Visualização de Desenvolvimento Craniofacial nas SOX10: Kaede Transgênicos Zebrafish Linha Usando Time-lapse microscopia confocal

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar uma gravação de lapso de tempo ao vivo da migração de células da crista neural para mostrar a formação de estruturas faciais cranianas em desenvolvimento. Isso é feito primeiro montando um peixe-zebra SOX 10 KD transgênico anestesiado em agarose para minimizar o movimento durante o experimento. Em seguida, sob um microscópio confocal, a fotoativação UV é realizada para converter KD de verde para vermelho nas células da crista neural.

Em seguida, concentrando-se nas células da crista neural convertidas na foto. Um Zack é gerado da estrutura em desenvolvimento antes que um vídeo de lapso de tempo seja gravado. São obtidos resultados que mostram o desenvolvimento de células da crista neural craniana no palato primário do peixe-zebra em um embrião transgênico SOX 10 KD zebrafish.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como imagens estáticas, é que processos complexos de desenvolvimento, como a migração celular, podem ser visualizados em tempo real. Isso torna os resultados mais acessíveis à comunidade científica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia do desenvolvimento, como como as estruturas derivadas de células da crista neuro se formam e como os genes PTO influenciam seu desenvolvimento.

Para se preparar para a montagem de embriões, use um frasco de 125 mililitros para misturar E três água com baixo ponto de fusão aeros microondas para dissolver a solução. Em seguida, adicione trica e coloque o frasco em banho-maria a 50 graus Celsius para se aquecer e aninhar os laços de embriões de peixe-zebra KD transgênicos brilhantemente fluorescentes 60 horas após a fertilização. Em seguida, transfira cada um deles para uma lâmina de câmara com papel de seda.

Absorva o excesso de água E três e use a solução de agarro para cobrir o embrião. Use uma ponta de micro carregador para posicionar o embrião perfeitamente dorsal, garantindo que os embriões fiquem completamente submersos no agarro. Após o agarro endurecer, use E três 0,015% trica para preencher a lâmina da câmara para realizar a conversão da foto.

Comece usando uma objetiva de imersão em ar de 20 x para focar no embrião. Em seguida, pressione o botão de luz L 100 no microscópio e selecione os canais no software. Abra os ícones.

Visualize os controles de aquisição Uma configuração e clique no botão de configuração confocal. Em seguida, clique em auto e selecione DPI 4 88 e 561.9 para os canais 1, 2, 3, respectivamente, antes de fechar a janela novamente. Em seguida, desligue os canais um e três antes de clicar no botão remover intertravamento e pressionar o botão de varredura começando em um quadro por segundo e HV 200.

Comece a se concentrar nas células de interesse. Aumentando gradualmente os quadros por segundo para um por 32 e reduzindo a tensão para 100 a 120, dependendo do ruído de fundo. Quando o embrião estiver em foco, pegue a borda verde na borda direita da tela e encolha-a para caber na área a ser convertida antes de clicar com o botão direito do mouse.

Altere os quadros por segundo para um e o HV para 200 e pressione scan. Uma imagem ampliada da área de conversão de fotos agora estará visível. Próxima foto.

Converta células ligando o canal um por cinco a 60 segundos até que o sinal KD verde esteja quase ausente. Em seguida, desligue o canal dappy. Ative os canais dois e três para retornar ao zoom original.

Clique com o botão direito do mouse na janela de zoom e escolha retornar ao tamanho original para verificar se as células desejadas foram convertidas adequadamente na foto. Defina os limites do Zack escolhendo o ícone Capture Z Series na barra de menus. Ajuste as tabelas de pesquisa ou uts para configurar um lapso de tempo.

Escolha a caixa A one simple GUI e marque as seguintes configurações. Um por 32 quadros por segundo. Tamanho 1024 e média de quatro ou oito x, dependendo do número de pilhas Z que devem ser tomadas em um loop.

Em seguida, vá para exibir controles de aquisição Aquisição de sequência ND e defina o período de tempo. Em seguida, clique em contínuo e, em seguida, em Zack. Defina as bordas conforme demonstrado anteriormente.

Inicie o filme, adicione três soluções de 0,015% trica à câmara, deslize ao longo do dia e encha a câmara completamente para imagens noturnas. Quando a imagem estiver concluída, crie um vídeo de alta qualidade a partir do arquivo de imagem clicando em mostrar projeção de intensidade máxima. Em seguida, clique com o botão direito do mouse na imagem e crie um novo documento.

Exclua quadros desnecessários e ajuste os Lúmulos. Neste filme que mostra o Palato Genesis no peixe-zebra, a linha transgênica SOX 10 K é usada para seguir as células da crista neural craniana à medida que se desenvolvem para formar o palato primário. As células mais anteriores do palato em formação são fotoconvertidas de verde para vermelho 60 horas após a fertilização.

Quando os trabéculos emparelhados se encontram para formar o palato primário, essas células são seguidas até atingirem seu destino final. Este filme demonstra o desenvolvimento perturbado do palato levando à formação de uma fenda orofacial, knockdown mediado por morino da mancha. Um gene de uma libra envolvido na fenda facial oblíqua é usado como exemplo.

Aos 60 HPF, a fotoconversão unilateral das células da placa etmoidal mais anterior mostra um derrame de falha entre as células da placa etmoidal mediana e lateral. Esse defeito se assemelha à patogênese do desenvolvimento da fenda facial oblíqua em humanos, onde ocorre falha no derrame entre o processo nasal lateral e a proeminência maxilar. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do desenvolvimento explorarem o desenvolvimento de células neurocristas em peixes-zebra.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar esse método para capturar seu processo de desenvolvimento de interesse.