Name: Diferenciação de camundongos neonatos pele derivadas de células-tronco em células germinativas semelhantes In vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprenda a diferenciar células-tronco da pele de camundongos recém-nascidos em células germinativas semelhantes a oócitos in vitro. Este método utiliza PCR em tempo real semi-quantitativo para avaliar marcadores específicos de oócitos.

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PWD é apoiado por um Canadian Institutes of Health Research comunhão (CIHR) e uma bolsa CIHR para Gerald M. Kidder na Universidade Ocidental. O autor também gostaria de reconhecer Julang Li, da Universidade de Guelph para obter ajuda com o desenvolvimento do protocolo apresentado aqui.

1. Preparação de Mídia <ol><li> Prepare a mídia de 2-3 horas antes do uso e lugar com uma tampa solta na cultura de células incubadora onde o experimento será ocorrendo. Meios utilizados no presente protocolo: <ol><li> Prepare a haste meio celular que consiste em DMEM/F12 suplementado com 1 x B27, 40 ng / ml de bFGF, e 20 ng / ml de EGF. </li><li> Prepara meio de diferenciação das células germinativas que consiste em M199 suplementado com 0,05 UI de FSH, LH 0,03 UI, 3 mg / ml de BSA, 5 ul / ml ITS, 0,23 mM de piruvato de sódio, 1 mg / ml de fetuina e 1 ng / ml de EGF. Um meio de base consistindo de todos os aditivos, mas omitindo a FSH, LH e EGF podem ser preparadas e armazenadas a 4 ° C durante até uma semana. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de células-tronco Cultura <ol><li> Isolar células-tronco de filhotes recém-nascidos de rato, como descrito anteriormente 12. Utilizar células-tronco no trecho 2-4 na diferenciação de células germinativas in vitro. A eficiênciaFormação OLC está directamente relacionada com a qualidade das células estaminais iniciais. É melhor iniciar a diferenciação assim como a população aparece limpo e saudável, que é geralmente de cerca de passagem 2. Além disso a cultura de células-tronco passado passagem 2 afeta negativamente a eficiência de formação OLC (resultados não publicados). </li><li> 48 h antes do início da diferenciação sub-cultura das células estaminais. Remova todos os agregados suspensos esféricas celulares e mídia passou da placa de cultura, com uma pipeta sorológica, e coloque em um tubo de 15 ml. É importante recolher apenas os agregados esféricos em suspensão de células e as células não ligadas à parte inferior da cápsula que são espontaneamente diferenciador. </li><li> Agregar as células a 500 xg durante 5 min., Rejeitar o sobrenadante e ressuspender em 500 ul de meio de células estaminais fresco aquecido a 37 ° C. Pipeta suavemente os agregados para se dissociam parcialmente as células. Não pipetar agressivamente o celulars como isso vai reduzir a viabilidade das células. Lave as células parcialmente dissociadas em 9,5 ml de meio de células-tronco pré-aquecido fresco em um anexo de 10 centímetros prato baixa cultura de células. </li><li> Retorno as células a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora de cultura de células durante 48 horas antes do início da diferenciação. </li></ol> 3. Diferenciação OLC <ol><li> Usando uma pipeta sorológica remover as células-tronco a partir da placa de cultura e colocar em um tubo de 15 ml, deixar para trás as células anexados. Agregar as células a 500 xg e ressuspender em 500 ul de PBS estéril. Pipeta vigorosa as células usando uma ampla suportou 1.000 ponta mL em pedaços não maiores que 10-20 células. Periodicamente, remover uma pequena quantidade de células, durante a dissociação, e vá sob um microscópio de luz branca para confirmar as células estão em agregados aglomerados de 10-20 células individuais. Mais de dissociação irá resultar na redução da viabilidade das células. </li><li> Adicionar 9,5 ml de PBS às células dissociadas e adicionar 15 ul desta suspensão de células com um hemocitómetro para contagem das células. Agregar as células a 500 xg durante 5 min. </li><li> Re-suspender as células a uma concentração de 1.32X10 6 células / ml em meio de diferenciação. </li><li> Placa as células por adição de 500 ul por cavidade em um fundo plano de 24 poços prato suspensão. </li><li> Colocar o bem prato 24 numa incubadora de cultura de células a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 48 horas. Remover 250 mL meio de cada poço e colocar em um tubo ml correspondentemente rotulado 1.5. Adicionar 250 ul de meio de diferenciação fresco a cada poço. Centrifuga-se o meio consumido a 500 xg durante 5 min. e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células peletizadas em 50 ul de meio de diferenciação fresco e retornar para a cultura correspondente poço na placa de diferenciação. </li><li> Cada 48 horas mudar metade do médio até ao dia 12 de diferenciação. </li></ol>

<ol><li>van den Hurk, R., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+mammalian+oocytes+and+their+growth%2C+differentiation+and+maturation+within+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles.</a> Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).</li>
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<li>Song, S. H., Kumar, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+porcine+multipotent+stem%2Fstromal+cells+derived+from+skin%2C+adipose%2C+and+ovarian+tissues+and+their+differentiation+in+vitro+into+putative+oocyte-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells.</a> Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).</li>
<li>Dyce, P. W., Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+germ+line+potential+of+stem+cells+derived+from+newborn+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin.</a> PLoS One. 6, e20339(2011).</li>
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<li>Hayashi, K., Ogushi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Offspring+from+Oocytes+Derived+from+in+Vitro+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice.</a> Science. , (2012).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Até à data OLCS funcionais não têm sido completamente desenvolvida usando um ensaio in vitro. Recentemente, um estudo realizado por Hayashi et al. Foi capaz de produzir descendência de PGC-como células formadas in vitro e in vivo, transferido para o desenvolvimento adicional 14. Começando com células-tronco embrionárias ou células pluripotentes induzidas foram capazes de formar PGC como células que, quando recuperado após transplante in vivo foi capaz de ser matura...

Durante a embriogénese precoce, gametogénese ocorre através de uma série de fases, incluindo células germinativas primordiais (PGC), a formação, a migração, e, finalmente, a colonização das cristas das gónadas. Durante este tempo, PGCs sofrer proliferação e diferenciação em cada vez mais maduras gametas 1. O facto de PGCs migrar a partir da base do alantóide no intestino posterior do embrião e, finalmente, ao longo da parede dorsal, eventualmente colonizar as cristas das gónadas que os torna extremamente difíceis de estudar 2. Apesar dos avanços na área, estudos que tentam compreender a formação e diferenciação PGC foram impedidos pelo seu número limitado, localização e natureza migratória 3,4. Nos últimos anos, as células estaminais embrionárias demonstraram ter o potencial para formar células germinativas, in vitro 5,6. Da mesma forma, várias células estaminais somáticas também demonstraram ter o potencial para formar células germinativas exerdevido cultivo in vitro 7-11. Recentemente células-tronco isoladas a partir da pele do rato recém-nascido foram diferenciadas in vitro em células de germes como e ovócitos em estágio inicial 12. Durante a diferenciação do subconjunto das células estaminais que expressam Oct4 aumentada e estruturas que se assemelham complexos cumulus-oócitos foram formados. Os ovócitos do tipo células (OLCS) podem ser colhidos a partir das culturas e comparados com oócitos naturais. Usando este método de medição cultura OLCS 40-45 mM são obtidos que os marcadores semelhantes expresso para oócitos como Gdf9b, VASA e DAZL. Até à data, os OLCS resultantes permanecem incapaz de ser fertilizado ou amadurecer 12. Embora os OLCS permanecem incapazes de funcionar o protocolo utilizado para formar estas OLCS ainda pode ter utilidade como um ensaio para o estudo da formação e desenvolvimento de células germinativas fase anterior num sistema in vitro fechado. A publicação original discutir a formação de OLCS de tãoAs células estaminais matic utilizada pele de porco fetal como fonte de células-tronco 8. Expandindo que o estudo das células, como PGC-formados cedo durante a diferenciação induzida mostraram ser os precursores da OLCS e expressar tais marcadores PGC como OCT4, VASA, STELLA, C-KIT, e DAZL 13. Estes dados apoiam a possibilidade de se utilizar este sistema para estudar a formação de células de gérmen e diferenciação in vitro. O protocolo utilizado para formar OLCS pele de rato recém-nascido será demonstrado neste artigo de vídeo. Este protocolo apresenta um modelo in vitro para estudar o desenvolvimento de células germinativas, que podem fornecer um meio para elucidar factores importantes para a sua proliferação e diferenciação.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12500</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0266</td><td></td></tr><tr><td>ITS</td><td>Invitrogen</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-6003</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Fetuin</td><td>Sigma</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sioux Biochemicals</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>LH</td><td>Sioux Biochemicals</td><td>925</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Invitrogen</td><td>31100-035</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 poços</td><td>Nunc</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 10 cm</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubos</td><td>BD</td><td>352095</td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciação de camundongos neonatos pele derivadas de células-tronco em células germinativas semelhantes<em&gt; in vitro</em

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Estudar a formação de células germinativas e diferenciação tem sido tradicionalmente muito difícil devido ao número de células de baixa e sua localização no fundo de embriões em desenvolvimento. A disponibilidade de uma &quot;fechada&quot; no sistema baseado em vitro pode se mostrar valiosa para a nossa compreensão de gametogênese. A formação de ovócitos-como células (OLCS) a partir de células-tronco somáticas, isoladas a partir da pele do rato recém-nascido, tem sido demonstrada e pode ser visualizado neste protocolo vídeo. Os OLCS resultantes expressam diversos marcadores consistentes com oócitos como Oct4 Vasa, BMP15, e Scp3. No entanto, continuam a ser incapazes de sofrer maturação ou fertilização, devido a uma falha de completar a meiose. Este protocolo irá proporcionar um sistema que seja útil para estudar a formação de fase precoce e de diferenciação das células germinativas em gametas mais maduros. Durante a diferenciação precoce, o número de células que expressam Oct4 (potenciais células germinativas e similares) atinge a 5%, no entanto o momento de formação de OLCS permanece relativamente ineficiente. O protocolo é relativamente simples que devem ser tomados cuidados especiais para assegurar a população de células de partida é saudável e em uma passagem antecipada.

Inicialmente as células anexar à cultura prato fundo e se espalhar. Às 42-72 horas em diferenciação suspensos oct4 células positivas pequenas formam e proliferam (Figura 1A). Pouco depois da visualização destas células a maioria vão desaparecer e as células ligadas irá formar agregados de colónias densas na parte inferior da cultura. Após alguns dias, estes agregados irá separar da superfície da cultura. Em alguns destes agregados de uma grande célula pode ser observado (Figura 1B e <st...

Nos últimos anos, a formação de células germinativas, utilizando métodos de cultura in vitro tem sido demonstrada utilizando vários tipos diferentes de células estaminais somáticas. Este artigo irá apresentar visualmente a diferenciação de células-tronco derivadas de células de rato recém-nascidos oócito-como iniciais.

Diferenciação de camundongos neonatos pele derivadas de células-tronco em células germinativas semelhantes<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

O objetivo geral do seguinte experimento é formar células semelhantes a ovócitos utilizando células-tronco somáticas derivadas da pele. Isso é alcançado por meio do uso de células-tronco indiferenciadas puras derivadas da pele de camundongo recém-nascido. Como segundo passo, as células-tronco são dissociadas, o que as prepara para a diferenciação.Em seguida, as células-tronco são semeadas em meio de diferenciação definido. Para induzir a formação de células germinativas, são obtidos resultados que demonstram a expressão de marcadores específicos de ovócitos com base na PCR em tempo real semi-quantitativa. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia reprodutiva.Ao fornecer um sistema fechado para estudar a célula germinativa, a formação e o desenvolvimento de um eSight, todos os meios necessários para o protocolo devem ser preparados de duas a três horas antes do uso e colocados com a tampa levemente afrouxada no incubador de cultura celular onde o experimento será realizado. Os dois meios utilizados aqui são o meio de células-tronco, composto por D-M-A-M-F 12, suplementado com B 27, BFGF e EGF, e o meio de diferenciação de células germinativas, co

differentiation-newborn-mouse-skin-derived-stem-cells-into-germ-like

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A capacidade de células germinais embrionárias de se diferenciarem em células germinativas primordiais durante estágios iniciais de desenvolvimento é um modelo perfeito para abordar nossa hipótese sobre o câncer e infertilidade. Este protocolo mostra como isolar células germinativas primordiais das gônadas em desenvolvimento 10,5-11,5 dias após a embriões de camundongos coitum.

Isolamento e derivação de células embrionárias de rato Germinal

Este vídeo demonstra um método para a geração in vitro de células progenitoras neurais (NPCs) a partir de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs). As mESCs são cultivadas em suspensão para formar corpos embrióides (EBs), que são então guiados para se diferenciar em NPCs por meio de tratamento com ácido retinóico em uma cultura aderente.

Uma técnica para gerar células progenitoras neurais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos

Descrevemos a dissecção e ex vivo cultura de rato pele embrionária. O sistema mantém uma cultura de interface ar-líquido através da superfície do tecido e permite imagens em um microscópio invertido. Melanoblastos, um componente da pele em desenvolvimento, são marcadas por fluorescência, permitindo o seu comportamento a ser observada por meio de microscopia confocal.

Ex vivo Cultura do Rato Embryonic pele e Live-imaging de Migração melanoblasto

Este protocolo descreve em detalhes o método para gerar progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias usando um método de monocamada sem soro. Esses progenitores podem ser usados para derivar tipos de células neurais maduras ou para estudar o processo de especificação neural e são passíveis de escalonamento de formato multipoço para triagem de compostos.

Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

Os queratinócitos epidérmicos formam uma barreira funcional da pele e são posicionados na linha de frente da defesa do hospedeiro contra insultos ambientais externos. Aqui descrevemos métodos para isolamento e cultura primária de queratinócitos epidérmicos de pele de rato neonatal e adulta e indução de diferenciação terminal e resposta inflamatória desencadeada por UVB de queratinócitos.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

Este artigo descreve um protocolo para eficientemente derivar e cultura linhas de células-tronco pluripotentes de embriões de rato no estágio de blastocisto.

Derivação das linhas de células-tronco de embriões pré-implantação do rato

Este protocolo descreve um método para gerar progenitores interneurônio cortical e pós mitóticas interneurônio precursores de células-tronco embrionárias rato usando um método modificado de corpo-a-monocamada do embryoid. Estes precursores/progenitores pode ser usado em vitro fluorescente classificada e transplantado para o neocórtex neonatal para estudar a determinação do destino ou usado em aplicações terapêuticas.

Diferenciação de células estaminais embrionárias de rato em Cortical interneurônio precursores

O objetivo deste protocolo é isolar os queratinócitos epidérmicos da pele dorsal de camundongos adultos para uma variedade de aplicações a jusante, como biologia molecular, bioquímica, triagem de células ativadas por fluorescência e usos primários in vitro (por exemplo, clonogênicos queratinócitos).

Isolamento dos keratinócitos epidérmicos do camundongo e sua cultura Clonogênica in vitro

Aqui, estabelecemos um método de baixo custo e fácil de operar que direciona a diferenciação rápida e eficiente das células-tronco embrionárias para os neurônios. Este método é adequado para popularização entre laboratórios e pode ser uma ferramenta útil para a pesquisa neurológica.

Diferenciação neuronal de células-tronco embrionárias do rato in vitro

Descrevemos o procedimento para a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias do rato em células neuronais usando o método de queda de suspensão. Além disso, realizamos uma análise fenotípica abrangente através do RT-qPCR, imunofluorescência, RNA-seq e citometria de fluxo.

Diferenciação e caracterização de progenitores neurais e neurônios de células-tronco embrionárias do rato

Este relatório descreve um protocolo para o isolamento simultâneo de preadipócitos primários marrons e brancos de camundongos recém-nascidos. Células isoladas podem ser cultivadas na cultura e induzidas a se diferenciar em adipócitos brancos e marrons totalmente maduros. O método permite a caracterização genética, molecular e funcional das células de gordura primárias na cultura.

Isolamento e diferenciação de preadipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos

Aprenda a diferenciar células-tronco da pele de camundongos recém-nascidos em células germinativas semelhantes a oócitos in vitro. Este método utiliza PCR em tempo real semi-quantitativo para avaliar marcadores específicos de oócitos.

Diferenciação de camundongos neonatos pele derivadas de células-tronco em células germinativas semelhantes

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