Name: Biossensor para detecção de bactérias Staphylococcus resistente a antibióticos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-08T09:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Aprenda a usar biossensores de fagos líticos e microbalança de cristal de quartzo para detectar e diferenciar cepas MRSA e MSSA de Staphylococcus aureus sem extração de DNA.

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O trabalho aqui relatado foi apoiada por doações da Auburn University AUDFS e USAF CRADA 07-277-60MDG-01. As opiniões expressas neste artigo são de responsabilidade dos autores e não refletem a política oficial ou a posição da Força Aérea dos EUA, Departamento de Defesa, ou do Governo dos EUA.

1. Ajustando o estágio <ol><li> Obter estirpe S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 e Bacillus subtilis ATCC 6051. Cepas resistentes à meticilina de S. aureus - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13 de MRSA 26 de MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13.882, o fago lítico 12600. </li><li> Obter anticorpos de PBP 2a de pérolas de látex conjugadas. </li><li> Prepara NZY meio como descrito 21. </li><li> Obter uma solução salina tamponada com fosfato (PBS). </li><li> Prepare água deionizada como subfase de Langmuir-Blodgett (LB) deposição monocamada. </li></ol> 2. Propagação bacteriófago e Titulação <ol><li> Incubar 5 ml de cultura de uma noite de S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10 8 unidades formadoras de colónias (CFU) / ml) com 500 ul de fagos (3 x 10 9 &lt;/ Sup&gt; UFP / ml) em 500 ml de meio NZY em 2 L em agitador Flack-incubadora a 37 ° C durante a noite. </li><li> Centrifugar cultura em 4424 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Sobrenadante re-centrifugado a 11.325 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Filtrar o sobrenadante através de um filtro Millipore de 0,22. </li><li> Centrifugar o filtrado a 75.395 g durante 1,5 horas. </li><li> Dissolve-se o pellet em 100 ul de água destilada. </li><li> Preparar diluições de 10 vezes de suspensão de fagos em meio NZY. </li><li> Placa 1 ml de cultura overnight (ON) de S. aureus ATCC 12600 em cada uma das duas placas com agar NZY para certificar-se toda a superfície é coberta. Remover o excesso de cultura e deixe seca a superfície durante 30 minutos. </li><li> Manchar uma amostra (10 ul) da diluição de fago apropriado sobre a superfície da placa e incubar a 37 ° C durante 18-24 horas. </li><li> Examinar a formação de placas e calcular o título do fago. Os títulos de bacteriófagos (t) são calculadas na base da quantidade de pLaques (N) formada por 10 mL de volume (v), da suspensão de fagos e o factor de diluição (F). O título foi calculado pela fórmula:. T = N / (VXF) Por exemplo, para o número de placas de diluição de 75 a 10 -7 e o volume de 10 ul (10 -3 x 10 ml), a titulação é igual 75 / (10 x 10 x 10 -3 -7) = 7,5 x 10 10 unidades formadoras de placas (PFU) por ml de suspensão. </li></ol> 3. O fago imobilizado e ouro <ol><li> Limpeza peças de quartzo revestidos com ouro (60 mm 2) no plasma por gravura em atmosfera de árgon durante 10 min e, em seguida esterilizar por 6 horas sob luz UV num armário estéril. </li><li> Adicionar 50 microlitros de 1 x 10 9 UFP / ml de suspensão de fago com a superfície de ouro de cada peça numa placa de Petri estéril e incubar durante a noite numa câmara húmida à temperatura ambiente. </li><li> Remover e titule a suspensão de fagos restantes. </li><li> Lave as peças com fago ligado 5 vezes com PBS para remover desacopladofago. </li></ol> 4. Ensaio de infecciosidade do fago imobilizado sobre uma superfície seca <ol><li> Espalhe uma cultura de O / N de S. Aureus ATCC 12600 em uma placa de ágar NZY e permitir secagem. </li><li> Coloque um pedaço de ouro com fago imobilizada sobre a face da placa para baixo. </li><li> Observar uma zona de lise após 12 horas de incubação a 37 ° C que indica a infectividade. </li><li> Use peças cobertas de ouro sem fago em experimentos de controle. </li></ol> 5. Testes de atividade lítica de Phage livre e ligada em líquido <ol><li> Adicionar uma cultura ON da S. aureus ATCC 12600-10 ml de NZY em cada dos quatro balões de 300 ml sidearm (6 x 10 6 CFU / mL em cada frasco). </li><li> Adicionar Em dois frascos de 2 x 10 6 PFU / ml de fago livre. </li><li> Use os outros dois frascos como controles. </li><li> Monitorizar a evoluo no tempo de S. lise celular aureus para 570 min por medição da densidade óptica (DO 600) em intervalos de 30 min para todos os frascos.</li><li> Dê uma medição final às 24 horas. </li><li> Repita os passos de 5,1-5,5, mas usar peças de ouro com fagos ligados ao invés de fagos livres, e peças de ouro sem fago em frascos de controle. </li></ol> 6. Perda de fagos ligados durante a incubação <ol><li> Adicionar 50 ul de 1 x 10 9 UFP / ml de fago na superfície do pedaço de ouro estéril numa placa de Petri que está colocado numa câmara húmida durante a noite à temperatura ambiente. </li><li> Retirar a suspensão de fagos não ligados com a superfície de ouro e titulação. </li><li> Lava-se a peça de ouro com os fagos ligados cinco vezes com PBS e coloque em 1 ml de solução de NZY em tubo de 15 ml, agitador em incubadora a 37 ° C durante 8 horas. </li><li> Determinar o título do fago isolada como descrito em 2. </li></ol> 7. Fago Spheroids Preparação <ol><li> Combinando 400 ul de estoque de fago 12600 suspensão (10 11 UFP / ml) com um volume igual de clorofórmio espectrofotométrica grau em 1 ml frascoà temperatura ambiente. </li><li> Gentilmente vórtice a suspensão de fagos-clorofórmio 5-6 vezes (intervalos de 5 seg) ao longo de um minuto de duração. </li><li> Permitiu a suspensão para estabilizar por 30 segundos e, em seguida, pipeta da fase superior contendo esferóides foi pipetado off para a preparação monocamada. </li><li> Dedique alguns microlitros da suspensão esferóides para a transmissão e microscopia eletrônica de varredura. </li><li> Use uma suspensão esferóide restante para a fabricação de biossensores. </li></ol> 8. Preparação Biosensor <ol><li> Limpe os sensores QCM-D por plasma de gravura em argônio por 10 min PDC-32G Harrick limpo plasma. </li><li> Lavar o sensor com hexano para remover as impurezas orgânicas. </li><li> Preparar e limpar a calha do saldo filme conforme descrito em 22. </li><li> Preencha através LB com uma solução subfase e limpá-lo com uma barreira de cocho e estabilizar a calha a 20 ± 0,1 ° C </li><li> Espalhe aliquota de 300 ul de fago 12600 em suspensi aquosoem (10 11 PFU / ml) na subfase LB. </li><li> Prepare monocamada fago para solução subfase LB, permitindo que 300 mL alíquota de fago suspensão aquosa 12.600 (10 11 PFU / ml) de atropelar um bastão de vidro wettable inclinado que está parcialmente submerso na subfase 22,23. </li><li> Estabilizar a monocamada preparada durante 10 minutos e, em seguida comprimi-lo a uma velocidade de 30 mm / min (45 cm 2 / min), a uma pressão constante até que 19 N / m é atingido. </li><li> Executar uma película de deposição vertical sobre o sensor posicionado perpendicular QCM-D a uma velocidade de 4,5 mm / min por meio de imersão do sensor sucessivamente dentro e fora da monocamada de sete vezes. A microscopia electrónica de depositadas monocamadas de fagos antes da exposição a bactérias amostras mostrou que as camadas eram contínuos, homogéneo e uniforme (dados não mostrados). </li><li> Repita os passos de 4,5-4,8 com uma suspensão de esferóide fago que é preparada em 3. </li><li> Use biossensores fago fabricados para detecção de MRSA, o elétronA microscopia e elipsometria. </li></ol> 9. Teste Biosensor, Discriminação de resistente à meticilina e bactérias Staphylococcus sensíveis <ol><li> Neste protocolo, biossensores com fago não modificada e modificada e esferóides fago estão preparados. Um microbalança de cristal de quartzo, com quatro câmaras de fluxo do sensor é usado para monitorar a ligação de bactérias para o fago imobilizados na superfície do sensor de QCM. PBP 2a de pérolas de látex de anticorpos conjugados são utilizados para discriminar entre resistente à meticilina (MRSA), estafilococos e bactérias sensíveis. Todas as medições são realizadas em modo de fluxo (50 ul / min) a 5 MHz. </li><li> Estabelecer uma freqüência de ressonância linha de base do sensor QCM em água (~ 30 min). </li><li> Desenhar uma suspensão das células vivas de estafilococos sensíveis à meticilina bacterianas em água (10 9 CFU / ml) através da célula de teste. </li><li> Monitorar continuamente as mudanças na freqüência de ressonância sensores e dissipação de energia para o primeiro harmônico, using o software Q-Soft. </li><li> Quando as mudanças na freqüência de ressonância sensores e dissipação atingiu níveis de saturação, adicionar a suspensão de esferas de látex PBP anticorpos conjugados (6,77 x10 10 contas / ml) para o fluxo durante o monitoramento contínuo da freqüência e dissipação. </li><li> Repita os passos de 9,2-9,5 para células de bactérias estafilococos resistentes à meticilina (MRSA). </li><li> Definir uma mudança de frequência através da variação da massa, devido à ligação de pelo Sauerbrey 24,25 equação Af =-Dm xn / C, onde C é a sensibilidade de uma massa constante (C = 17,7 ng x cm x Hz -2 -1 de 5 MHz, bactérias ), m é a massa e o símbolo n representa o número harmónico (n = 1). </li><li> Definir uma mudança de dissipação de energia (Δ D) a partir da gravação do decaimento exponencial de oscilação (frequência e amplitude de amortecimento, que permitiu a quantificação da energia dissipada e armazenadas durante um período de oscilação,E e E dissipada armazenados, respectivamente: D = E Δ dissipada / 2 πE armazenado. Δ D é medido em unidades de dissipação (DU), um DU = 10 -6 unidades relativas). </li></ol>

<ol><li>Guntupalli, R., Sorokulova, I., Krumnow, A., Pustovyy, O., Olsen, E., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optical+detection+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+using+lytic+phage+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Real-time optical detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using lytic phage probes.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 151-154 (2008).</li>
<li>Guntupalli, R., Sorokulova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+methicillin+resistant+and+sensitive+strains+of+Staphylococcus+aureus+using+tandem+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of methicillin resistant and sensitive strains of Staphylococcus aureus using tandem measurements.</a> J. Microbiol. Methods. 90, 182-191 (2012).</li>
<li>Guntupalli, R., Sorokulova, I., Long, R., Olsen, E., Neely, W., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+Langmuir+monolayers+and+Langmuir-Blodgett+films%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces%2C+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Phage Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films.</a> Colloids and Surfaces, B: Biointerfaces. 82, 182-189 (2011).</li>
<li>Barie, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-resistant+gram-positive+cocci%3A+implications+for+surgical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22World.+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-resistant gram-positive cocci: implications for surgical practice.</a> World. J. Surg. 22, 118-126 (1998).</li>
<li>Byun, D. E., Kim, S. H., Shin, J. H., Suh, S. P., Ryang, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+epidemiologic+analysis+of+Staphylococcus+aureus+isolated+from+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Korean+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular epidemiologic analysis of Staphylococcus aureus isolated from clinical specimens.</a> J. Korean Med. Sci. 12, 190-198 (1997).</li>
<li>Duan, L., Lei, H., Huang, E., Yi, G., Fan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+of+Staphylococcus+aureus+from+lower+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Yiyuanganranxue+Zazhi%22%5BJournal%5D)">Drug resistance of Staphylococcus aureus from lower respiratory tract.</a> Zhonghua Yiyuanganranxue Zazhi. 21, 1667-1668 (2011).</li>
<li>Giamarellou, H., Papapetropoulou, M., Daikos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methicillin+resistant%27+Staphylococcus+aureus+infections+during+1978-79%3A+clinical+and+bacteriologic+observations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Methicillin resistant' Staphylococcus aureus infections during 1978-79: clinical and bacteriologic observations.</a> J. Antimicrob. Chemother. 7, 649-655 (1981).</li>
<li>Knopf, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+infections+caused+by+multiresistant+pathogens.+Clinical+management+exemplified+by+multiresistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Urologe+A%22%5BJournal%5D)">Nosocomial infections caused by multiresistant pathogens. Clinical management exemplified by multiresistant Staphylococcus aureus.</a> Urologe A. 36, 248-254 (1997).</li>
<li>Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+differential+inoculum+disk+diffusion+method+and+Vitek+GPS-SA+card+for+detection+of+oxacillin-resistant+staphylococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of differential inoculum disk diffusion method and Vitek GPS-SA card for detection of oxacillin-resistant staphylococci.</a> J. Clin. Microbiol. 32, 433-436 (1994).</li>
<li>Struelens, M. J., Nonhoff, C., Van, D. A., Philippe Mertens, R., Serruys, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+rapid+ATB+Staph+for+5-hour+antimicrobial+susceptibility+testing+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of rapid ATB Staph for 5-hour antimicrobial susceptibility testing of Staphylococcus aureus.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2395-2399 (1995).</li>
<li>Woods, G. L., LaTemple, D., Cruz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+MicroScan+rapid+gram-positive+panels+for+detection+of+oxacillin-resistant+staphylococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of MicroScan rapid gram-positive panels for detection of oxacillin-resistant staphylococci.</a> J. Clin. Microbiol. 32, 1058-1059 (1994).</li>
<li>Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+BBL+crystal+MRSA+ID+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of BBL crystal MRSA ID system.</a> J. Clin. Microbiol. 32, 2588-2589 (1994).</li>
<li>Qadri, S. M., Ueno, Y., Imambaccus, H., Almodovar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+by+Crystal+MRSA+ID+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by Crystal MRSA ID System.</a> J. Clin. Microbiol. 32, 1830-1832 (1994).</li>
<li>Zambardi, G., Fleurette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+multicentre+evaluation+of+a+commercial+system+for+identification+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">European multicentre evaluation of a commercial system for identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15, 747-749 (1996).</li>
<li>Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methicillin+resistance+in+staphylococci%3A+molecular+and+biochemical+basis+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications.</a> Clin. Microbiol. Rev. 10, 781-791 (1997).</li>
<li>Brown, D. F. J., Edwards, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+laboratory+diagnosis+and+susceptibility+testing+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+%28MRSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the laboratory diagnosis and susceptibility testing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA).</a> J. Antimicrob. Chemother. 56, 1000-1018 (2005).</li>
<li>Gerberding, J. L., Miick, C., Liu, H. H., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+conventional+susceptibility+tests+with+direct+detection+of+penicillin-binding+protein+2a+in+borderline+oxacillin-resistant+strains+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+%26+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Comparison of conventional susceptibility tests with direct detection of penicillin-binding protein 2a in borderline oxacillin-resistant strains of Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 35, 2574-2579 (1991).</li>
<li>Balasubramanian, S., Sorokulova, I. B., Vodyanoy, V. J., Simonian, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lytic+phage+as+a+specific+and+selective+probe+for+detection+of+Staphylococcus+aureus-A+surface+plasmon+resonance+spectroscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Lytic phage as a specific and selective probe for detection of Staphylococcus aureus-A surface plasmon resonance spectroscopic study.</a> Biosens. Bioelectron. 22, 948-955 (2007).</li>
<li>Popham, D. L., Young, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+penicillin-binding+proteins+in+bacterial+cell+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Role of penicillin-binding proteins in bacterial cell morphogenesis.</a> Current Opinion in Microbiology. 6, 594-599 (2003).</li>
<li>Wei, Y., Havasy, T., McPherson, D. C., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+shape+determination+by+the+Bacillus+subtilis+class+B+penicillin-binding+proteins+encoded+by+pbpA+and+pbpH%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rod shape determination by the Bacillus subtilis class B penicillin-binding proteins encoded by pbpA and pbpH.</a> J. Bacteriol. 185, 4717-4726 (2003).</li>
<li>Grieco, S. H. H., Lee, S., Dunbar, W. S., MacGillivray, R. T. A., Curtis, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+filamentous+phage+yield+during+computer-controlled+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+and+Biosystems+Engineering%22%5BJournal%5D)">Maximizing filamentous phage yield during computer-controlled fermentation.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 32, 773-779 (2009).</li>
<li>Olsen, E. V., Pathirana, S. T., Samoylov, A. M., Barbaree, J. M., Chin, B. A., Neely, W. C., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+selective+biosensor+for+Salmonella+and+its+detection+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Specific and selective biosensor for Salmonella and its detection in the environment.</a> J. Microbiol. Methods. 53, 273-285 (2003).</li>
<li>Pathirana, S. T., Barbaree, J., Chin, B. A., Hartell, M. G., Neely, W. C., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+biosensor+for+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive biosensor for Salmonella.</a> Biosens. Bioelectron. 15, 135-141 (2000).</li>
<li>Sauerbrey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+quartz+oscillators+for+weighing+thin+layers+and+for+microweighing%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Phys%22%5BJournal%5D)">The use of quartz oscillators for weighing thin layers and for microweighing.</a> Z. Phys. 155, 206-222 (1959).</li>
<li>Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+Dissipation+Kinetics+for+Protein+and+Antibody-Antigen+Adsorption+under+Shear+Oscillation+on+a+Quartz+Crystal+Microbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Energy Dissipation Kinetics for Protein and Antibody-Antigen Adsorption under Shear Oscillation on a Quartz Crystal Microbalance.</a> Langmuir. 14, 729-734 (1998).</li>
<li>Griffith, J., Manning, M., Dunn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+bacteriophage+contract+into+hollow+spherical+particles+upon+exposure+to+a+chloroform-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Filamentous bacteriophage contract into hollow spherical particles upon exposure to a chloroform-water interface.</a> Cell. 23, 747-753 (1981).</li>
<li>Hosseinidoust, Z., Van de Ven, T. G. M., Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Capture+Efficiency+and+Antimicrobial+Activity+of+Phage-Functionalized+Model+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Bacterial Capture Efficiency and Antimicrobial Activity of Phage-Functionalized Model Surfaces.</a> Langmuir. 27, 5472-5480 (2011).</li>
<li>Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent%27+Reporter+Phage+for+the+Detection+of+Category+A+Bacterial+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens.</a> J. Vis. Exp. (53), e2740(2011).</li>
<li>Voinova, M. V., Jonson, M., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missing+mass%22+effect+in+biosensor%27s+QCM+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Missing mass" effect in biosensor's QCM applications.</a> Biosens. Bioelectron. 17, 835-841 (2002).</li>
<li>Gervals, L., Gel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+biotinylated+bacteriophages+on+biosensor+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators%22%5BJournal%5D)">Immobilization of biotinylated bacteriophages on biosensor surfaces.</a> Sensors and Actuators. 125, 615-621 (2007).</li>
<li>Nanduri, V., Sorokulova, I. B., Samoylov, A. M., Simonian, A. L., Petrenko, V. A., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+as+a+molecular+recognition+element+in+biosensors+immobilized+by+physical+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Phage as a molecular recognition element in biosensors immobilized by physical adsorption.</a> Biosens. Bioelectron. 22, 986-992 (2007).</li>
<li>Sorokulova, I., Watt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+biopolymer+for+preservation+of+microorganisms+during+sampling+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Natural biopolymer for preservation of microorganisms during sampling and storage.</a> J. Microbiol. Methods. 88, 140-146 (2012).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+Laboratory+Techniques%3A+Plating+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

É bem sabido que os fagos podem ser usados ​​como sondas de biossensor para 28 agentes patogénicos bacterianos. Foi demonstrado neste trabalho que, juntamente com os anticorpos de fago PBP 2a podem ser utilizadas para resolver o problema antigo: discriminação estirpes resistentes e sensíveis a antibióticos rápidos. Verificou-se no entanto os fagos não modificados estafilocócicas normais não são adequados para a detecção de bactérias com dispositivos QCM, embora elas se ligam as ba...

Cepas resistentes de Staphylococcus aureus meticilina têm sido apontados como um fator essencial nas infecções e surtos nosocomiais 4-8. Formas comuns de reconhecimento de resistência à meticilina, tais como o ensaio de difusão em disco de agar oxacilina tela ou de microdiluição em caldo, dependem das condições de cultivo adaptadas para aumentar a expressão da resistência. As alterações incluem a utilização de oxacilina, incubação a 30 ou 35 ° C em vez de 37 ° C, e a inclusão de NaCl ao meio de crescimento. Além disso, para a detecção correcta por estes tipos de técnicas, um longo período de incubação de 24 horas em vez de 16 a 18 horas é necessário. Técnicas rápidos com o nível adequado (&gt; 96%) de sensibilidade para a identificação da resistência à meticilina incluem técnicas de microdiluição automatizados tais como o GPS Vitek-SA cartão, o sistema rápido de ATB estafilococo, e o sistema de painel Microscan rápida que produzem resultados após 3-11 hr 9-11. The Crystal MA RSA é um sistema de identificação de método rápido baseado no reconhecimento de crescimento de S. aureus na presença de 2% de NaCl e 4 mg de oxacilina por litro, com um sensor de fluorescência sensíveis ao oxigénio. Sensibilidades reivindicados variam entre 91 a 100% após 4 horas de incubação 12-14. Estes métodos fenotípicos estão limitados nas suas precisões pelo impacto de estirpes prevalentes que expressam resistência heterogénea. Portanto, os métodos mais amplamente aceito para o reconhecimento da resistência à meticilina é PCR ou hibridização DNA do gene mecA 15. No entanto, esta técnica requer que o ADN purificado e é extremamente sensível a vários aditivos (impurezas), que incluem fragmentos de células 16. Além disso, estas técnicas de precisar de um tempo para executar. Estratégias para o reconhecimento do produto do gene mecA, a proteína PBP 2a, pode ser utilizado para determinar a resistência e podem ser mais fiáveis ​​em comparação com as técnicas de ensaio padrão 17. de Staphylococcus aureus, incluindo aqueles que têm resistência à meticilina 1,2,18. Neste trabalho, proposta uma nova técnica para o reconhecimento específico e detecção de MRSA, tais como o reconhecimento de bactéria juntamente com a conformação de MRSA em tempo real. Para este fim específico a S. bacteriófago aureus com um amplo espectro de hospedeiros (incluindo MRSA), combinada com o anticorpo monoclonal contra a proteína (PBP 2as) têm sido utilizados. PBP 2a é uma proteína de parede celular, e é a causa de resistividade antibiótico de MRSA. No entanto anticorpo PBP 2a não é específico para S. aureus, uma vez que algumas bactérias possuem outras proteínas de ligação aos antibióticos com similaridade de sequência com o PBP 2a 19,20. Por conseguinte, neste trabalho, S. bacteriófago aureus e anticorpos contra a proteína PBP 2a têm sido utilizados. Para ser capaz de desenvolver um biossensor para especificamente detectar e identificar SARM um dispositivo com uma acção em dois passos foi utilizado. O passo inicial usou um S. aureus bacteriófago monocamada como uma sonda de sensor, enquanto que o segundo passo de PBP 2a empregues anticorpos específicos. Portanto, o primeiro passo será reconhecer S. bactéria Staphylococcus, como o outro irá ser sensível à proteína de ligação ao antibiótico. Quando os sinais recebidos a partir de dois passos são positivas, isso indica a detecção específica de MRSA.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Phosphate tampoed salino (PBS) </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>clorofórmio de grau espectrofotométrico </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>154733</td> <td>(99,8% A.C.S.) </td></tr><tr><td>Hexano-anidro </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>29609-0</td> <td>(95%)</td></tr> <tr><td>Álcool etílico </td><td>Pharmco products Inc. Brookfield, CT</td><td>64-17-5</td><td>190 Proof</td></tr><tr> < td colspan = "4 ">Equipment</td></tr> <tr><td>PBP 2a contas de látex conjugadas com anticorpos</td><td>Denka Seiken Co., Ltd, Tóquio, Japão</td><td>O teste</td><td></td></tr> <tr><td>MRSA-ScreenS. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 e Bacillus subtilis ATCC 6051 da </td><td>American Type Culture Collection (Manassas, VA);</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; O fago lítico 12600 </td><td>A coleção de culturas da Universidade de Auburn, Auburn, AL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga </td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-90K Ultra Centrífuga</td><td></td></tr><tr><td>KSV 2200 LB equilíbrio de filme</td><td>KSV Chemicals, Finlândia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema óptico de microscópio óptico de luz </td><td>CitoViva Technology Inc., Auburn, AL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QCM-D</td><td>Q-Sense AB, V&#228; stra Fr&#246; lunda, Suécia</td><td>E4</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de varredura (SEM)</td> <td>JEOL USA Inc., Peabody, MA</td><td>JEOL-7000F SEM</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)</td> <td>JEOL USA Inc., Peabody, MA</td><td>JEOL, JEM 2010</td><td></td></tr><tr><td>Stericup, Presterilized</td><td>Millipore Corporation, Billerica, MA</td><td>SCGPU05RE</td><td>0,22 &mu; m, Membrana GP Express PLUS</td></tr><tr><td>Placa de Bioensaio</td><td>NUNC A/S, Dinamarca</td><td>240835</td><td>Dimensões(mm), 245 x 245 x 25</td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Gilson, Pipetman, França</td><td>P100, P200, P1000</td><td></td></tr><tr><td>C24 Incubadora Shaker</td><td>New Brunswick Scientific, CT</td><td>Classic C24</td><td></td></tr><tr><td>Peças de quartzo revestidas a ouro</td><td>Auburn University, AL</td><td></td><td>Placas</td></tr> <tr><td></td><td>de Petri caseirasMarca Fisher, EUA</td><td>0875713</td><td>100 mmX15 mm </td></tr><tr><td>SterilGard III Advance</td><td>The Baker Company, ME</td><td>SG403</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cultivo de cultura</td><td>Corning Incorporated, NY</td><td>4995</td><td>PYREX 250 ml Frascos Erlenmeyer </td></tr><tr><td>Espectrômetro óptico</td><td>Genesys 20. Thermo Spectronic, EUA.</td><td>4001</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de Plasma</td><td>Harrick Plasma, EUA</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de purificação de água Millipore</td><td></td><td>Direct-Q</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Ellipsometer</td><td>Accurion, EUA</td><td>nanofilm_ep3se</td><td></td></tr><tr><td>Software </td><td>Q-Sense AB, Suécia</td><td>QSoft, QTools</td><td></td></tr></tbody></table>

biossensor para detecção de bactérias staphylococcus resistente a antibióticos

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Um bacteriófago lítico estruturalmente transformadas tendo uma ampla gama de hospedeiros de estirpes de Staphylococcus aureus e uma proteína de ligação à penicilina (PBP 2A) contas de látex de anticorpos conjugados têm sido utilizados para criar um biossensor para a discriminação concebido resistente à meticilina (MRSA) e sensível (MSSA) S . espécies aureus 1,2. Os fagos foram convertidos em esferóides fago pelo contato com a interface água-clorofórmio. Fago monocamadas esferóides foram movidos para uma superfície de biosensor por Langmuir-Blodgett (LB) técnica 3. Os biossensores criados foram examinados por uma microbalança de cristal de quartzo com dissipação de rastreamento (QCM-D) para avaliar as interações bactéria-fago. Interações bactéria-esferóides levou a freqüência de ressonância reduzida e um aumento na dissipação de energia, tanto para MRSA e MSSA isolados. Após a ligação de bactérias, esses sensores têm sido ainda mais exposto ao anticorpo a proteína de ligação à penicilina esférula de látexs. Sensores analisados ​​com MRSA respondeu a PBP 2a contas de anticorpos, embora sensores inspecionados com MSSA não deu nenhuma resposta. Esta distinção experimental determina uma discriminação clara entre resistente à meticilina e S. sensível aureus. Igualmente vinculados e bacteriófagos não ligados suprimir o crescimento de bactérias nas superfícies e em suspensões de água. Uma vez fagos são transformados em esferóides, eles mantêm a sua atividade lítica forte e mostram alta capacidade de captação bacteriana. O fago e o fago esferóides pode ser utilizado para teste e de esterilização de microorganismos resistentes aos antibióticos. Outras aplicações podem incluir a utilização em terapia de bacteriófago e superfícies antimicrobianas.

O fago demonstrou atividade lítica contra todas as cepas testadas de S. aureus, incluindo as estirpes MRSA, como indicado pelo teste de mancha de fago. Tamanhos de placas geralmente variou de 5 a 15 mm. Sem atividade foi encontrada contra outras culturas-teste (Tabela 1). Um crescimento normal de S. aureus ATCC 12600 em meio NZY em agitador-incubadora a 37 ° C é mostrada na Figura 1A (uma curva marcados por círculos vazios). O número de bac...

Biossensores fagos líticos e contas de anticorpos são capazes de discriminar entre resistente à meticilina (MRSA) e bactérias estafilococos sensíveis. Os fagos foram imobilizadas por um método de Langmuir-Blodgett sobre uma superfície de um sensor de microbalança de cristal de quartzo e trabalhado como de largo espectro de estafilococos sondas. Contas de anticorpos reconhecer MRSA.

Biossensor para detecção de bactérias Staphylococcus resistente a antibióticos

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

O objetivo geral do experimento a seguir é discriminar cepas de staphylococcus aureus resistentes à meticilina, ou MRSA, e sensíveis à meticilina, ou MSSA, por meio de um bacteriófago lítico anti-modificado especialmente selecionado. Quando as bactérias se ligam às longas caudas flexíveis do bacteriófago lítico, a distância entre as células ligadas e a superfície do sensor é maior que a penetração da onda acústica do QC. Assim, o sinal do evento de ligação não é gerado.Substituir o fago intacto por esferoides resulta em fagos plenamente funcionais com caudas curtas, que se ligam às bactérias dentro da profundidade de penetração da onda acústica do cristal A-Q-C-M-D. Assim, contribuem para as alterações na frequência e na dissipação quando esteroides de fago são depositados no cristal A-Q-C-M-D e expostos à suspensão bacteriana mista, ligando-se tanto às cepas MRSA quanto às MSSA de Staphylococcus aureus, mas não a outras bactérias, separando o Staphylococcus aureus das demais bactérias na superfície do cristal. Por fim, quando são adicionadas microesferas ligadas ao anticorpo específico PPP dois A contra MRSA, um sinal é gerado na presença de cepas MRSA de Staphylococcus aureus. As

biosensor-for-detection-antibiotic-resistant-staphylococcus

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

O desenho de um esquema de fluxo de trabalho simples de um dia para diagnóstico de patógenos bacterianos permite o reconhecimento rápido de infecções da corrente sanguínea. A inclusão de oito clinicamente relevantes alvos bacterianas e os seus perfis de resistência a antibióticos oferece a percepção um clínico inicial no mesmo dia, o que pode levar a uma terapia mais adequada.

Um dia-Esquema de fluxo de trabalho para detecção de patógenos de bactérias e de resistência antimicrobiana de hemoculturas

Descreve-se um método de ensaio de sensor electroquímico para a detecção bacteriana rápida e identificação. O ensaio envolve uma matriz de sensores funcionalizada com as sondas de DNA para o RNA de captura de oligonucleótidos (rRNA) sequências específicas das espécies ribossomal. Sandwich de rRNA alvo de hibridação com a sonda de captura e uma sonda detectora de peroxidase de rábano ligada ao oligonucleótido de DNA produz uma corrente mensurável amperométrica.

Bacteriana Detecção e Identificação Utilizando sensores eletroquímicos

Fonte: Zhang, M. et al., Teste Rápido de Suscetibilidade Antimicrobiana por Imagem de Espalhamento Raman Estimulado da Incorporação de Deutério em uma única Bactéria. J. Vis. Experiência (2022)Este vídeo demonstra a aplicação da microscopia de espalhamento Raman estimulado para avaliar a suscetibilidade a antibióticos, acompanhando a atividade metabólica marcada com deutério. Ao monitorar sinais de carbono-deutério, o método permite a rápida detecção de populações bacterianas resistentes e...

Detecção da suscetibilidade a antibióticos bacterianos usando um microscópio de espalhamento Raman estimulado

Este vídeo demonstra um ensaio de biossensor condutimétrico para estudar a interação de um anticorpo com um antígeno alvo imobilizado em um chip transdutor. O biossensor é projetado para ter uma proteína quimérica bifuncional - uma enzima β-lactamase com um sítio catalítico funcional fundido a um nanocorpo para se ligar ao antígeno alvo imobilizado. Após a ligação, a hidrólise catalítica de um substrato antibiótico pela enzima β-lactamase gera um sinal elétrico - confirmando a interação...

Ensaio de biossensor condutimétrico baseado em β-lactamase para interações proteína-proteína

Um biossensor ótico sem rótulo para detecção de bactérias rápidas é introduzido. O biossensor é baseado num nanoestruturada de Si poroso, que se destina a captar directamente as células de bactérias alvo na sua superfície. Usamos os anticorpos monoclonais imobilizados, para o transdutor poroso, como as sondas de captura. Os nossos estudos demonstram a aplicabilidade destes biosensores para a detecção de concentrações baixas de bactérias dentro de minutos, sem processamento prévio da amostra...

A detecção óptica de E. coli Bactérias por mesoporosos Silicon Biossensores

Desenvolvemos uma plataforma microfluidica para testes rápidos de suscetibilidade a antibióticos. O fluido é passado em altas velocidades sobre bactérias imobilizadas na parte inferior de um canal microfluido. Na presença de estresse e antibiótico, cepas suscetíveis de bactérias morrem rapidamente. No entanto, bactérias resistentes podem sobreviver a essas condições estressantes.

Teste de suscetibilidade de antibiótico induzido por estresse em um chip

A maioria das infecções bacterianas produz um biofilme. Em virtude de seu ambiente, as bactérias associadas ao biofilme são frequentemente fenotipicamente resistentes a medicamentos. Novas moléculas antibacterianas que matam bactérias em biofilmes são, portanto, uma alta prioridade. Estabelecemos um ensaio para rastrear rapidamente compostos antimicrobianos que são eficazes na erradicação de biofilmes.

Segmentação de biofilme Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Usando resazurina Baseado Ensaio Drogas susceptibilidade

Neste trabalho, relatamos um novo método para estudar as interações da proteína-proteína usando um biossensor titulometria, baseado na tecnologia de β-lactamases de híbrido. Este método baseia-se na liberação de prótons após hidrólise da β-lactamas.

O uso de um ensaio de β-lactamase-baseado titulometria Biosensor para detectar interações biomoleculares

Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e quantificação de baixas moléculas abundantes em soluções complexas usando molecular imprinting em combinação com um biossensor de capacitância.

Detecção ultra-sensível de biomarcadores usando um Imprinting Molecular baseado Biosensor capacitivo

Gota plataformas baseadas microfluídicos são candidatos promissores para a experimentação de alto rendimento, uma vez que são capazes de gerar picolitros, auto-compartimentada vasos barata a taxas kHz. Através da integração com rápido, sensível e de alta resolução de fluorescência métodos espectroscópicos, a grande quantidade de informações geradas nesses sistemas podem ser eficientemente extraído, aproveitada e utilizada.

Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

Aprenda a usar biossensores de fagos líticos e microbalança de cristal de quartzo para detectar e diferenciar cepas MRSA e MSSA de Staphylococcus aureus sem extração de DNA.

Biossensor para detecção de bactérias Staphylococcus resistente a antibióticos

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