Diferenciação de camundongos neonatos pele derivadas de células-tronco em células germinativas semelhantes
16 de julho de 2013
Nos últimos anos, a formação de células germinativas, utilizando métodos de cultura in vitro tem sido demonstrada utilizando vários tipos diferentes de células estaminais somáticas. Este artigo irá apresentar visualmente a diferenciação de células-tronco derivadas de células de rato recém-nascidos oócito-como iniciais.
O objetivo geral do seguinte experimento é formar células semelhantes a ovócitos utilizando células-tronco somáticas derivadas da pele. Isso é alcançado por meio do uso de células-tronco indiferenciadas puras derivadas da pele de camundongo recém-nascido. Como segundo passo, as células-tronco são dissociadas, o que as prepara para a diferenciação.
Em seguida, as células-tronco são semeadas em meio de diferenciação definido. Para induzir a formação de células germinativas, são obtidos resultados que demonstram a expressão de marcadores específicos de ovócitos com base na PCR em tempo real semi-quantitativa. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia reprodutiva.
Ao fornecer um sistema fechado para estudar a célula germinativa, a formação e o desenvolvimento de um eSight, todos os meios necessários para o protocolo devem ser preparados de duas a três horas antes do uso e colocados com a tampa levemente afrouxada no incubador de cultura celular onde o experimento será realizado. Os dois meios utilizados aqui são o meio de células-tronco, composto por D-M-A-M-F 12, suplementado com B 27, BFGF e EGF, e o meio de diferenciação de células germinativas, composto por M1 99 suplementado com FSH, LH, B-S-A-I-T-S, piruvato de sódio, tuin e EGF. Células-tronco isoladas de camundongo recém-nascido.
Utilizam-se filhotes para diferenciação in vitro de células germinativas no segundo ao quarto passagem. Como a eficiência de formação de células semelhantes a cítides ou OLC está diretamente relacionada à qualidade das células-tronco iniciais, é preferível iniciar a diferenciação assim que a população parecer limpa e saudável, o que geralmente ocorre por volta da passagem 2. 48 horas antes de iniciar a diferenciação, subcultive as células-tronco usando uma pipeta serológica, remova todos os agregados celulares esféricos suspensos e o meio gasto da placa de cultura e transfira para um tubo de 15 mililitros. É importante coletar apenas os agregados esféricos suspensos de células e não as células aderidas ao fundo da placa que estão se diferenciando espontaneamente.
Centrifugue as células a 500 vezes G durante cinco minutos, descarte o sobrenadante e re-suspenda as células em 500 microlitros de meio fresco para células-tronco. Aqueça a 37 graus Celsius. Pipete suavemente os agregados para dissociar parcialmente as células.
Não pipete as células de forma agressiva, pois isso reduzirá a viabilidade celular. Lave as células parcialmente dissociadas em 9,5 mililitros de meio fresco de células-tronco pré-aquecido em uma placa de cultura celular de 10 centímetros com superfície de baixa adesão. Retorne as células a uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius com 5% de CO₂ por 48 horas.
Para iniciar o procedimento de diferenciação de OLC, utilize uma pipeta serológica para remover as células-tronco da placa de cultura e coloque-as em um tubo de 15 mililitros. Deixe para trás quaisquer células aderidas. Peliculize as células a 500 vezes G durante cinco minutos, descarte o sobrenadante e re-suspenda as células em 500 microlitros de PBS estéril, pipetando vigorosamente as células com uma ponteira larga de 1000 microlitros em agregados, não maiores que 10 a 20 células.
Para o sucesso deste protocolo, é fundamental verificar regularmente o nível de dissociação para garantir que o nível adequado seja obtido durante a dissociação. Periodicamente, remova uma pequena quantidade de células e examine-as ao microscópio de luz branca para confirmar que as células agregadas estejam em grupos de 10 a 20 células individuais. Não dissocie excessivamente as células, pois isso resultará em viabilidade celular reduzida.
Em seguida, adicione 9,5 mililitros de PBS às células dissociadas e transfira 15 microlitros dessa suspensão celular para um hemocitômetro para contagem celular. Pelize as células a 500 × g durante cinco minutos. Após descartar o sobrenadante, re-suspenda as células no meio de diferenciação, até uma concentração de 1,32 × 10⁶ células por mililitro.
Plaque as células adicionando 500 microlitros por poço em uma placa de suspensão de fundo plano com 24 poços. Coloque a placa de 24 poços em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius em 5% de CO₂ por 48 horas. Após 48 horas, remova 250 microlitros de meio de cada poço e transfira para um tubo de 1,5 mililitro correspondente devidamente rotulado.
Adicione 250 microlitros de meio de diferenciação fresco a cada poço. Centrifugue o meio usado a 500 vezes G durante cinco minutos, descarte o sobrenadante e re-suspenda quaisquer células em pellet em 50 microlitros de meio de diferenciação fresco. Retorne a suspensão celular ao poço correspondente na placa de diferenciação. A cada 48 horas, até o dia 12 da diferenciação, troque metade do meio da mesma maneira.
Durante a diferenciação em estágios iniciais, as células aderem ao fundo da placa de cultura e se espalham. Esta imagem representativa mostra células entre 42 e 72 horas após o início da diferenciação, positivas para OCT4. Um marcador para células-tronco indiferenciadas é indicado em verde; os núcleos foram contra-coloridos com hematoxilina e aparecem em azul.
À medida que a diferenciação progride, alguns agregados celulares serão observados com células positivas para OCT quatro marcadas em verde, cercadas por células negativas para OCT quatro. A barra de escala desta imagem é de 100 micrômetros. Esta figura mostra uma imagem em luz branca de uma estrutura semelhante a um folículo após a liberação da superfície de cultivo, sendo que a barra de escala representa 40 micrômetros.
Com a cultura contínua, o LCS crescerá até atingir cerca de 45 mícrons de diâmetro. A barra de escala nesta imagem representa 10 mícrons. Grandes LCS positivos para OCT4 podem ser observados, envoltos por células ou isoladamente na cultura.
Essas LCS podem ser coletadas com células de suporte ou olhos de tripsina para obter LCS sem outras células aderidas. Para confirmar que as LCS expressavam transcritos semelhantes aos dos sítios ol naturais, as LCS foram coletadas e testadas quanto à expressão de marcadores comuns de sítios OO, como Z-P-C-S-C-P três CMOs, T quatro BMP 15 e vasa. Esta figura mostra os níveis de transcritos desses marcadores em 10 LCS em relação a 10 cítos de camundongos recém-nascidos.
Os resultados mostram que os LCS expressam menos ZPC do que os citos. Como a ZPC é um componente da estrutura da membrana zop lucidum específica dos CITOS, isso pode explicar a natureza frágil e a membrana zita mais fina dos LCS. A expressão da meiose SCP três é maior nos LCS quando comparada aos citos naturais.
No entanto, um marcador diferente de meiose, CMOs, é expresso em um nível mais baixo. Essa discrepância nos níveis de expressão pode explicar parcialmente a falha atual do LCS em completar a meiose. Outros marcadores, como BMP 15 e vasa, não apresentam diferenças significativas entre os sítios lcs e O.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a saúde da população inicial de células-tronco é fundamental para o seu sucesso.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para gerar células semelhantes a ovócitos a partir de células-tronco somáticas derivadas da pele de camundongos recém-nascidos. O processo envolve a dissociação das células-tronco e o cultivo em um meio de diferenciação definido para induzir a formação de células germinativas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Reprodutiva
- Pesquisa em Células-Tronco
- Diferenciação Celular
Antecedentes
- A formação de células germinativas é fundamental para compreender a reprodução.
- Os métodos de cultura in vitro aprimoraram o estudo da diferenciação das células germinativas.
- As células-tronco somáticas oferecem uma fonte potencial para gerar células germinativas.
- As células-tronco derivadas de camundongos recém-nascidos fornecem um modelo para pesquisa.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para formar células semelhantes a ovócitos.
- Explorar o potencial de diferenciação de células-tronco derivadas da pele somáticas.
- Investigar a expressão de marcadores específicos de ovócito.
Métodos Utilizados
- Isolamento de células-tronco indiferenciadas da pele de camundongos recém-nascidos.
- Dissociação das células-tronco para preparação da diferenciação.
- Plaqueamento das células-tronco em meio de diferenciação definido.
- Avaliação da formação de células germinativas por meio de PCR em tempo real semi-quantitativa.
Resultados Principais
- Diferenciação bem-sucedida de células-tronco em células semelhantes a ovócitos.
- Expressão de marcadores específicos de ovócitos confirmada por meio de PCR.
- Os achados contribuem para a compreensão da biologia reprodutiva.
- A metodologia fornece uma estrutura para pesquisas futuras na formação de células germinativas.
Conclusões
- O estudo demonstra o potencial das células-tronco somáticas na pesquisa de células germinativas.
- Os resultados indicam um caminho viável para a geração de células semelhantes a ovócitos in vitro.
- Esta pesquisa pode ajudar a responder questões fundamentais na biologia reprodutiva.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estabelecimento de modelos in vitro confiáveis de formação de células germinativas resolve um gargalo crítico na pesquisa em biologia reprodutiva, onde o acesso limitado a células germinativas primárias dificulta estudos mecanicistas. Este sistema derivado de células-tronco somáticas permite a geração escalonável de células semelhantes a ovócitos para validação de alvos e desenvolvimento de ensaios na descoberta de fármacos relacionados à fertilidade. Ao fornecer uma plataforma definida e reprodutível, ele apóia a redução de riscos em estágios iniciais de hipóteses terapêuticas que visam vias de gametogênese.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação das vias de diferenciação das células germinativas utilizando células-tronco somáticas como um modelo acessível para testes de hipóteses específicas.
- Valor Operacional: Fornece uma fonte renovável de células semelhantes a ovócitos que expressam marcadores-chave (Oct4, Vasa, Bmp15, Scp3) para ensaios consistentes de interação com alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Apoia a preparação de células germinativas diferenciadas semelhantes às células germinativas para triagem de compostos que afetam a progressão meiótica ou a maturação do ovócito.
- Valor Operacional: Gera saídas quantificáveis por meio de PCR em tempo real semi-quantitativa para expressão de marcadores, permitindo fluxos de trabalho de resposta à dose e confirmação de hits.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Oferece um sistema relevante para a doença para estudar mecanismos de formação inicial de células germinativas, contribuindo para a descoberta de biomarcadores de distúrbios da fertilidade.
- Valor Operacional: Facilita a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, fornecendo um resultado padronizado de diferenciação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta, desde a identificação do alvo até a otimização do composto líder, especialmente para terapêuticas do trato reprodutivo nas quais a funcionalidade das células germinativas é um desfecho fenotípico fundamental.
- Biologia da Descoberta: Apoia a desmistificação mecanicista ao permitir a validação funcional de alvos envolvidos na especificação das células germinativas e na entrada na meiose.
- Triagem: Gera células prontas para ensaio com estados de diferenciação definidos, para avaliação dos efeitos de compostos na formação de células semelhantes a germinativas.
- Análises: Fornece dados quantitativos de expressão de marcadores (por meio de PCR) que permitem a comparação entre condições experimentais e a avaliação da eficiência de diferenciação.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio da expressão de marcadores específicos de ovócitos alinhados às vias naturais de gametogênese.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma de diferenciação reutilizável, aplicável em múltiplos projetos direcionados a vias de biologia reprodutiva.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao fornecer um substituto relevante para humanos no desenvolvimento precoce de células germinativas.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de dissociação, semeadura e troca de meio.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de avanço ou interrupção ao permitir a avaliação precoce dos efeitos de compostos nas trajetórias de diferenciação de células germinativas.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos relacionados à fertilidade com base na redução de riscos mecanicistas em um sistema modelo validado.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em técnicas de cultivo de células-tronco e diferenciação de células germinativas.
- Depende do acesso a incubadoras de cultivo celular, centrífugas e equipamentos de PCR em tempo real para análise de marcadores.
- Necessita padronização da qualidade inicial das células-tronco e do número de passagens para garantir eficiência consistente na diferenciação.
- Envolve considerações de otimização ao adaptar o protocolo para outras fontes de células-tronco somáticas.
- Limitado pela ineficiência atual na produção de células semelhantes a ovócitos e pela incapacidade de suportar a maturação meiótica completa, o que pode restringir a aplicabilidade em estágios avançados.
