de 1,5 mm (1,19 milímetros ID) de vidro de borosilicato usando um protocolo de duas etapas (passo de calor 1: 72, e passo de calor 2: 50) em um extractor de micropipeta (Narishige, Japão, modelo PP-830) para alcançar um impedância final 3-4 mohms. </li><li> Encher a haste da pipeta com 3-4 mm de solução interno baseado em fluoreto de potássio contendo (em mM) 110 KF, 12 KCl, 27 de KOH, 1 de NaCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 1,8 MgCl2,3 D-glicose, 2 e Na-ATP, pH 7,4 com KOH. </li><li> Enrole a haste da pipeta 2-3 vezes e, tanto para baixo até a ponta quanto possível, com uma tira fina de parafilme para isolar o eléctrodo e reduzir a capacitância pipeta. </li><li> Posicione a pipeta sobre o epitélio sensorial sob a ampliação de baixa potência (5X) em um microscópio vertical (Olympus BX51). Mudar para alta potência (40x) e visualizar as células ciliadas vestibulares individuais com uma câmera CCD anexo. </li><li> Posição pipeta sobre a membrana de uma célula de cabelo visualizado (figura 3C), utilizando um micromanipulador (Sutter Instruments, Califórnia, EUA). Uma vez que o selo é conseguida gigaohm, ruptura da membrana celular, com uma pequena quantidade de pressão negativa aplicada através de uma porta de sucção no suporte da pipeta. </li><li> As gravações de fixação de tensão de células inteiras, utilizando técnicas padrão de 8-9. </li></ol> 4. Dois fótons de microscopia <ol><li> Prepara-se uma solução salina a 0,9% contendo 5 mM de verde de Oregon488 BAPTA-1 (OGB-1; sal hexapotassium; Invitrogen, Alemanha). </li><li> Enquanto ainda submerso, coloque a preparação tríade semi-intacta &quot;des-coberta&quot; em um pequeno pedaço de papel de filtro (4x4 mm, 0,8 mm de espessura; Millipore, Alemanha), garantindo que o epitélio sensorial é desobstruída de cima. </li><li> Transferir o papel de filtro e a preparação para o eléctrodo de platina de base coberto salina (7 ul) de um electroporador que consiste na combinação de um gerador de impulsos e um amplificador de banda larga e tampa com mais 5 mL de solução a 5 mM do cálcio sintético Indicador de corante verde de Oregon 488 BAPTA-1 (Figura 4). </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig4.jpg" /> Figura 4. Massa de electroporação. A. esquemática, que mostra a secção transversal da configuração de electroporação. A preparação semi-intacta (*) é colocada sobre um pedaço de papel de filtro mergulhados em cálcio dye (verde Oregon 488 BAPTA-1) ea corrente aplicada entre os dois eléctrodos de platina. Adaptado de Briggman e Euler, 2011 10. <ol start="4"><li> Traga o início platina eléctrodo paralelo com o eléctrodo de base, a uma distância de cerca de 2 mm, tendo o cuidado de não perturbar a orientação da preparação quando em contato com o Verde 488-BAPTA uma solução Oregon é feita. </li><li> Passe um pulso de corrente em breve a preparação (Parâmetros para o atual, 13 V, 10 ms de largura de pulso, freqüência de 1 Hz, 10 pulsos de onda quadrada) 10-11. </li><li> Na parte inferior de uma câmara de registo com fundo de vidro cheio com meio L-15, colocar uma pequena pincelada de óleo de silicone e a posição da preparação semi-intacto na, novamente assegurar que o epitélio sensorial está desobstruído a partir de cima. Para garantir estabilidade em toda imagem, substituir a rede de nylon sobre a preparação como descrito acima (ver ponto 2.13). </li><li> Usando um microscópio de dois fotões fazer gravações ópticas espontaneamenteactividade cálcio percutânea no epitélio sensorial (Figura 7), utilizando protocolos padrão de imagem 10-11. </li></ol>

<ol><li>Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otoferlin+is+critical+for+a+highly+sensitive+and+linear+calcium-dependent+exocytosis+at+vestibular+hair+cell+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).</li>
<li>Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).</li>
<li>Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).</li>
<li>Chatlani, S., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+from+calyx+endings+in+the+turtle+posterior+crista%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista.</a> 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).</li>
<li>Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).</li>
<li>Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vestibular+primary+afferent+activity+in+an+in+vitro+preparation+of+the+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear.</a> J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).</li>
<li>Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+accumulation+between+type+I+hair+cells+and+calyx+terminals+in+mouse+crista%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista.</a> Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).</li>
<li>Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+synaptic+transmission+differs+in+mouse+type+A+and+B+medial+vestibular+nucleus+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro.</a> J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).</li>
<li>Camp, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+glycine+receptor+function+reduces+excitability+of+mouse+medial+vestibular+nucleus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons.</a> Neuroscience. 170, 348-360 (2010).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li>
<li>Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+specificity+in+the+direction-selectivity+circuit+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina.</a> Nature. 471, 183-188 (2011).</li>
<li>Rennie, K. J., Streeter, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+currents+in+isolated+vestibular+afferent+calyx+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals.</a> J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li>
<li>Rennie, K. J., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+currents+in+isolated+vestibular+hair+cells+from+the+guinea-pig+crista+ampullaris%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris.</a> Hear. Res. 51, 279-291 (1991).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os mecanismos subjacentes a nosso senso de equilíbrio têm recebido pouca atenção em comparação com outros sistemas sensoriais, por exemplo, os sistemas visual e auditivo. Dos estudos que investigaram alterações na função vestibular ou de equilíbrio, a maioria focada em medidas comportamentais, incluindo o reflexo vestíbulo-ocular, com conhecimento incompleto dos blocos de construção fundamentais da balança as próprias células ciliadas vestibulares. Esses estudos que se concentraram nas células ciliadas têm quas...

Apesar da contribuição significativa do sistema vestibular em nossas vidas cotidianas, um claro entendimento dos processos responsáveis ​​pelo declínio observado na função vestibular com a idade são ainda imperceptíveis. Uma das razões para essa falta de conhecimento é que o declínio da função vestibular foi quase exclusivamente explorado utilizando testes comportamentais, incluindo o reflexo vestíbulo-ocular (RVO), um indicador preciso da função vestibular extrínseca, mas fornece informações limitadas sobre as mudanças de componentes intrínsecos . Este é um grande impedimento para a nossa compreensão da função das células ciliadas vestibular na saúde, doença ou envelhecimento. Embora tenha havido muitos estudos sobre as células ciliadas vestibulares individuais, uma grande lacuna tem sido o recurso a preparações de células capilares agudas, onde as células do cabelo e terminais aferentes até cálice são removidos do seu ambiente normal através de tratamento mecânico e / ou enzimático. Tais abordagens inevitably perturbar a microarquitetura delicado entre células ciliadas e cálice, e os cabelos célula e célula de apoio. Com o desenvolvimento de preparações semi-intactas 1-5, e um isolado do rato de preparação de labirinto 6, existe agora uma oportunidade de estudar as diversas formas de comunicação sináptica sob condições que se aproximam mais in vivo. Na verdade, Lim et al. (2011) mostrou diferenças marcantes nas correntes de células inteiras gravadas de tipo agudo isolado I células ciliadas vestibulares em comparação com aqueles que permaneceram incorporado dentro do neuroepithelium. Especificamente, o potássio é pensado que se acumulam no espaço intercelular, entre a célula de cabelo e cálice aferentes, e altera significativamente a resposta das células ciliadas 7. Este tipo de informações pode ser impossível de obter, sem a preparação de semi-intacta do epitélio sensitivo vestibular descrito aqui. Nós demonstramos a preparação semi-intactas do mouse crista 3E mostram resultados representativos obtidos patch-célula inteira eletrofisiologia e de imagem de cálcio de dois fótons.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Leibovitz medium L-15</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA-1-oregon verde</td><td>Invitrogen</td><td>O6806</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT </td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Leica Microsystems</td><td>A60S</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio vertical</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dois fótons</td><td>Olympus / La Vision</td><td>BX51WI / TriMScope II</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 SF Fórceps</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>FST</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>Padrão Padrão Tesoura</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>InstraTECH Conversor AD</td><td>HEKA</td><td>ITC-18</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Micromanipulador</td><td>Sutter</td><td>MP-225/M</td><td></td></tr><tr><td>amplificador multiclamp</td><td>Axon Instruments</td><td>700B</td><td></td></tr><tr><td>Software de aquisição de dados (eletrofisiologia)</td><td>Axógrafo</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imspector Software de aquisição de dados (dois fótons)</td><td>Inovação Max Planck</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

uma preparação semi-intactas isolada do rato vestibular epitélio sensorial de eletrofisiologia e de alta resolução microscopia de dois fótons

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Compreender as células ciliadas vestibulares funcionar em condições normais, ou como trauma, doenças e envelhecimento interromper esta função é um passo vital para o desenvolvimento de abordagens preventivas e / ou estratégias terapêuticas. No entanto, a maioria dos estudos com vista a função vestibular anormal não ter sido a nível celular, mas focado principalmente em ensaios comportamentais de disfunção vestibular, tais como análises de marcha e desempenho reflexo vestíbulo-ocular. Embora este trabalho rendeu dados valiosos sobre o que acontece quando as coisas dão errado, pouca informação é recolhida sobre as causas da disfunção. Dos estudos que incidem sobre os processos celulares e subcelulares que fundamentam função vestibular, a maioria têm contado com agudamente células ciliadas isoladas, desprovidas de suas conexões sinápticas e meio ambiente da célula de apoio. Por isso, um grande desafio técnico tem sido o acesso às células ciliadas vestibulares extremamente sensíveis em uma preparaçãoparação que é menos interrompido, fisiologicamente. Aqui demonstramos uma preparação semi-intactas do mouse vestibular epitélio sensorial que mantém o micro-ambiente local, incluindo células ciliadas / complexos aferentes primários.

As propriedades electrofisiológicas de células ciliadas vestibulares são dependentes da micro-arquitectura complexa dentro do qual estão incorporados 7. Figura 5 mostra que a preparação epitélio vestibular semi-intactos podem ser usados ​​para diferenciar entre células ciliadas do tipo I (Figura 5A), as células ciliadas do tipo II (Figura 5B), e o cálice aferente primário (Figura 5C), com base em condutâncias de células inteiras característic...

Análise da função das células ciliadas vestibular é complicada por sua localização profunda na parte mais difícil do crânio, no osso temporal petroso. A maioria dos estudos com células capilares funcionais têm utilizado intensamente as células ciliadas isoladas. Aqui nós descrevemos uma preparação semi-intactos do epitélio vestibular rato para estudos eletrofisiológicos e de microscopia de dois fótons.

Uma preparação semi-intactas isolada do Rato Vestibular epitélio sensorial de Eletrofisiologia e de alta resolução Microscopia de dois fótons

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

O objetivo geral deste procedimento é obter uma preparação próxima à normal do epitélio sensorial vestibular de camundongo, que possa ser utilizada para estudar os processos celulares e subcelulares fundamentais dos cabelos celulares vestibulares. Isso é realizado primeiramente isolando o labirinto vestibular ósseo da abóbada craniana. O segundo passo consiste em remover cuidadosamente com pinças finas partes do labirinto ósseo para expor o labirinto membranoso subjacente antes de removê-lo completamente de sua cápsula óssea.Em seguida, o epitélio sensorial vestibular é exposto cortando a membrana sobrejacente com tesoura fina de íris. O passo final consiste em montar a preparação do epitélio sensorial semi intacto em uma câmara com fundo de vidro e estabilizá-la com uma rede de náilon pesada. Por fim, utiliza-se a eletrofisiologia por patch clamp e a microscopia de dois fótons para caracterizar, respectivamente, as propriedades intrínsecas da membrana e o perfil de sinalização de cálcio de cada tipo de célula ciliar vestibular e/ou neurônio primário.As principais vantagens dessa técnica em comparação com métodos existentes, incluindo preparações isoladas de células ciliadas, são a manutenção da disposição das células ciliadas e seus neurônios aferentes primários em condições o mais próximas do normal possível. Isso significa que podemos realizar medições em condições quase fisiológicas e efetuar essas medições simultaneamente. A demonstração visual deste método é fundamental porque o dissecamento é muito difícil de aprender, principalmente porque o aparelho vestibular está envolto profundamente dentro do osso temporal do crânio e porque o epitélio sensorial em si é muito pequeno e facilmente danificado durante o dissecamento.Stefano DeMarco, um colega que trabalha com meu laboratório, demonstrará os procedimentos de eletroporação e de dois fótons. Após anestesiar profundamente e decapitar um camundongo C57 black six de acordo com as diretrizes institucionais e governamentais locais e expor o crânio, faça uma pequena incisão no crânio no ponto Lambda e corte ao longo da sutura sagital. Certifique-se de que o cérebro não seja arrastado pela lâmina de corte.Nesta etapa, aplique CSF A gelado ao cérebro para resfriar o tecido e, em seguida, remova cuidadosamente os ossos parietais lateralmente e o osso occipital posteriormente usando pinças Pearson de curvatura rasa; novamente, aplique CSF A gelado. Em seguida, use uma espátula pequena de aço inoxidável para levantar suavemente o cérebro da superfície das fossas cranianas média e posterior. O labirinto vestibular agora está claramente visível na fossa craniana média, com a cóclea apontando para fora.Adicione medialmente A CSF gelada e raju em ambos os lados do labirinto vestibular. Em seguida, remova cuidadosamente o labirinto vestibular segurando o canal semicircular anterior e puxando lateralmente. Mergulhe os labirintos removidos em uma placa de dissecação contendo solução gelada.Coloque continuamente gás em um LCR posicionado sob um microscópio estereoscópico. Este diagrama mostra em detalhes o labirinto excisado. Em seguida, trabalhando sob o microscópio estereoscópico, segure a cóclea com pinças finas e mantenha o labirinto apoiado no fundo do recipiente.Use uma segunda pin&ccedil;a para raspar o osso que recobre a ampola do canal semicircular anterior. Uma vez feito um pequeno orif&iacute;cio no osso, comece a remover delicadamente o osso da regi&atilde;o da ampola. Tenha cuidado para n&atilde;o empurrar a pin&ccedil;a atrav&eacute;s do osso, pois isso pode causar danos ao labirinto membran&aacute;ceo subjacente e ao ep&eacute;lio sensorial.Continue este procedimento até que as membranas e ductos semicirculares horizontais anterior e adjacente, bem como o púlo, estejam expostos conforme mostrado aqui. Agora, utilizando pinças finas, levante suavemente o púlo e o utrículo associado do labirinto ósseo, garantindo que a região central do púlo contendo o epitélio sensorial não seja danificada. Transfira o trio contendo os dois púlos e o utrículo para uma placa de Petri preenchida com meio de cultura Leibovitz L-15.Use uma fibra óptica para iluminar o tecido por trás, permitindo uma visualização clara da crista que contém o epitélio sensorial dentro do bulbo. Agora, use a tesoura fina de íris para fazer cuidadosamente uma incisão no teto pontilhado do amplo. Faça a incisão o mais próximo possível da borda do epitélio sensorial, sem tocá-lo.Como mostrado aqui, certifique-se de que não haja partes da membrana sobrepondo o epitélio sensorial. Este esquema mostra a forma do preparo final e a colocação do eletrodo de gravação. Transfira o preparo semi-intacto isolado para uma câmara de gravação pequena com fundo de vidro, preenchida com meio L-15, aplainando o preparo com uma grade de finas fibras de náilon fixadas a um fio de platina em forma de U achatado. O tecido agora está pronto para gravações eletrofisiológicas.Perfunda a preparação semi intacta com meio L 15 continuamente oxigenado. Certifique-se de que o meio permaneça vermelho para indicar um pH com oxigênio entre 7,3 e 7,4. Durante todo o procedimento, prepare pipetas de gravação a partir de tubos com 1,5 milímetro, diâmetro interno de 1,19 milímetro.Prepare o vidro de sílica utilizando um protocolo de dois passos em um puxador de micropipetas para obter uma impedância final de três a quatro mega. Preencha a haste da pipeta com três a quatro milímetros de solução interna à base de fluoreto de potássio. Em seguida, enrole a haste da pipeta duas a três vezes, o mais próximo possível da ponta, com uma tira fina de parafina para isolar o eletrodo e reduzir a capacitância da pipeta.Posicione a pipeta sobre o epitélio sensorial sob baixa ampliação de cinco vezes em um microscópio ereto. Alterne para a ampliação de 40 vezes e visualize células ciliadas vestibulares individuais com uma câmera CCD acoplada. Use o micromanipulador para posicionar a pipeta sobre a membrana de uma célula ciliada visualizada.Uma vez obtida uma selagem de giga ohm, rompa a membrana celular com uma pequena quantidade de pressão negativa aplicada por meio de uma porta de sucção no suporte da pipeta e realize gravações em regime de clamp de voltagem de célula inteira utilizando técnicas padrão de microscopia de dois fótons. Mantenha o desroofing parcialmente intacto. Prepare o espécime submerso e transfira-o para um pequeno pedaço de papel de filtro.Certifique-se de que o epitélio sensorial esteja desobstruído superiormente. Coloque o papel-filtro e a preparação sobre o eletrodo de platina inferior coberto com solução salina de um eletroporador. Posicione o eletrodo superior de platina paralelamente ao eletrodo inferior, mantendo uma distância de aproximadamente dois milímetros, tomando cuidado para não perturbar a orientação da preparação.Quando houver contato com o Oregon Green 488 bafta, uma solução é preparada conforme mostrado nesta imagem. Aplique um breve pulso de corrente na preparação. Coloque uma pequena gota de óleo de silicone no fundo de uma câmara de gravação com fundo de vidro contendo meio L-15.Em seguida, posicione novamente a preparação semientacta sobre ele, garantindo que o epitélio sensorial esteja desobstruído por cima. Para garantir estabilidade durante toda a aquisição de imagens, recoloque a grade de náilon sobre a preparação. Em seguida, utilizando o microscópio de dois fótons, realize gravações ópticas da atividade espontânea de cálcio no epitélio sensorial usando protocolos padrão de imageamento.Esta imagem mostra as correntes de célula inteira registradas de um cabelo vestibular do tipo um, caracterizadas por grandes correntes de cauda colapsantes indicadas pela seta aqui. As correntes de célula inteira foram registradas de um cabelo vestibular do tipo dois. Observe a ausência de correntes de cauda.Esta imagem mostra o registro de célula inteira de um aferente primário em calice caracterizado por correntes transitórias mediadas por sódio, conforme indicado pela seta após a despolarização a partir de um potencial de repouso negativo de menos 120 milivolts. Todas as células foram mantidas em menos 60 milivolts. Esta figura mostra as relações corrente-tensão (IV) para células ciliadas do tipo dois registradas de camundongos jovens e mais velhos em resposta ao aumento da duração da despolarização.Esses histogramas mostram a condutância média e uma razão de ativação de células ciliadas do tipo dois em camundongos jovens e idosos com base nas curvas IV de 100 milissegundos. Essas micrografias de dois fótons mostram a ativação de cálcio com BAFTA um Oregon verde em resposta ao L 15 PERFU oito no painel superior ou ao L 15 contendo 100 milimolares de cloreto de potássio no painel inferior. As setas indicam a mesma célula ciliada individual antes e depois da adição de cloreto de potássio.Este gráfico mostra o perfil de fluorescência de cálcio da célula individual indicada pela seta na imagem anterior. Esta micrografia de dois fótons do epitélio sensorial mostra a marcação com Oregon Green 488 BAP1 em células ciliadas individuais. O inseto mostra a localização subcelular de cálcio no citoplasma da célula ciliada tipo I, indicada pela seta, ou na terminação aferente primária em cálice que envolve uma célula ciliada tipo I, indicada pelas duplas setas.Uma vez dominada, a dissecação pode levar menos de 10 minutos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar o epitélio sensorial vestibular, como mantê-lo intacto e como preservar sua viabilidade para gravações eletrofisiológicas e para imagem de cálcio com dois fótons.

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Research

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Neuroscience

Neurociência

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