Uso de um hemacitômetro para contar células
A contagem de células é um passo importante em muitos ensaios baseados em células para determinar o número e a viabilidade da célula. Em geral, o objetivo da contagem é entender o quanto uma amostra de uma concentração celular desconhecida deve ser diluída para uso posterior. A ferramenta de laboratório mais comum para contar células é o hemacytómetro.
O hemacítmetro é uma ferramenta de contagem que foi originalmente criada para contar células sanguíneas. No centro do hemacytômetro estão duas câmaras de contagem, sobre as quais uma grade gravada a laser pode ser encontrada.
A grade é composta por 9 quadrantes principais. Os quatro quadrantes de canto são ainda divididos em 16 quadrantes menores. O quadrante central é dividido em 25 desses quadrantes menores, cada um ainda dividido em 16 micro quadrantes.
Na extremidade mais distante de cada câmara estão as portas de introdução de amostras, nas quais a amostra celular a ser contada é dispensada.
Em ambos os lados das câmaras de contagem estão os suportes de montagem de deslizamento de cobertura, sobre os quais o deslizamento de quartzo repousa, geralmente cerca de 0,1 mm acima da câmara de contagem.
Como a área de cada quadrado grande é de 1 mm2, o volume contido por cada quadrado grande é de 0,1 mm3 ou 1/10.000 de um ml.
Antes de contar, sempre tire um momento para usar etanol e um kimwipe para limpar e secar qualquer fiapo, impressões digitais ou marcas d'água da tampa e da câmara de contagem.
Em seguida, adicione cuidadosamente uma pequena quantidade de água a cada um dos suportes de montagem de deslizamento de cobertura, a tensão superficial da água manterá a mancha no lugar.
Agora, triturar suavemente a suspensão da célula, ou pipetá-la para cima e para baixo, para desalojar qualquer aglomerado de células. Use uma micropipette para aspirar cerca de 10 μl da suspensão e, em seguida, carregar uma das portas de introdução com a amostra. A solução será atraída para a câmara de contagem por ação capilar e deve cobrir toda a grade.
Enquanto as células estão se acomodando, selecione o objetivo. Em seguida, coloque o hemacytómetro no palco.
Em seguida, veja as células sob o microscópio. Se houver menos de 5 células em cada um dos grandes quadrantes, você pode precisar girar sua amostra para baixo novamente e resuspensar a pelota em um volume menor. Se as células estão se sobrepondo ou são simplesmente densas demais para distinguir facilmente umas das outras, você pode precisar diluir sua amostra em um volume maior de solução. Certifique-se de acompanhar o fator com o qual você está diluindo suas células. Você vai precisar em um cálculo posterior.
Agora é hora de contar as células!
Como falamos anteriormente, a câmara de contagem está coberta por uma grade gravada a laser. As linhas dos quadrantes facilitam o controle das células que você está contando. Escolha o quadrante de tamanho para contar dependendo da densidade das células da sua amostra. Por exemplo, se houver um baixo número de células, conte todas as células em um dos quadrantes de canto. Para amostras com uma quantidade média de células, escolha um dos 16 quadrantes menores. Se houver uma densidade muito alta de células, conte as células em um dos 25 quadrantes centrais. Não importa qual quadrante você escolha ou a densidade da amostra celular, conte pelo menos 20-50 células por quarentena.
Nem todas as células cairão perfeitamente dentro dos quadrantes. Você pode contar as células que tocam as linhas superior e esquerda, mas desconsidere as que tocam na parte inferior ou direita. Para obter a contagem mais precisa, use um contador de células para acompanhar as células e pegue a média do número de células em 4 quadrantes do mesmo tamanho.
Para calcular o número de células em um volume de 1 ml, multiplique o número de células contadas em 10.000, pois, como mencionamos antes, cada quadrado grande na grade é 1/10.000 de um ml. Se você contou um desses quadrantes maiores, basta multiplicar este número 1. Se você contou um dos quadrados menores em um dos quadrantes de canto, multiplique este número por 16. Se você contou todas as células em um dos 25 quadrantes centrais, multiplique este número por 25. Se aconteceu de você diluir sua suspensão celular antes de carregar o hemacyotmetro, você também precisará multiplicar pelo fator de diluição.
Então, para calcular o número de células em 1 ml desta amostra, multiplicaríamos as 20 células neste quadrante central por 104 e 25 para obter um total de 5 x 106 células em 1 ml da amostra.
Agora que sabemos o número total de células em 1 ml da amostra, precisamos multiplicar esse número pelo volume total de nossa solução. Então, por exemplo, se tivermos 5 x 106 células em 1 ml, então em 2 ml, teremos um total de 1 x 107 células.
Em seguida, para evitar erros de contagem incorreta, distribuição irregular de células ou erros de pipetação, carregue o outro lado da câmara e conte sua amostra celular uma segunda vez.
Contar as células sob o microscópio também é um ótimo momento para avaliar a viabilidade das células em sua amostra. O azul trypan, uma mancha vital, é frequentemente misturado com a amostra antes de ser carregado no hemacytómetro para este fim.
As células vivas excluem esse corante, porque as células vivas são muito seletivas sobre o que permitem através de suas membranas. Uma célula morta, no entanto, não tem uma membrana intacta, o que permite que o azul trypan passe e manche o citoplasma.
Para verificar a viabilidade da amostra de sua célula, dilua uma alíquota da suspensão celular em azul trypan e, em seguida, carregue a amostra manchada azul trypan como a amostra celular regular. Sob o contraste de fase, as células vivas aparecerão brilhantes e douradas e devem ser contadas; não conte nenhuma das células azuis, mortas e maçante.
Calcule o número de células como antes, desta vez multiplicando o número final pelo fator de diluição azul trypan. Então, se nossa amostra representativa original tivesse sido diluída pela primeira vez em azul trypan, então teríamos multiplicado nosso número total de células por nossa diluição azul de 1:10 trypan, para um total de 1x108 células em nossa amostra.
Quando terminar de contar, lembre-se de limpar o tapa-cobertura e a câmara de contagem!
Agora que você é um profissional de contagem de células, vamos falar sobre algumas das razões que você pode precisar para saber quantas células você tem em um experimento particular.
Depois de isolar células de um tecido normal ou experimental, é importante saber quantas células você recuperou. Aqui os investigadores vão querer saber quantos esplenócitos, ou células de baço, eles se isolaram deste baço de rato.
Quando você está realizando um experimento para ver como duas populações de células diferentes reagem, é importante saber quantos de cada tipo de célula você está misturando, como neste experimento de co-cultura com células B e T.
Você vai querer saber quantas células você tem para muitos outros tipos de ensaios baseados em células. Aqui está sendo criado um ensaio elispot para determinar o número de células em uma amostra que secretará IFNγ, uma proteína inflamatória, em resposta ao vírus do papiloma humano.
Ao realizar um experimento no qual o mRNA precisa ser extraído, ou isolado, de suas células de interesse, é importante saber quantas chamadas você está começando, a fim de adquirir uma quantidade suficiente de mRNA para o experimento.
O hemacítômetro é uma ferramenta barata e relativamente fácil de usar para contar células, mas pode ser tedioso e tem potencial para erro humano.
O Scepter Handheld Automatic Counter é, como o nome indica, um dispositivo de contagem portátil que tem uma precisão de contagem melhorada em comparação com o hemacytómetro e que pode discriminar tanto o tamanho e o volume das células em uma amostra celular.
O contador automatizado de células TC10 avalia o número da célula e a viabilidade, calcula automaticamente o número total da célula em sua amostra e permite que as células sejam visualizadas em sua tela de leitura também.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE à contagem de células. Neste vídeo revisamos: o que é um hemacytómetro, como contar células e determinar a viabilidade celular, e algumas razões diferentes que você pode precisar para contar células. Obrigado por assistir e lembre-se de não contar as células azuis!
Muitos experimentos biomédicos requerem manipulação de uma quantidade conhecida de células, a fim de alcançar dados precisos, reprodutíveis e estatist…
A contagem de células é um passo importante em muitos ensaios baseados em células para determinar o número e a viabilidade da célula. Em geral, o objetivo da contagem é entender o quanto uma amostra de uma concentração celular desconhecida deve ser diluída para uso posterior. A ferramenta de laboratório mais comum para contar células é o hemacytómetro.
O hemacítmetro é uma ferramenta de contagem que foi originalmente criada para contar células sanguíneas. No centro do hemacytômetro estão duas câmaras de contagem, sobre as quais uma grade gravada a laser pode ser encontrada.
A grade é composta por 9 quadrantes principais. Os quatro quadrantes de canto são ainda divididos em 16 quadrantes menores. O quadrante central é dividido em 25 desses quadrantes menores, cada um ainda dividido em 16 micro quadrantes.
Na extremidade mais distante de cada câmara estão as portas de introdução de amostras, nas quais a amostra celular a ser contada é dispensada.
Em ambos os lados das câmaras de contagem estão os suportes de montagem de deslizamento de cobertura, sobre os quais o deslizamento de quartzo repousa, geralmente cerca de 0,1 mm acima da câmara de contagem.
Como a área de cada quadrado grande é de 1 mm2, o volume contido por cada quadrado grande é de 0,1 mm3 ou 1/10.000 de um ml.
Antes de contar, sempre tire um momento para usar etanol e um kimwipe para limpar e secar qualquer fiapo, impressões digitais ou marcas d'água da tampa e da câmara de contagem.
Em seguida, adicione cuidadosamente uma pequena quantidade de água a cada um dos suportes de montagem de deslizamento de cobertura, a tensão superficial da água manterá a mancha no lugar.
Agora, triturar suavemente a suspensão da célula, ou pipetá-la para cima e para baixo, para desalojar qualquer aglomerado de células. Use uma micropipette para aspirar cerca de 10 μl da suspensão e, em seguida, carregar uma das portas de introdução com a amostra. A solução será atraída para a câmara de contagem por ação capilar e deve cobrir toda a grade.
Enquanto as células estão se acomodando, selecione o objetivo. Em seguida, coloque o hemacytómetro no palco.
Em seguida, veja as células sob o microscópio. Se houver menos de 5 células em cada um dos grandes quadrantes, você pode precisar girar sua amostra para baixo novamente e resuspensar a pelota em um volume menor. Se as células estão se sobrepondo ou são simplesmente densas demais para distinguir facilmente umas das outras, você pode precisar diluir sua amostra em um volume maior de solução. Certifique-se de acompanhar o fator com o qual você está diluindo suas células. Você vai precisar em um cálculo posterior.
Agora é hora de contar as células!
Como falamos anteriormente, a câmara de contagem está coberta por uma grade gravada a laser. As linhas dos quadrantes facilitam o controle das células que você está contando. Escolha o quadrante de tamanho para contar dependendo da densidade das células da sua amostra. Por exemplo, se houver um baixo número de células, conte todas as células em um dos quadrantes de canto. Para amostras com uma quantidade média de células, escolha um dos 16 quadrantes menores. Se houver uma densidade muito alta de células, conte as células em um dos 25 quadrantes centrais. Não importa qual quadrante você escolha ou a densidade da amostra celular, conte pelo menos 20-50 células por quarentena.
Nem todas as células cairão perfeitamente dentro dos quadrantes. Você pode contar as células que tocam as linhas superior e esquerda, mas desconsidere as que tocam na parte inferior ou direita. Para obter a contagem mais precisa, use um contador de células para acompanhar as células e pegue a média do número de células em 4 quadrantes do mesmo tamanho.
Para calcular o número de células em um volume de 1 ml, multiplique o número de células contadas em 10.000, pois, como mencionamos antes, cada quadrado grande na grade é 1/10.000 de um ml. Se você contou um desses quadrantes maiores, basta multiplicar este número 1. Se você contou um dos quadrados menores em um dos quadrantes de canto, multiplique este número por 16. Se você contou todas as células em um dos 25 quadrantes centrais, multiplique este número por 25. Se aconteceu de você diluir sua suspensão celular antes de carregar o hemacyotmetro, você também precisará multiplicar pelo fator de diluição.
Então, para calcular o número de células em 1 ml desta amostra, multiplicaríamos as 20 células neste quadrante central por 104 e 25 para obter um total de 5 x 106 células em 1 ml da amostra.
Agora que sabemos o número total de células em 1 ml da amostra, precisamos multiplicar esse número pelo volume total de nossa solução. Então, por exemplo, se tivermos 5 x 106 células em 1 ml, então em 2 ml, teremos um total de 1 x 107 células.
Em seguida, para evitar erros de contagem incorreta, distribuição irregular de células ou erros de pipetação, carregue o outro lado da câmara e conte sua amostra celular uma segunda vez.
Contar as células sob o microscópio também é um ótimo momento para avaliar a viabilidade das células em sua amostra. O azul trypan, uma mancha vital, é frequentemente misturado com a amostra antes de ser carregado no hemacytómetro para este fim.
As células vivas excluem esse corante, porque as células vivas são muito seletivas sobre o que permitem através de suas membranas. Uma célula morta, no entanto, não tem uma membrana intacta, o que permite que o azul trypan passe e manche o citoplasma.
Para verificar a viabilidade da amostra de sua célula, dilua uma alíquota da suspensão celular em azul trypan e, em seguida, carregue a amostra manchada azul trypan como a amostra celular regular. Sob o contraste de fase, as células vivas aparecerão brilhantes e douradas e devem ser contadas; não conte nenhuma das células azuis, mortas e maçante.
Calcule o número de células como antes, desta vez multiplicando o número final pelo fator de diluição azul trypan. Então, se nossa amostra representativa original tivesse sido diluída pela primeira vez em azul trypan, então teríamos multiplicado nosso número total de células por nossa diluição azul de 1:10 trypan, para um total de 1x108 células em nossa amostra.
Quando terminar de contar, lembre-se de limpar o tapa-cobertura e a câmara de contagem!
Agora que você é um profissional de contagem de células, vamos falar sobre algumas das razões que você pode precisar para saber quantas células você tem em um experimento particular.
Depois de isolar células de um tecido normal ou experimental, é importante saber quantas células você recuperou. Aqui os investigadores vão querer saber quantos esplenócitos, ou células de baço, eles se isolaram deste baço de rato.
Quando você está realizando um experimento para ver como duas populações de células diferentes reagem, é importante saber quantos de cada tipo de célula você está misturando, como neste experimento de co-cultura com células B e T.
Você vai querer saber quantas células você tem para muitos outros tipos de ensaios baseados em células. Aqui está sendo criado um ensaio elispot para determinar o número de células em uma amostra que secretará IFNγ, uma proteína inflamatória, em resposta ao vírus do papiloma humano.
Ao realizar um experimento no qual o mRNA precisa ser extraído, ou isolado, de suas células de interesse, é importante saber quantas chamadas você está começando, a fim de adquirir uma quantidade suficiente de mRNA para o experimento.
O hemacítômetro é uma ferramenta barata e relativamente fácil de usar para contar células, mas pode ser tedioso e tem potencial para erro humano.
O Scepter Handheld Automatic Counter é, como o nome indica, um dispositivo de contagem portátil que tem uma precisão de contagem melhorada em comparação com o hemacytómetro e que pode discriminar tanto o tamanho e o volume das células em uma amostra celular.
O contador automatizado de células TC10 avalia o número da célula e a viabilidade, calcula automaticamente o número total da célula em sua amostra e permite que as células sejam visualizadas em sua tela de leitura também.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE à contagem de células. Neste vídeo revisamos: o que é um hemacytómetro, como contar células e determinar a viabilidade celular, e algumas razões diferentes que você pode precisar para contar células. Obrigado por assistir e lembre-se de não contar as células azuis!
A contagem de células é um passo importante em muitos ensaios baseados em células para determinar o número e a viabilidade da célula. Em geral, o objetivo da contagem é entender o quanto uma amostra de uma concentração celular desconhecida deve ser diluída para uso posterior. A ferramenta de laboratório mais comum para contar células é o hemacytómetro.
O hemacítmetro é uma ferramenta de contagem que foi originalmente criada para contar células sanguíneas. No centro do hemacytômetro estão duas câmaras de contagem, sobre as quais uma grade gravada a laser pode ser encontrada.
A grade é composta por 9 quadrantes principais. Os quatro quadrantes de canto são ainda divididos em 16 quadrantes menores. O quadrante central é dividido em 25 desses quadrantes menores, cada um ainda dividido em 16 micro quadrantes.
Na extremidade mais distante de cada câmara estão as portas de introdução de amostras, nas quais a amostra celular a ser contada é dispensada.
Em ambos os lados das câmaras de contagem estão os suportes de montagem de deslizamento de cobertura, sobre os quais o deslizamento de quartzo repousa, geralmente cerca de 0,1 mm acima da câmara de contagem.
Como a área de cada quadrado grande é de 1 mm2, o volume contido por cada quadrado grande é de 0,1 mm3 ou 1/10.000 de um ml.
Antes de contar, sempre tire um momento para usar etanol e um kimwipe para limpar e secar qualquer fiapo, impressões digitais ou marcas d'água da tampa e da câmara de contagem.
Em seguida, adicione cuidadosamente uma pequena quantidade de água a cada um dos suportes de montagem de deslizamento de cobertura, a tensão superficial da água manterá a mancha no lugar.
Agora, triturar suavemente a suspensão da célula, ou pipetá-la para cima e para baixo, para desalojar qualquer aglomerado de células. Use uma micropipette para aspirar cerca de 10 μl da suspensão e, em seguida, carregar uma das portas de introdução com a amostra. A solução será atraída para a câmara de contagem por ação capilar e deve cobrir toda a grade.
Enquanto as células estão se acomodando, selecione o objetivo. Em seguida, coloque o hemacytómetro no palco.
Em seguida, veja as células sob o microscópio. Se houver menos de 5 células em cada um dos grandes quadrantes, você pode precisar girar sua amostra para baixo novamente e resuspensar a pelota em um volume menor. Se as células estão se sobrepondo ou são simplesmente densas demais para distinguir facilmente umas das outras, você pode precisar diluir sua amostra em um volume maior de solução. Certifique-se de acompanhar o fator com o qual você está diluindo suas células. Você vai precisar em um cálculo posterior.
Agora é hora de contar as células!
Como falamos anteriormente, a câmara de contagem está coberta por uma grade gravada a laser. As linhas dos quadrantes facilitam o controle das células que você está contando. Escolha o quadrante de tamanho para contar dependendo da densidade das células da sua amostra. Por exemplo, se houver um baixo número de células, conte todas as células em um dos quadrantes de canto. Para amostras com uma quantidade média de células, escolha um dos 16 quadrantes menores. Se houver uma densidade muito alta de células, conte as células em um dos 25 quadrantes centrais. Não importa qual quadrante você escolha ou a densidade da amostra celular, conte pelo menos 20-50 células por quarentena.
Nem todas as células cairão perfeitamente dentro dos quadrantes. Você pode contar as células que tocam as linhas superior e esquerda, mas desconsidere as que tocam na parte inferior ou direita. Para obter a contagem mais precisa, use um contador de células para acompanhar as células e pegue a média do número de células em 4 quadrantes do mesmo tamanho.
Para calcular o número de células em um volume de 1 ml, multiplique o número de células contadas em 10.000, pois, como mencionamos antes, cada quadrado grande na grade é 1/10.000 de um ml. Se você contou um desses quadrantes maiores, basta multiplicar este número 1. Se você contou um dos quadrados menores em um dos quadrantes de canto, multiplique este número por 16. Se você contou todas as células em um dos 25 quadrantes centrais, multiplique este número por 25. Se aconteceu de você diluir sua suspensão celular antes de carregar o hemacyotmetro, você também precisará multiplicar pelo fator de diluição.
Então, para calcular o número de células em 1 ml desta amostra, multiplicaríamos as 20 células neste quadrante central por 104 e 25 para obter um total de 5 x 106 células em 1 ml da amostra.
Agora que sabemos o número total de células em 1 ml da amostra, precisamos multiplicar esse número pelo volume total de nossa solução. Então, por exemplo, se tivermos 5 x 106 células em 1 ml, então em 2 ml, teremos um total de 1 x 107 células.
Em seguida, para evitar erros de contagem incorreta, distribuição irregular de células ou erros de pipetação, carregue o outro lado da câmara e conte sua amostra celular uma segunda vez.
Contar as células sob o microscópio também é um ótimo momento para avaliar a viabilidade das células em sua amostra. O azul trypan, uma mancha vital, é frequentemente misturado com a amostra antes de ser carregado no hemacytómetro para este fim.
As células vivas excluem esse corante, porque as células vivas são muito seletivas sobre o que permitem através de suas membranas. Uma célula morta, no entanto, não tem uma membrana intacta, o que permite que o azul trypan passe e manche o citoplasma.
Para verificar a viabilidade da amostra de sua célula, dilua uma alíquota da suspensão celular em azul trypan e, em seguida, carregue a amostra manchada azul trypan como a amostra celular regular. Sob o contraste de fase, as células vivas aparecerão brilhantes e douradas e devem ser contadas; não conte nenhuma das células azuis, mortas e maçante.
Calcule o número de células como antes, desta vez multiplicando o número final pelo fator de diluição azul trypan. Então, se nossa amostra representativa original tivesse sido diluída pela primeira vez em azul trypan, então teríamos multiplicado nosso número total de células por nossa diluição azul de 1:10 trypan, para um total de 1x108 células em nossa amostra.
Quando terminar de contar, lembre-se de limpar o tapa-cobertura e a câmara de contagem!
Agora que você é um profissional de contagem de células, vamos falar sobre algumas das razões que você pode precisar para saber quantas células você tem em um experimento particular.
Depois de isolar células de um tecido normal ou experimental, é importante saber quantas células você recuperou. Aqui os investigadores vão querer saber quantos esplenócitos, ou células de baço, eles se isolaram deste baço de rato.
Quando você está realizando um experimento para ver como duas populações de células diferentes reagem, é importante saber quantos de cada tipo de célula você está misturando, como neste experimento de co-cultura com células B e T.
Você vai querer saber quantas células você tem para muitos outros tipos de ensaios baseados em células. Aqui está sendo criado um ensaio elispot para determinar o número de células em uma amostra que secretará IFNγ, uma proteína inflamatória, em resposta ao vírus do papiloma humano.
Ao realizar um experimento no qual o mRNA precisa ser extraído, ou isolado, de suas células de interesse, é importante saber quantas chamadas você está começando, a fim de adquirir uma quantidade suficiente de mRNA para o experimento.
O hemacítômetro é uma ferramenta barata e relativamente fácil de usar para contar células, mas pode ser tedioso e tem potencial para erro humano.
O Scepter Handheld Automatic Counter é, como o nome indica, um dispositivo de contagem portátil que tem uma precisão de contagem melhorada em comparação com o hemacytómetro e que pode discriminar tanto o tamanho e o volume das células em uma amostra celular.
O contador automatizado de células TC10 avalia o número da célula e a viabilidade, calcula automaticamente o número total da célula em sua amostra e permite que as células sejam visualizadas em sua tela de leitura também.
Você acabou de assistir a introdução de JoVE à contagem de células. Neste vídeo revisamos: o que é um hemacytómetro, como contar células e determinar a viabilidade celular, e algumas razões diferentes que você pode precisar para contar células. Obrigado por assistir e lembre-se de não contar as células azuis!
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Q1: What is a hemacytometer and why is it used for cell counting?
A hemacytometer is a counting chamber with a laser-etched grid originally designed for counting blood cells. It contains two counting chambers with grids divided into quadrants of varying sizes. The tool allows researchers to count cells under a light microscope and calculate total cell concentration, making it essential for determining cell numbers in biomedical experiments requiring known cell quantities.
Q2: How is the hemacytometer grid structured for cell counting?
The hemacytometer grid consists of 9 major quadrants. The four corner quadrants are subdivided into 16 smaller quadrants each, while the central quadrant contains 25 smaller quadrants, each further divided into 16 micro-quadrants. Each large square has an area of 1 mm² and contains a volume of 0.1 mm³, or 1/10,000th of a milliliter, which is critical for calculating total cell concentration.
Q3: What preparation steps are necessary before loading cells into a hemacytometer?
Clean the coverslip and counting chamber with ethanol and a kimwipe to remove lint, fingerprints, and watermarks. Apply water to the coverslip mounting supports to hold the coverslip in place using surface tension. Gently triturate the cell suspension by pipetting up and down to dislodge cell clumps, then aspirate approximately 10 microliters and load it into an introduction port where capillary action draws the solution across the grid.
Q4: How do you choose which quadrant to count based on cell density?
Select quadrant size according to cell density: for low cell numbers, count all cells in one corner quadrant; for medium density, use one of the 16 smaller quadrants; for high density, count cells in one of the 25 central quadrants. Always count at least 20-50 cells per quadrant to ensure accuracy. Count cells touching the top and left lines but disregard those touching bottom or right lines.
Q5: How do you calculate the total number of cells in your sample?
Multiply the cell count by 10,000 (since each large square equals 1/10,000th of a milliliter). Apply a multiplication factor based on quadrant size: multiply by 1 for large quadrants, by 16 for corner quadrants, or by 25 for central quadrants. If you diluted the sample, multiply by the dilution factor. Finally, multiply by total sample volume to determine total cell number in your experimental sample.
Q6: What is trypan blue exclusion and how does it determine cell viability?
Trypan blue is a vital stain that distinguishes live from dead cells. Live cells have intact membranes and exclude the dye, appearing bright and golden under phase contrast microscopy. Dead cells lack membrane integrity, allowing trypan blue to enter and stain the cytoplasm blue. Count only live cells and multiply the final count by the trypan blue dilution factor to determine viable cell concentration in your sample.
Q7: Why is accurate cell counting important in biomedical experiments?
Accurate cell counting ensures reproducible, statistically-relevant data in cell-based assays. Researchers need precise cell numbers when isolating cells from tissue, mixing different cell populations in co-culture experiments, performing immunoassays like ELISPOT, or extracting mRNA from cells. Knowing exact cell quantities allows proper dilution and standardization of experimental conditions across replicates and supports passaging cells cell lines subculturing methods and applications.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:32
Basic Hemacytometer Components
1:49
Basic Operation of the Hemacytometer
3:26
How to Count Cells
6:21
Determining Cell Viability
7:57
Applications
9:53
Summary
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