Biossensor para detecção de bactérias Staphylococcus resistente a antibióticos

O objetivo geral do experimento a seguir é discriminar cepas de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina ou resistentes à meticilina ou sensíveis à meticilina, ou MSSA por fagos de bactérias líticas antimodificadas especialmente selecionados. Quando as bactérias estão ligadas às longas caudas flexíveis do fago lítico, a distância entre as células anexadas e a superfície do sensor é maior do que a penetração da onda acústica do QC m. Portanto, o sinal do evento de associação não é gerado.

A substituição do fago intacto por esferóide resulta em um fago totalmente funcional com caudas curtas, que ligam as bactérias dentro da profundidade de penetração da onda acústica do QC m, contribuindo assim para as mudanças de frequência e dissipação quando os esteróides de fago são depositados no cristal A-Q-C-M-D e expostos à suspensão bacteriana mista, eles se ligam às cepas MRSA e MSSA de staphylococcus aureus, mas não outras bactérias que separam o Staphylococcus aureus das outras bactérias na superfície do cristal. Finalmente, quando o PPP específico para Mr.RSA duas esferas ligadas ao anticorpo A são adicionadas, um sinal é gerado na presença de cepas Mr.RSA de staphylococcus aureus. As principais vantagens desta técnica sobre o método existente, como a PCR, são que este método não requer extração de DNA e não é sensível a empíricos.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a triagem e desinfecção de staphylococcus orus, ele também pode ser aplicado a outras bactérias resistentes a antibióticos. A demonstração visual desse método é crítica, pois a fabricação de biossensores requer precisão, exatidão e paciência. Comece limpando as peças de quartzo codificadas em ouro por gravação a plasma em Argonne por 10 minutos e, em seguida, esterilize as peças por seis horas sob luz ultravioleta em um gabinete estéril após a esterilização em uma suspensão de 50 microlitros de fago na superfície de ouro de cada peça em uma placa de Petri estéril e, em seguida, incube as peças durante a noite em uma câmara úmida em temperatura ambiente na manhã seguinte, remova a suspensão de fago restante para titulação e, em seguida, lave cada pedaço de quartzo com fago ligado cinco vezes com PBS para remover qualquer fago não ligado.

Para testar a infecciosidade do fago imobilizado em uma superfície seca, primeiro espalhe uma cultura noturna de staphylococcus aureus em um NZY eRate e deixe a suspensão secar. Em seguida, coloque uma peça de quartzo revestida de ouro com o fago imobilizado voltado para baixo na placa. Após 12 horas a 37 graus Celsius, uma zona de lise indicando infectividade pode ser observada para testar a atividade lítica do fago livre no líquido.

Primeiro, adicione uma cultura bacteriana noturna de staphylococcus aureus a 10 mililitros de NZY em cada um dos quatro frascos de pistola de 300 mililitros. Em seguida, adicione duas vezes 10 aos seis PFU por mililitro de fago livre a dois dos frascos. Agora, monitore o curso do tempo de lise de células de estafilococos por 570 minutos por medição de densidade óptica em intervalos de 30 minutos para cada frasco fazendo uma medição final em 24 horas.

Para testar a atividade lítica do fago ligado no líquido, repita as etapas demonstradas, mas adicione pedaços de ouro com fago ligado aos frascos experimentais em vez de fago livre. Para preparar esteróides de fago, primeiro combine 400 microlitros de suspensão de fago 1 2600 com um volume igual de clorofórmio de grau fotométrico de espectro em um frasco de um mililitro à temperatura ambiente. Em seguida, subtraia suavemente a suspensão de clorofórmio do fago cinco a seis vezes em intervalos de cinco segundos durante um minuto de duração.

Depois de permitir que a suspensão se estabilize por 30 segundos, colete a fração superior contendo a suspensão esteróide. Transfira alguns microlitros da suspensão esteróide para um frasco de 500 microlitros para transmissão e microscopia eletrônica de varredura. Guarde a suspensão esteróide restante em um frasco de um mililitro para fabricação de biossensores.

Para preparar o biossensor primeiro, limpe os sensores QCMD por gravação de plasma em argônio por 10 minutos em um limpador de plasma. Em seguida, enxágue os sensores com hexano para remover quaisquer impurezas orgânicas. Em seguida, limpe uma calha da balança do filme conforme descrito anteriormente por Olson Etal no Journal of Microbiological methods.

Enchendo uma calha LB com uma solução subfásica e limpando-a com uma barreira de calha. Em seguida, estabilize o vale a 20 graus Celsius por 10 minutos. Agora crie uma monocamada de fago na solução de subfase LB pingando cuidadosamente um Eloqua de 300 microlitros de suspensão aquosa de fago 1 2600 feito uma haste de vidro comestível inclinada que é parcialmente submersa na fase SOPH Depois de permitir que a monocamada se estabilize por 10 minutos, comprima a monocamada a uma taxa de 30 milímetros por minuto até atingir uma pressão constante de 19 newtons por metro.

A deposição vertical do filme é a parte mais complicada deste procedimento. Para garantir o sucesso, é necessário certificar-se de que todos os componentes deste procedimento estão limpos e também os parâmetros de deposição monocamada devem ser otimizados. Agora mergulhe o sensor dentro e fora da monocamada sete vezes seguidas a uma taxa de 4,5 milímetros por minuto para realizar uma deposição vertical de filme.

No sensor QCMD posicionado perpendicularmente. A deposição vertical de filme liga o fago intacto à superfície do biossensor. Finalmente, use biossensores de fagos fabricados para microscopia eletrônica de detecção de MRSA e el optometria do fago livre e ligado.

Comece esta etapa estabelecendo linhas de base, frequência de ressonância e dissipação de energia do sensor QCM na água usando o software qof T. Após cerca de 30 minutos, retirar uma suspensão de células bacterianas vivas de Staphylococcus aureus ou MSSA sensíveis à meticilina em água através da célula de teste. A linha azul exibe o valor da frequência, enquanto a linha vermelha demonstra o nível de dissipação de energia.

As linhas horizontais mostram o estabelecimento da linha de base. O número dois no meio da tela indica que os eventos estão relacionados ao sensor. O número dois em cada quatro monitora continuamente as mudanças na frequência de ressonância e dissipação de energia dos sensores para o primeiro harmônico mostrado.

Aqui estão as mudanças depois que as bactérias passam na célula de teste. Observe que leva apenas alguns segundos para que a frequência diminua e a dissipação de energia aumente quando as mudanças na frequência de ressonância dos sensores e na dissipação de energia interna atingem níveis de saturação na suspensão do látex conjugado com anticorpos PVP e aceleram o fluxo e continuam o monitoramento contínuo da dissipação de frequência. Aqui é mostrado todo o processo de detecção mostrando o estabelecimento de linhas de base, a mudança de poucos segundos na frequência e dissipação de energia após a adição de bactérias, a saturação e, finalmente, as mudanças após a adição de contas.

Esta tabela mostra a atividade fálítica demonstrada contra todas as cepas testadas de S reus, incluindo cepas de MRSA, conforme indicado pelo teste do ponto do fago. Os tamanhos das placas geralmente variavam de cinco a 15 milímetros. Nenhuma atividade foi encontrada em outras culturas de teste.

Aqui, o crescimento normal de estafilococo Urus A TCC 1 2600 em meio NZ Y em uma incubadora agitadora a 37 graus Celsius é demonstrado com o número de bactérias aumentando de 3,2 vezes 10 para seis para 4,0 vezes 10 para oito UFC por mililitro. Em cerca de 24 horas, o fago imobilizado em uma superfície de ouro demonstrou uma atividade lítica semelhante à atividade do fago em suspensão. O fago imobilizado permaneceu infeccioso em uma infecção bacteriana recente, mesmo após o uso em um experimento de cultivo de 24 horas, várias lavagens e armazenamento em PBS por seis dias a quatro graus Celsius.

Nesta imagem, o lisossomo ao redor da peça de ouro pode ser observado, indicando que os fagos imobilizados são capazes de lisar células bacterianas. Portanto, conforme ilustrado aqui, a diminuição efetiva do crescimento bacteriano encontrada na co-cultura de bactérias e fagos desmobilizados é resultado da interação primária de bactérias suspensas em água e fagos ligados. Aqui, micrografias eletrônicas de transmissão e varredura do fago lítico intacto 1 2600 em uma superfície de substrato de ouro são mostradas quando a suspensão do fago é submetida ao tratamento com clorofórmio, a cauda do fago se contrai em comprimento e engrossa e a cabeça poligonal torna-se arredondada ou esteróide.

Apesar das mudanças estruturais significativas. A atividade lítica do esteróide, medida pelo número de placas, não mudou como resultado do tratamento com clorofórmio. Os sensores de QCM com fagos líticos imobilizados não mostraram mudanças significativas na frequência de ressonância ou dissipação de energia quando expostos ao MRSA, indicando que a interação do fago MRSA resultou em uma mudança de massa nominal.

De acordo com o QCM, no entanto, as micrografias eletrônicas dos biossensores pós-ensaio revelaram uma ligação bacteriana significativa na superfície do sensor. Quando as suspensões de MRSA foram injetadas na célula de fluxo com biossensores de esteróides fagos, foi observada uma diminuição substancial na frequência e um aumento na dissipação. Após interações de ligação de MRSA bacterianas de fago sphero, os sensores de ensaio foram expostos a suspensões de velocidade de látex conjugadas com anticorpos BBP dois A.

Esses biossensores de ensaio MRSA responderam às suspensões de velocidade de látex conjugadas com anticorpos BPP dois A, pois foi observada uma diminuição adicional na frequência e um aumento na dissipação. A ligação do MSA às sondas de fago e às velocidades de látex conjugadas com dois anticorpos A PPP foi confirmada usando investigações de microscopia eletrônica de varredura. Quando o biossensor de esteróides de fagos foi exposto a MSSA, uma diminuição substancial na frequência e um aumento na dissipação foram observados após interações de ligação de MSSA de esteróides de fago, os sensores de ensaio foram desafiados com suspensões de velocidade de látex conjugadas com anticorpos PPP dois A.

Inicialmente, o biossensor de ensaio MSSA mostrou curta transitoriedade de aumentos na frequência e diminuições na dissipação após alguns minutos de interações de velocidade de látex conjugado com anticorpos MSSA e PPP dois A. No entanto, a frequência retorna aos níveis de introdução de anticorpos A pós-PVP dois, mas a energia deci aumentou. A ligação de MSSA a sondas de fagos foi então analisada por microscopia eletrônica de varredura, mas nenhuma ligação entre MSSA e PPP duas velocidades de látex conjugadas com anticorpos A foi observada aqui, um perfil de espessura simétrica de elipse e um mapa de espessura 3D de fagos líticos são mostrados.

Uma linha no mapa de espessura foi desenhada para gerar o perfil de espessura. Estas últimas imagens mostram imagens representativas da câmera óptica CCD de MRSA capturadas por fagos ligados à superfície dourada do sensor A-Q-C-M-D e perfis de intensidade 3D de MRSA em substratos de vidro imobilizados por fagos a uma concentração de 10 a oito UFC por mililitro e 10 a nove UFC por mililitro. Cada círculo redondo representa uma única bactéria.

É claro que o aumento da concentração de bactérias na suspensão líquida de 10 para oito UFC por mililitro para 10 para nove UFC por mililitro resulta no aumento significativo de bactérias capturadas nos perfis de intensidade 3D. O número de picos brancos na camada superior é proporcional ao número de bactérias capturadas e, como esperado, a densidade dos picos aumenta significativamente quando a exposição bacteriana é aumentada de 10 para oito para 10 para nove UFC por mililitro. A camada inferior azul escura corresponde à camada de fago em contato com um substrato dourado.

À medida que mais bactérias são capturadas, as propriedades ópticas do fago mudam à medida que se ligam às bactérias, resultando em uma cor azul mais escura e intensa. Seguindo este procedimento, podemos definir a eficiência da captura bacteriana para entender as interações entre bactérias fagos após o desenvolvimento. Esta técnica mostra o caminho para pesquisadores no campo da terapia fágica bacteriana explorarem a inibição de patógenos em animais e humanos Não se esqueça de que trabalhar com solventes orgânicos em bactérias patogênicas pode ser extremamente perigoso, e seguir a regulamentação estrita é muito importante.