Name: Metabólica Rotulagem de Leucina rico Repita Kinases 1 e 2 com Radioactive Fosfato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda a rotular metabolicamente as quinases LRRK1 e LRRK2 com fosfato radioativo para quantificar níveis celulares de fosforilação total. Este método utiliza fósforo-32 em células HEK293T e permite análises sem anticorpos fosfo-específicos.

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Também somos gratos à Fundação Michael J. Fox apoiar este estudo. Agradecemos à Fundação de Pesquisa - Flandres FWO (projeto FWO G.0666.09, companheirismo pesquisador sênior para JMT), o projeto Neuro-TARGET navegação fluvial SBO/80020, a KU Leuven (OT/08/052A e IOF-KP/07 / 001) por seu apoio. Esta pesquisa também foi apoiado em parte pelo Fundo Druwé-Eerdekens geridos pela Fundação Rei Balduíno para JMT.

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<li>Marin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson+disease+gene+LRRK2%3A+evolutionary+and+structural+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Biol.Evol%22%5BJournal%5D)">The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights.</a> Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).</li>
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<li>Gloeckner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphopeptide+Analysis+Reveals+Two+Discrete+Clusters+of+Phosphorylation+in+the+N-Terminus+and+the+Roc+Domain+of+the+Parkinson-Disease+Associated+Protein+Kinase+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2.</a> J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((14-3-3+binding+to+LRRK2+is+disrupted+by+multiple+Parkinson%27s+disease-associated+mutations+and+regulates+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430, 393-404 (2010).</li>
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<li>Taymans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+Kinase+Activity+Is+Dependent+on+LRRK2+GTP+Binding+Capacity+but+Independent+of+LRRK2+GTP+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding.</a> PLoS One. 6, 23207-23 (2011).</li>
<li>Daniëls, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+mode+of+action+of+the+LRRK2+Y1699C+pathogenic+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant.</a> J Neurochem. 116, 304-315 (2011).</li>
<li>Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+highly+purified+leucine-rich+repeat+kinases+1+and+2+demonstrates+formation+of+homodimers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers.</a> PLoS One. 7, e43472(2012).</li>
<li>Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+PINK1+and+LRRK2+in+rat+and+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurochem%22%5BJournal%5D)">Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain.</a> J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).</li>
<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+the+kinase+activity+of+LRRK2+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Lobbestael, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+detection+of+transgene+expression+in+the+brain+using+small+epitope+tags%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags.</a> BMC Biotechnol. 10, 16(2010).</li>
<li>Davies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Characterization+and+Optimization+of+Leucine+Rich+Repeat+Kinase+2+%28LRRK2%29+Monoclonal+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies.</a> Biochem J. , (2013).</li>
<li>West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease-associated+mutations+in+LRRK2+link+enhanced+GTP-binding+and+kinase+activities+to+neuronal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.Mol.Genet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity.</a> Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).</li>
<li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Sci Transl Med. 4, 164ra161(2012).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-dependent+14-3-3+binding+to+LRRK2+is+impaired+by+common+mutations+of+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease.</a> PLoS One. 6, e17153(2011).</li>
<li>Dzamko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+LRRK2+kinase+activity+leads+to+dephosphorylation+of+Ser%28910%29%2FSer%28935%29%2C+disruption+of+14-3-3+binding+and+altered+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).</li>
</ol>

Autores têm nada a revelar.

Este documento fornece um protocolo básico para ensaio geral do nível de fosforilação LRRK1 e LRRK2 em linhagens de células usando marcação metabólica com 32 P-ortofosfato. A estratégia global é simples. Afinidade proteínas marcadas LRRK são expressos em células HEK293T, que são expostos a meio contendo 32 P-ortofosfato. A 32 P-ortofosfato é assimilada pelas células depois de apenas algumas horas de incubação e todas as moléculas na célula contendo fosfatos são, assim, marcado radioactiv...

Leucina rico repetição quinases 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) são parálogos vários domínios que partilham uma organização de domínio semelhante. Ambas as proteínas de codificar uma sequência de GTPase semelhante à família Ras de GTPases (Ras de proteínas complexas, ou ROC), bem como um C-terminal do domínio ROC (CR), de forma eficaz classificando ambas as proteínas para a família de proteínas ROCO 5,6. N-terminal do domínio em tandem ROC-COR, ambas as proteínas codificar um domínio de repetição rica em leucina, bem como um domínio de anquirina semelhante, ao passo que apenas LRRK2 codifica um tatu adicional Domein 6-8. C-terminal de ROC-COR, ambas as proteínas partilham um domínio de cinase de serina-treonina, enquanto apenas LRRK2 codifica um domínio WD40 na região C-terminal 8. As funções celulares precisas de LRRK1 e LRRK2 ainda tem de ser esclarecida, no entanto LRRK1 tem sido implicada na sinalização do receptor de tirosina-quinase de 1,2, enquanto que a evidência genética aponta para um papel para LRRK2 na patogénese da doença de Parkinson 3,4. <pclasse = &quot;jove_content&quot;&gt; A fosforilação de proteínas é um mecanismo de regulação comum em células. Por exemplo, a fosforilação pode ser essencial para a activação de enzimas ou para o recrutamento de proteínas de um complexo de sinalização. A fosforilação celular de LRRK2 foi extensivamente caracterizado e mapeamento phosphosite mostrou uma maioria dos locais de fosforilação celular ocorra em um agrupamento entre a repetição de anquirina e leucina ricos domínios de repetição 9-11. Embora LRRK1 locais de fosforilação celular ainda tem de ser mapeada, evidências a partir de estudos utilizando coloração fosfoproteína de manchas de proteína LRRK1 imunoprecipitada a partir de células COS7 sugere que a proteína LRRK1 é fosforilado nas células 12. Este documento fornece um protocolo básico para ensaio geral do nível de fosforilação LRRK1 e LRRK2 em linhagens de células usando marcação metabólica com 32 P-ortofosfato. A estratégia global é simples. Afinidade marcado LRRK proteins são expressos em células HEK293T, que estão expostos a meio contendo 32 P-ortofosfato. A 32 P-ortofosfato é assimilada pelas células depois de apenas algumas horas de incubação e todas as moléculas na célula contendo fosfatos são, assim, marcado radioactivamente. O marcador de afinidade (3xflag) é então usado para isolar as proteínas LRRK de outros componentes celulares por imunoprecipitação. Os imunoprecipitados são então separados por meio de SDS-PAGE, transferido para membranas de PVDF e análise dos fosfatos incorporados é realizada por auto-radiografia (32 sinal P) e de detecção de western (sinal de proteína) das proteínas sobre as manchas.

<table><tbody><tr><td>Radionuclídeo de fósforo-32, 1 mCi, tampão dissódico fosfato em 1 ml de água</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX011001MC</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), líquido (glicose alta)</td><td>Invitrogen</td><td>11971-025</td><td>Este meio não contém fosfatos</td></tr><tr><td>Anti Flag M2 affiinty gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>Para um produto equivalente com gel de cor vermelha (útil para visualizar mais facilmente as contas), use cat. Nº F2426.</td></tr><tr><td>Filtro de borrão extra espesso</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>solução Ponceau S Sigma</td><td></td><td>P7170</td><td></td></tr></tbody></table>

metabólica rotulagem de leucina rico repita kinases 1 e 2 com radioactive fosfato

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucina repetição rica quinases 1 e 2 (e LRRK1 LRRK2) são parálogos que partilham uma organização do domínio semelhante, incluindo um domínio de serina-treonina cinase, um complexo de Ras de proteínas de domínio (ROC), um C-terminal do domínio ROC (CR), e repetições de anquirina-como no N-terminal rica em leucina e. As funções celulares precisas de LRRK1 e LRRK2 ainda tem de ser esclarecida, no entanto LRRK1 tem sido implicada na sinalização do receptor de tirosina-quinase de 1,2, enquanto LRRK2 está implicada na patogénese da doença de Parkinson 3,4. Neste relatório, apresentamos um protocolo para identificar as proteínas LRRK1 e LRRK2 em células com 32 P-ortofosfato, proporcionando assim um meio para medir os níveis globais de fosforilação destas duas proteínas nas células. Em resumo, proteínas marcadas com afinidade LRRK são expressos em células HEK293T, que estão expostos a meio contendo 32 P-ortofosfato. A 32 P-ortofosfato é assimilado pelas células depois de apenas algunshoras de incubação e todas as moléculas na célula contendo fosfatos são, assim, marcado radioactivamente. Através da etiqueta de afinidade (3xflag) as proteínas LRRK são isolados a partir de outros componentes celulares por imunoprecipitação. Os imunoprecipitados são então separados por meio de SDS-PAGE, transferido para membranas de PVDF e análise dos fosfatos incorporados é realizada por auto-radiografia (32 sinal P) e de detecção de western (sinal de proteína) das proteínas sobre as manchas. O protocolo pode ser facilmente adaptado para monitorar a fosforilação de qualquer outra proteína que pode ser expresso em células e isolado por imunoprecipitação.

<html> A fim de comparar os níveis globais de fosforilação de LRRK1 e LRRK2 nas células, 3xflag marcado LRRK1 e LRRK2 foram expressos em células HEK293T 15. As células foram cultivadas em placas de 6 poços e marcado com 32 P e analisados ​​como descrito acima no texto do protocolo. Figura 1 mostra os resultados representativos para a marcação metabólica das LRRK1 e LRRK2 em células HEK293T. Incorporação de fosfato radioactivo é observada tanto para LRRK1 e LRRK2. Após a quantificaçã...

Leucina repetição rica quinases 1 e 2 (e LRRK1 LRRK2) são proteínas de vários domínios que codificam tanto GTPase e domínios cinase e que são fosforiladas em células. Aqui, apresentamos um protocolo para rotular LRRK1 e LRRK2 em células com 32 P-ortofosfato, proporcionando assim um meio para medir seus níveis gerais de fosforilação celular.

Metabólica Rotulagem de Leucina rico Repita Kinases 1 e 2 com Radioactive Fosfato

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

O objetivo geral do experimento a seguir é marcar as proteínas de interesse com fosfatos radioativos para quantificar as proteínas e os níveis de fosforilação celular. Isso é conseguido cultivando células na presença de fósforo 32 para marcar radioativamente as modificações de fosfato das proteínas expressas nas células. Como segunda etapa, as células marcadas são lisadas e os lisados são incubados com grânulos de afinidade para imunopurificação das proteínas a serem analisadas.Em seguida, amostras de proteínas marcadas e purificadas são executadas em sulfato de dessalinização de sódio, eletroforese em gel de poliacrilamida e borradas em membranas de fluoreto de poliolina. Para detectar a incorporação de fosfato radioativo e os níveis de proteína, são obtidos resultados que mostram que as quinases repetidas ricas em leucina um e dois, abreviadas L rrk um e L rrk dois, são fosforiladas nas células em níveis comparáveis com base em auto-radiografia e imunodetecção. A principal vantagem da técnica de marcação metabólica em comparação com outras técnicas, como fosfo, immuno blotting, é que essa técnica permite a determinação dos níveis totais de fosforilação celular de proteínas, inclusive para proteínas para as quais não há anticorpos fosfofílicos disponíveis.A segunda grande vantagem desta técnica é que comparações quantitativas podem ser realizadas entre diferentes proteínas em seus níveis totais de fosforilação celular. Demonstrando o procedimento estará F gao, um técnico do nosso laboratório Para iniciar a cultura de linhagens celulares HEC 2 93 T de acordo com as condições de cultura padrão em águia modificada dcos, meio ou DMM com 8% de bezerro fetal, soro e gentamicina. Expanda a placa e expresse a bandeira tripla marcada com L rrk duas proteínas por meio de transfecção ou transdução mediada por vetor lentiviral, conforme discutido no protocolo de texto.Quando as células estiverem 80 a 100% confluentes, lave-as com dmm sem fosfato pré-aquecido. Sob um fluxo laminar, prepare um tubo de falcão com 2,1 mililitros de MS livre de fosfato por m por placa de seis poços de células a serem marcadas com fósforo. 32 ortofosfato.Prepare a bancada em que serão realizados os experimentos com radiação ionizante. O espaço de trabalho é coberto por uma esteira de derramamento sobre a qual é colocado um revestimento protetor de material absorvente. Providencie também um frasco de perspex no espaço de trabalho e coloque o tubo de meio livre de fosfato dentro.Retire o recipiente revestido de chumbo com o frasco de ortofosfato marcado com fósforo 32 da geladeira e leve-o para a bancada de radioatividade. Monitore o recipiente quanto a contaminação radioativa externa usando um contador Geiger dilua o ortofosfato marcado com fósforo 32 no tubo de dmem livre de fosfato. Adicione uma concentração de 24 micro curies por mililitro.Mantenha o tubo no frasco de perspex. Feche o recipiente com o restante do ortofosfato marcado com fósforo 32 antes de devolvê-lo à geladeira. Em seguida, remova as seis placas de poços com células a serem marcadas da incubadora e coloque na bancada de radioatividade.Retirar o sobrenadante do meio e eliminar. Em seguida, adicione dois mililitros do meio livre de fosfato contendo fósforo. 32 ortofosfato marcado por poço.Coloque as placas de cultura em uma caixa de perspex e, em seguida, monitore o recipiente quanto à contaminação radioativa externa usando um contador Geiger. Em seguida, transfira a caixa de perspex com células para uma incubadora de células eucarióticas dedicada à marcação metabólica isotópica e incube as células por uma a 20 horas. Neste ponto do protocolo, as células podem ser tratadas com composto, se desejado, conforme instruído no protocolo de texto Após o tratamento e incubação celular, remova o meio das células e descarte-o em um tubo de coleta de resíduos que é colocado no frasco de perspex.Enxágue as células duas vezes com dois mililitros de solução salina tamponada com tris gelada. Descarte a solução de enxágue no tubo de coleta de resíduos. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de tampão de lise de imunoprecipitação gelada a cada poço e colete o lisado pipetando para cima e para baixo.Para soltar todas as células lisadas, transfira o lisado para um tubo de microcentrífuga e incube no gelo pelo menos 10 minutos antes da centrifusão, conforme indicado no protocolo de texto para isolar a proteína de interesse por imunopurificação. Primeiro, transfira os tubos de microcentrífuga com lisados de centrífuga de volta para o gelo. Em seguida, pipete o sobrenadante em tubos de microcentrífuga contendo 10 microlitros de leito Volume da bandeira M duas velocidades aro.Equilibrado conforme discutido no protocolo de texto, transfira os tubos da microcentrífuga para um tubo de 50 mililitros. Depois de transferir os tubos de microcentrífuga para tubos rotulados de 50 mililitros no gelo, coloque as amostras em um dispositivo rotativo atrás de um escudo de perspex na área designada de uma câmara fria para mistura de ponta a ponta a quatro graus Celsius por uma a 20 horas após a incubação, gire para baixo a bandeira ligada à proteína M dois grânulos de aro em tubos de microcentrífuga após descartar o sobrenadante em um tubo de coleta de resíduos. Prossiga para lavar as contas conforme discutido no protocolo de texto.Em seguida, ressuspenda os grânulos lavados em 40 microlitros de tampão de carregamento SDS de amostra IP Aqueça as amostras no tampão de carregamento a 95 graus Celsius por dois minutos antes de centrifugar por um minuto a mais de 1000 vezes g para pellet os grânulos prepare o módulo de eletroforese de gel de proteína na bancada de radioatividade atrás de uma tela de perspec. Carregue as amostras em géis de página SDS de acetato de tris de três a 8% T, incluindo um marcador de peso molecular adequado para discernir tamanhos de proteínas de alto peso molecular antes de realizar a eletroforese. Após a eletroforese, remova o gel de seu invólucro de plástico e transfira para um recipiente com tampão de transferência de western blotting.Após a preparação do gel e da membrana de PVDF. Preparar a sanduíche de mata-borrão na superfície do módulo de mata-borrão semi-seco, conforme descrito no protocolo de texto. Transfira as proteínas a 15 volts por uma a duas horas após a transferência.Remova a membrana de PVDF com proteínas blotted do módulo de blotting e seque a membrana para realizar a autorradiografia. Primeiro, exponha a membrana a uma placa de fosforescência por um a cinco dias. Leia o fósforo 32 da placa de fosforescência exposta usando um scanner de fosforescência e salve a imagem como um tiff de alta resolução para detectar os níveis de proteína por meio de detecção imunológica.Reidrate as membranas mergulhando-as brevemente em metanol e, em seguida, transferindo-as para um recipiente de incubação raso com PBS. Bloqueie as membranas em PBST contendo 5% de leite. Incube os borrões com anticorpo anti LR K dois ou anticorpo Anti-Flag e processe ainda mais com etapas de lavagem apropriadas e incubação de anticorpos secundários.Após a aplicação do anticorpo, realize a detecção de quimioluminescência para confirmar os níveis relativos de proteína de LRRK dois. Finalmente, quantificando a corporação de fósforo 32 em LRK dois usando análise diamétrica conforme descrito no protocolo de texto Aqui estão os resultados representativos para a marcação metabólica de L Rrk um e L Rrk dois em células T HEC 2 93. Aqui está representado um auto radiograma representativo da incorporação de fósforo 32, bem como uma mancha ocidental representativa da detecção de L Rrk um e L Rrk dois por meio de suas etiquetas de bandeira tripla.A incorporação de fosfato radioativo é observada tanto para L rrk um quanto para L rrk dois. Após a quantificação dos níveis de fósforo, 32 normalizaram para os níveis de proteína, medidos pela análise métrica de densidade da imunodetecção com anticorpo Anti-Flag. Verificou-se que L rrk um teve um nível médio de fosforilação inferior ao L rrk dois nas condições testadas, embora a significância estatística não seja alcançada, Não se esqueça que o trabalho com radioatividade pode ser extremamente perigoso e as precauções como equipamentos de proteção muito individual e trabalho por meio de procedimentos fornecidos pelo departamento de segurança de sua instituição devem sempre ser tomadas através da execução deste protocolo.

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Biologia

Leucina Quinase Repita Rico 2 é uma quinase de vários domínios de grande porte, mutações em que são a causa genética mais comum da doença de Parkinson. Análise da atividade da proteína quinase tem provado ser uma ferramenta crucial na compreensão da biologia e disfunção desta proteína. Neste...

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13 C-isótopo rotulagem é uma técnica útil para determinar o metabolismo da célula central para vários tipos de microorganismos. Depois que as células foram cultivadas com um substrato específico rotulados, GC-MS medição pode revelar vias metabólicas funcionais com base em padrões de rotulagem única no proteinogénicos aminoácidos.

Confirmação via metabólica e descoberta através 13 C-rotulagem de proteinogénicos Aminoácidos

Fosfoinositídeos estão sinalizando lipídios, cuja abundância relativa muda rapidamente em resposta a vários estímulos. Este artigo descreve um método para medir a abundância de fosfoinositídeos por meio de rotulagem metabolicamente células com 3 H- mio-inositol, seguido por extracção e desacilação. Extraídos glicero-inositides são então separados por cromatografia líquida de alto desempenho e quantificadas por cintilação fluxo.

Radiomarcação e quantificação dos níveis celulares de Fosfoinositídeos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado Fluxo de Cintilação

Descrevemos aqui um método para identificar fosforilações múltiplas de uma proteína intrinsecamente desordenada por Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), usando a proteína Tau como estudo de caso. A Tau recombinante é isotopicamente enriquecida e modificada in vitro por uma quinase antes da aquisição e análise dos dados.

Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para a identificação de múltiplas fosfolarização de intrinsecamente desordenados Proteínas

As cinases de proteínas são altamente evoluídas sinalizando enzimas e andaimes que são críticos para a transdução de sinal inter e intracelular. Nós apresentamos um protocolo para medir a atividade de quinase através do uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- 32 P] ATP), um método confiável para auxiliar na elucidação da regulação da sinalização celular.

Ensaio da Actividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado

Os ensaios de competição de péptidos são amplamente utilizados numa variedade de experiências moleculares e imunológicas. Este artigo descreve um método detalhado para um ensaio de quinase competitiva com oligopéptido in vitro e os procedimentos de validação associados, que podem ser úteis para encontrar locais de fosforilação específicos.

Ensaio de Competição Oligopeptídica para Determinação de Sítio de Fosforilação

O presente estudo descreve um método simples de detectar níveis endógenos de fosforilação de Rab10 pela rica em leucina repetição quinase 2.

Deteção de fosforilação Rab10 pela atividade LRRK2 utilizando SDS-PAGE com um Tag de ligação de fosfato

Nós caracterizamos uma proteína nova da quinase usando aproximações bioquímicas robustas: análise ocidental do borrão com um anticorpo específico dedicado em linhas e em tecidos diferentes da pilha, interações por experimentos do coimmunoprecipitação, atividade da quinase detectada por ocidental Blot usando um anticorpo fosho-específico e por γ [32P] rotulagem ATP.

Caracterização no nível molecular usando abordagens bioquímicas robustas de uma nova proteína quinase

Este protocolo descreve um ensaio nãoradioativo para medir a atividade de quinase de quinases (PNKs) em pequenos substratos de DNA e RNA.

Ensaio nãoradioativo para medir a fosforilação de polinucleotídeos de substratos de pequenos nucleotídeos

Este vídeo mostra as técnicas para a rotulagem de células-tronco embrionárias e células-tronco mesenquimais com corantes fluorescentes. Esta técnica pode ser usada para um monitoramento in vivo de células-tronco transplantadas com imagens ópticas e para as correlações histopatológico com microscopia de fluorescência.

Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

Aprenda a rotular metabolicamente as quinases LRRK1 e LRRK2 com fosfato radioativo para quantificar níveis celulares de fosforilação total. Este método utiliza fósforo-32 em células HEK293T e permite análises sem anticorpos fosfo-específicos.

Metabólica Rotulagem de Leucina rico Repita Kinases 1 e 2 com Radioactive Fosfato

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